基于系统药理学的柴胡防治非酒精性脂肪肝作用机制研究

Study of the mechanism of Bupleuri Radix in the preventing and treatment of non-alcoholic fatty liver based on systemic pharmacology

摘要

目的 探究柴胡对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的防治作用及机制。 方法 借助TCMSP数据库及查阅文献获取柴胡化学成分及其作用靶点，并利用Gene Cards、OMIM等数据库获取NAFLD疾病靶点。筛选二者间共有靶点进行蛋白质互作、KEGG、GO富集与分子对接分析，以挖掘柴胡防治NAFLD潜在活性成分及作用机制。最后，通过高脂饲料复合高糖饮水建立NAFLD小鼠模型，验证柴胡治疗效果及作用机制。 结果 柴胡可通过18个潜在活性成分直接作用于99个靶点来防治NAFLD，其中槲皮素、山奈酚、异鼠李素为其核心活性成分，AKT1、TNF、ESR1为其核心作用靶点。富集分析表明，柴胡可能通过干预PI3K-AKT、MAPK及TNF等信号通路来防治NAFLD。动物试验结果表明，柴胡治疗能显著降低NAFLD小鼠血清AST、ALT水平，改善NAFLD小鼠肝脏脂肪变性，并回调PI3K-AKT通路中AKT和MAPK通路中SREBP-1在肝脏组织中的表达。 结论 柴胡可有效的防治NAFLD，其作用机制与调控PI3K-AKT和MAPK信号通路密切相关。

Abstract

Objective To investigate the prevention and treatment effect and mechanism of Bupleurum Bupleuri Radix on non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Method Chemical constituents and targets of Bupleuri Radix were obtained from TCMSP database and literature review，and disease targets of NAFLD were obtained from Gene Cards and OMIM databases.Protein interaction analysis，KEGG and GO enrichment analysis and molecular docking were performed to screen common targets between Bupleuri Radix and NAFLD，so as to explore potential active components and mechanism of action of Bupleuri Radix against NAFLD.Finally，high fat diet combined with high sugar drinking water was used to establish NAFLD mouse model to verify the therapeutic effect and mechanism of Bupleuri Radix. Result Bupleuri Radix could prevent and treat NAFLD by directly regulating 99 targets through 18 potential active components，of which quercetin，kaempferol and isorhamnetin were the core active components，and AKT1，TNF and ESR1 were the core targets.Enrichment analysis showed that Bupleuri Radix could prevent and treat NAFLD mainly by interfering with PI3K-AKT，MAPK and TNF signaling pathways.The results of animal experiments showed that Bupleuri Radix could reduce the serum AST and ALT levels in NAFLD mice and improve the liver steatosis in NAFLD mice. Conclusion Bupleuri Radix can effectively prevent and control NAFLD，and its mechanism is closely related to the regulation of PI3K-AKT and MAPK signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

柴胡 / 系统药理学 / 非酒精性脂肪肝 / 分子对接 / PI3K-AKT信号通路

Key words

Bupleurum chinenis / systemic pharmacology / non-alcoholic fatty liver / molecular docking / PI3K-AKT signaling pathway

Author summay

祝亚梅，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的，以肝细胞脂肪变性、脂肪蓄积以及胰岛素抵抗为特征的一种肝脏疾病^［1］。随着肥胖和糖尿病的高发趋势，NAFLD已成为我国常见的慢性肝病之一，其发病率呈逐年上升趋势。临床上主要采用噻唑烷二酮类药物（如吡格列酮）、他汀类药物（如阿托伐他汀）、维生素E等来治疗NAFLD^［2-3］。这些药物虽然能通过减轻胰岛素抵抗、抗氧化、改善肝脏脂质代谢等起到一定的治疗效果，但长期用药存在诸多不良反应，如：增加前列腺癌和胰腺癌发生的风险、增加患者脑出血的风险、增加糖异常代谢的风险等^［4-5］。因此，需进一步开发更加安全有效的NAFLD治疗药物。

柴胡（Bupleurum chinense）为伞形科多年生草本植物，以干燥根入药，其性微寒、味苦，有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效^［6］。柴胡化学成分复杂，主要由柴胡皂苷、挥发油（丁香酚等）、多糖等组成^［6］。现代药理学研究表明，柴胡具有解热、镇痛、抗炎、保肝、增强免疫功效等药理作用^［7］，可用于治疗肝损伤、肝硬化、原发性肝癌等^［8-9］。目前，在治疗非酒精性脂肪肝的复方中药中，柴胡也是使用频次较高的药物^［10］。近年来，虽已有与柴胡保肝作用的相关研究，但多以柴胡中单一活性成分或含柴胡的复方中药为研究对象，如：有曼等^［11］通过LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型探究了柴胡皂苷b2对小鼠急性肝损伤炎症和能量代谢的影响，证实柴胡皂苷b2对LPS诱导的小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用；何顺勇等^［12］通过比较NAFLD临床患者柴胡疏肝散治疗60 d前后血清中TC、TG、ALT、AST等指标，证明柴胡疏肝散可有效调节非酒精性脂肪肝患者脂质代谢和肝功能，减轻FGF21抵抗，改善机体对胰岛素的敏感性。目前，针对单味药柴胡是否可用于防治NAFLD，暂无相关报道。

系统药理学分析技术是通过研究药物化学成分对机体病理状态下信号传导网络的调节作用与影响，从整体角度揭示药物治疗疾病的作用机制，与中药治疗疾病的“整体观念”不谋而合^［13］。近年来，该技术在中药研究中已有广泛应用，如：张玉如等^［14］借助系统药理学技术研究了水飞蓟治疗肺癌的作用机制，发现水飞蓟主要通过调控凋亡相关通路发挥抗肿瘤作用。因此，系统药理学研究技术可为中药“多成分、多途径、多靶点”作用机制的研究提供有效的研究方法。

鉴于此，本研究拟采用系统药理学研究技术，通过系统药理学对柴胡治疗非酒精性脂肪肝的潜在活性成分及其作用机制进行预测，并结合动物试验，以期为柴胡深度开发和临床应用提供参考依据，为非酒精性脂肪肝新型治疗药物研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验动物

6周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠60只，体质量18~23 g，购自中国科学院兰州兽医研究所，饲养于22~26 ℃环境中。动物试验经甘肃农业大学伦理委员会批准。

1.2 材料

柴胡，购于兰州黄河药材市场；60%脂肪供能高脂饲料、SPF级试验用鼠维持饲料（江苏省协同医药生物工程有限责任公司，货号XTHF60、SWC9101）；果糖、蔗糖、盐酸二甲双胍（北京索莱宝科技有限公司，货号F8100、S8271、D9351）；AST、ALT测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量试剂盒（上海雅酶生物医药科技有限公司，货号ZJ102）；AKT单克隆抗体、CoraLite488偶联山羊抗小鼠IgG（武汉三鹰生物科技有限公司，货号60203-2-Ig、SA00013-1）；SREBP-1单克隆抗体（圣克鲁斯生物技术公司，货号sc-13551）；抗荧光衰减封片剂（含DAPI）（北京索莱宝科技有限公司，货号S2110）。

1.3 仪器

旋涡混合仪（中国上海青浦泸西仪器）；数显恒温水浴锅（中国国华电器）；微量高速冷冻离心机（自株式会社日立制作所）；多功能酶标测定仪（美国Molecular Devices公司）；荧光显微镜（日本Olympus公司）；数字切片扫描仪（山东斯瑞缔医疗科技有限公司）。

1.4 柴胡潜在活性成分及其相关靶点筛选

通过中药系统药理学数据库TCMSP及查阅文献搜集柴胡的化学成分，根据口服利用度（oralbioavail ability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18、药物对小肠上皮细胞的穿透性（Caco^-2）≥-0.4的3个ADME参数进行活性成分的初步筛选，收集其作用靶点。借助Uniprot蛋白质数据库将潜在活性成分作用靶点蛋白名称进行规范化处理，将获得的柴胡潜在活性成分及作用靶点建立数据表，导入Cytoscape中构建“柴胡潜在活性成分-疾病靶点”的可视化网络。

1.5 非酒精性脂肪肝疾病相关靶点筛选

以“Nonalcoholic fatty liver disease”为关键词检索GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM数据库（http：//www.omim.org），获取疾病靶点，再进入DRUGBANK数据库（https：//www.drugbank.ca）寻找治疗非酒精性脂肪肝的临床药物的作用靶点进行补充，删除重复的靶点，获得NAFLD的疾病靶点。

1.6 柴胡治疗NAFLD的网络构建及分析

将筛选出的柴胡活性成分靶点及非酒精性脂肪肝疾病靶点绘制韦恩图，取交集靶点，即为柴胡治疗NAFLD的潜在作用靶点。再将筛选后的柴胡潜在活性成分及共有靶点导入Cytoscape软件构建“柴胡-潜在活性成分-靶点-疾病”网络。

1.7 蛋白-蛋白互作网络构建

将柴胡治疗NAFLD的潜在作用靶点输入至Cytoscape软件中，构建蛋白互作PPI网络，并导出PPI综合评分（combinedscore）数据，并进行网络拓扑分析，利用网络中各蛋白靶点的介度（betweenness centrality）、接近中心性（closenesss centrality）、程度中心性（degree centrality）、特征向量中心性（eigenvector centrality）、网络中心性（network centrality）等拓扑参数筛选出柴胡治疗NAFLD的核心靶点。

1.8 GO功能富集和KEGG通路富集分析

将筛选出的柴胡治疗NAFLD的核心靶点输入Cytoscape软件中进行KEGG通路富集和GO功能富集，保存数据结果并对其进行可视化。

1.9 分子对接验证

将筛选出的核心成分及核心靶点的3D结构运用PyMOL软件对蛋白质进行去水、加氢等操作，利用open babel软件将化合物及靶蛋白格式进行转换，最后采用AutoDock Vina进行对接，并借助PyMol软件将对接结果进行可视化。

1.10 动物试验验证

1.10.1 柴胡水提液制备

称取适量柴胡生药饮片，先加入10倍蒸馏水浸泡30 min后大火煎煮至沸腾，小火煎煮1 h，过滤收集滤液后，再加入8倍蒸馏水煎煮30 min，将2次滤液混合后，加热浓缩至每毫升药液含生药1 g。

1.10.2 造模、给药及采样

将小鼠按体质量随机分为空白对照组、模型组、二甲双胍对照组、柴胡高、中、低剂量组，每组10只。适应性喂养7 d后，NC组饲喂SPF级试验用鼠维持饲料与正常饮用水，其余5组饲喂60%脂肪供能高脂饲料复合高糖饮水（高糖配方：55%果糖、45%蔗糖^［15］）。每两天称体质量1次，饲喂至第6周开始灌胃给药，空白对照与模型组灌胃生理盐水，二甲双胍对照组以150 mg/kg剂量灌胃二甲双胍稀释液，柴胡高、中、低剂量组分别以3 010 、1 505、752.5 mg/kg剂量灌胃柴胡水提稀释液，5 d为一疗程，给药一疗程后停药3 d再次给药一疗程。最后一次给药24 h后，称小鼠体质量，眼丛静脉采血后脱颈处死，取出肝脏组织部分于4%多聚甲醛溶液中固定，部分-40 ℃冻存备用，血液样本在3 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，分离血清备用。

1.10.3 小鼠肝脏组织病理学观察

将固定好的肝脏流水冲洗24 h，放入自动脱水机，石蜡包埋后切片进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织病理变化并分析。

1.10.4 血液中AST、ALT活性测定

取小鼠血清按照ALT和AST测定试剂盒说明书测定小鼠血液中的ALT和AST活性。

1.10.5 肝脏组织中AKT、SERBP-1C免疫荧光检测

将肝脏石蜡切片脱蜡至水后使用柠檬酸修复液进行抗原修复，5%BSA封闭1 h后，滴加一抗（AKT、SERBP-1C抗体），于4 ℃避光过夜孵育，洗涤后滴加荧光二抗孵育，再洗涤后用抗荧光衰减封片剂封片，于荧光显微镜下观察并拍照。

1.10.6 统计学分析

试验数据应用SPSS 26.0软件分析，采用单因素方差分析，P<0.05表明具有统计学意义，使用Graphpad Prism 9.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 柴胡潜在活性成分筛选及其作用靶点

通过TCMSP数据库及查阅文献，统计得到柴胡化学成分349个，经筛选得到18个潜在活性成分（表1），可作用于275个靶点（图1）。

2.2 非酒精性脂肪性肝病相关靶点获得

以“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词检索Gene Cards数据库得到1 119个疾病靶点，OMIM数据库得到497个，DRUG BANK数据库得到5个，去除重复靶点共得到非酒精性脂肪肝疾病靶点1 603个。

3.3 柴胡治疗NAFLD的网络构建及分析

将柴胡潜在活性成分作用靶点及NAFLD疾病靶点进行Venn分析，结果显示存在99个共有靶点（图2），说明柴胡可通过直接作用于这99个靶点治疗NAFLD。进一步，通过Cytoscape构建“柴胡-潜在活性成分-靶点-疾病”网络图，并对其进行网络拓扑分析，根据Degree值排序，将前3名的核心活性成分作为柴胡防治NAFLD的核心活性成分，即：槲皮素、山奈酚、异鼠李素（图3）。

2.4 蛋白-蛋白互作分析

将99个共有靶点进行PPI互作分析，利用Cytoscape计算各个蛋白节点的特征参数，首先筛选出Degree≥56的靶点蛋白作为柴胡防治NAFLD的重要靶点，在此基础上筛选出Degree≥94、BC≥356.253 6、CC≥0.496 368、EC≥0.015 522、LAC≥12.153 85、NC≥13.436 74的靶点蛋白作为柴胡防治NAFLD的核心靶点，共计292个，其中289个为间接作用靶点，3个为直接作用靶点，分别为AKT1、ESR1、TNF。

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

对292个核心靶点进行GO功能富集分析，结果显示，柴胡主要通过调节核糖核蛋白复合物、胞内含蛋白复合物、染色体区域、转录调节复合物等细胞组分（CC），进而影响激酶结合、转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合、泛素蛋白连接酶结合等分子功能（MF），最终干预细胞对DNA损伤刺激的反应、蛋白质分解代谢过程、细胞周期过程的调节等生物过程来发挥治疗NAFLD的作用（图4）。

进一步的KEGG信号通路富集分析表明，柴胡主要通过干预MAPK信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、NF-KappaB信号通路、细胞周期、细胞衰老等来防治NAFLD（图4）。

2.6 分子对接验证

将2.3中得到的柴胡的3个核心活性成分与2.4中得到的3个直接作用靶点进行分子对接，受体蛋白（AKT1、TNF、ESR1）相对应的PDBID分别为6CCY、2AZ5、1XQC。当结合能小于0时，表示配体与受体可自发结合，且配体与受体结合时能量越低，构象越稳定，两者发生作用的可能性越大。分子对接结果表明（图6），直接作用靶点与核心活性成分均可通过氢键结合，且结合能均≤-1.2 kcal/mol（表2），说明二者可形成稳定的结合，进一步证实了上述分析结果的准确性。

2.7 动物试验

2.7.1 柴胡对NAFLD小鼠体质量的影响

由图7可知，高脂饲料复合高糖饮水饲喂1周后，各组小鼠体质量较空白对照组明显增长（P<0.05）；在第5周灌胃不同剂量柴胡水提液治疗后，与模型组相比各柴胡给药组小鼠体质量显著降低（P<0.05），说明柴胡干预可显著地抑制高糖高脂饮食造成的体质量增加。

2.7.2 柴胡对NAFLD小鼠肝脏组织病理学的影响

显微镜下观察可见，空白对照组小鼠肝脏结构正常，细胞排列整齐，无明显病理变化；与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏出现大小不等的脂肪空泡；与模型组相比，各个给药组小鼠肝脏病理变化明显改善，脂肪空泡明显减少（图8）。结合2.7.1中小鼠体质量变化结果，NAFLD模型成功建立，且柴胡对NAFLD小鼠具有显著的治疗效果。

2.7.3 柴胡对NAFLD小鼠血液生化水平的影响

与空白对照组相比，模型组小鼠ALT、AST水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，在给予不同剂量柴胡治疗后，各组小鼠血液中ALT、AST水平显著降低（P<0.05），结果表明，造模后模型组小鼠肝脏肝损伤显著，柴胡治疗具有显著的保肝作用（图9）。

2.7.4 柴胡对NAFLD小鼠肝脏中Akt、SREBP-1表达的影响

为验证系统药理学分析结果，进一步对PI3K-AKT通路中关键蛋白AKT进行免疫荧光染色，结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中AKT表达量显著降低；与模型组相比，各个给药组中AKT表达量明显升高（图10）。此外，对MAPK通路中关键蛋白SREBP-1c进行免疫荧光染色结果显示，与空白对照组相比，模型组小鼠肝脏中SREBP-1c蛋白表达量明显增强，与模型组相比，各治疗组均可降低其表达水平（图10）。结果说明，造模后NAFLD小鼠肝脏中PI3K-AKT通路受到抑制，MAPK信号通路异常亢进，柴胡治疗可通过回调这些关键蛋白表达，进而干预PI3K-AKT，MAPK信号通路，以此来发挥治疗效果。

3 讨论

非酒精性脂肪肝病以过量的脂质堆积在肝脏为其根本特征，发病机理从“二次打击”学说演变为“多次打击学说”，其病理过程遵循“三击”过程，即脂肪变性、脂肪毒性和炎症^［16］。由于NAFLD的发病机制十分复杂，这也使得单一靶点的治疗药物应对NAFLD难以有较好的疗效。因此，寻求多靶点、多通路的治疗方法是防治NAFLD的必然趋势，这与中药多靶点、多通路的作用特点不谋而合。近年来，中药治疗非酒精性脂肪肝显示出独特的优势，其药理作用机制也是近年来研究的热点方向^［17］。含柴胡的中药方剂具有较好的保肝护肝作用，常用于临床上治疗代谢相关的脂肪性肝病^［18］，但其中柴胡是否可用于防治NAFLD尚不清楚。

本研究经过系统药理学分析，并结合分子对接技术筛选，认为柴胡防治NAFLD的核心成分为槲皮素、山柰酚、异鼠李素。已有研究报道，槲皮素为柴胡治疗NAFLD的主要有效成分之一，它可通过调控脂质代谢相关基因、减少脂质合成，减少肝脏脂质蓄积，改善肝细胞脂肪变性，同时改善胰岛素抵抗^［19］。此外，也有研究表明，山柰酚可改善高脂饮食引发的血脂紊乱，并能干预脂肪肝的形成^［20］。也有研究报道，异鼠李素可通过抑制胶原蛋白的形成、抗肝纤维化和抑制PPAR γ的表达，来防治肝脏脂肪变性^{［21，24］}。这些研究均认为槲皮素、山柰酚、异鼠李素可用于治疗NAFLD。

由KEGG通路富集分析表明，柴胡防治NAFLD涉及多个靶点和信号通路，如PI3K-AKT、MAPK及TNF信号通路等，这表明柴胡具有多途径的作用机制，同时也契合了NAFLD具有多重病因的病理特点。研究显示，AKT调控的通路是人类癌症中最常被激活的信号通路^［22］。磷脂酰肌醇激酶（PI3K-AKT）通路是肝脏胰岛素信号传导中的主要通路，其通过调控胰岛素水平从而参与体内的糖脂代谢。研究表明，各种因素导致的PI3K-AKT信号传导抑制，均可引起胰岛素抵抗，以促进NAFLD的发生与发展^［23］。因此，激活PI3K-AKT信号传导通路可改善胰岛素抵抗，进而缓解NAFLD ^［23］。试验结果显示，与空白对照组相比，AKT在模型组小鼠肝脏中表达量降低，这说明造模后模型组小鼠肝脏中PI3K-AKT信号传导通路受到抑制，这与上述报道相一致^［23］。与模型组相比较，各治疗组均可回调AKT在肝脏中的表达，这说明柴胡可通过激活PI3K-AKT通路而发挥治疗作用。系统药理学分析显示，槲皮素与异鼠李素均为柴胡防治NAFLD的潜在核心活性成分，研究资料显示，二者均可激活PI3K-AKT信号传导通路^［25-26］，故推测其在柴胡激活PI3K-AKT信号传导通路中发挥重要作用。本研究分子对接结果也从侧面证实了这一点，然而其具体作用机制还有待进一步研究。

此外，大量研究资料表明MAPK信号通路涉及细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、坏死等多种生理病理过程，其中的ERK1/2子信号通路可以通过调节固醇调控元件结合蛋白-1（SREBR-1c）的表达来调节脂肪酸合酶的表达，从而调控脂肪酸的合成、胰岛素信号的传导和肝脏脂代谢，且SREBR-1c的表达量与NAFLD的严重程度呈正相关^［21］。本研究结果表明，模型组小鼠肝脏中SREBR-1c的蛋白表达明显高于其他组，在给予柴胡治疗后小鼠肝脏中SREBR-1c的蛋白表达降低，说明柴胡可通过抑制MAPK信号通路来发挥治疗效果。这也与本研究中系统药理学分析结果相符，当然，其具体调控机制仍需深入研究。

通过上述分析不难看出，PI3K-Akt和MAPK信号通路均与胰岛素抵抗的形成密切相关。研究表明，胰岛素抵抗在NAFLD发生发展过程中具有重要的作用^［27］。胰岛素抵抗可引起肝细胞脂肪蓄积，炎症因子活化失衡，进而触发氧化应激及脂质氧化，引发肝炎症、坏死及纤维化等^［29］，也可通过促进周围组织脂肪分解和形成高胰岛素血症导致NAFLD的发生^{［21，28］}。刘晓春等^［30］以柴胡皂苷A对高脂饲料法构建的NAFLD小鼠模型进行治疗，证明柴胡皂苷A能改善胰岛素抵抗从而抑制NAFLD小鼠肝脂肪变性。本研究结果显示，柴胡对PI3K-Akt和MAPK信号通路均有调控作用，因此，我们推测柴胡还可通过干预PI3K-Akt和MAPK信号通路来间接地调控胰岛素抵抗过程，进而发挥治疗效果。

本研究应用系统药理学方法对柴胡防治NAFLD的调控机制进行了挖掘，并借助NAFLD模型，通过验证AKT、SREBP-1C在肝脏中的表达变化证实了柴胡通过干预PI3K-AKT和MAPK信号通路防治NAFLD的作用机制。本研究可为柴胡临床应用提供科学依据，也可为其作用机制的研究提供新方向。

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基金资助

甘肃省高等学校创新基金项目(2021B-135)

甘肃省青年科技基金计划项目(21JR7RA846)

甘肃农业大学公招博士科研启动项目(GAU-KYQD-2020-4)

财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系项目(CARS-37)