磁共振成像在体可视化检测肾脏5-羟色胺的动态变化及药物性急性肾损伤早期无创诊断

In vivo visualization of renal serotonin dynamics using magnetic resonance imaging for early non-invasive diagnosis of drug-induced acute kidney injury

摘要

目的 磁共振成像（MRI）在体检测肾脏5-羟色胺受体的动态变化，为药物性急性肾损伤早期诊断提供无创影像方法。 方法 以5-羟色胺基团为基础，构建具有5-羟色胺受体靶向性的磁共振对比剂（HT-Gd），通过检测小鼠肾脏部位T1加权磁共振成像（T1WI）信号，探索药物性肾损伤早期MRI检测方法。 结果 体外细胞内吞试验发现，经顺铂预处理12 h后，肾小管上皮细胞（HK-2）对HT-Gd的摄取是36.8 pg/cell，而未经顺铂处理细胞对HT-Gd摄取量仅为14.7 pg/cell。在体内磁共振成像研究中发现，HT-Gd可以增强顺铂给药24 h小鼠的肾脏T1WI信噪比至40.5%，约为未经顺铂处理组小鼠的2倍（SNR=20.2%）。 结论 HT-Gd可视化检测肾脏部位的5-羟色胺受体，实现了对顺铂诱导急性肾损伤的早期诊断，为药物性急性肾损伤早期诊疗研究提供了新的参考方法。

Abstract

Objective Magnetic resonance imaging （MRI） was employed to monitor the real-time alterations in renal serotonin receptors in vivo， presenting a non-invasive imaging technique for the prompt identification of drug-induced acute kidney injury. Method A magnetic resonance contrast agent （HT-Gd） engineered with serotonin receptor-targeting capabilities was developed based on the serotonin group. By analyzing the T1-weighted magnetic resonance imaging （T1WI） signals of serotonin receptors in mouse kidneys， an early MRI detection approach was investigated for the identification of drug-induced kidney injury. Result In vitro endocytosis experiments revealed that the uptake of HT-Gd by renal tubular epithelial cells （HK-2） was 36.8 pg/cell following a 12-hour cisplatin pretreatment， contrasting with a mere 14.7 pg/cell uptake in cells devoid of cisplatin treatment. In vivo magnetic resonance imaging studies demonstrated that HT-Gd heightened the renal T1WI signal-to-noise ratio to 40.5% in mice subjected to cisplatin treatment for 24 hours， approximately double that of mice not treated with cisplatin （SNR=20.2%）. Conclusion The visualization of serotonin receptors in the kidney using HT-Gd has enabled the early diagnosis of cisplatin-induced acute kidney injury， offering a novel reference technique for the early diagnosis and treatment exploration of drug-induced acute kidney injury.

Graphical abstract

关键词

5-羟色胺受体 / 药物性急性肾损伤 / 磁共振成像 / 早期诊断

Key words

serotonin receptors / drug-induced AKI / magnetic resonance imaging / early detection

Author summay

汪雁飞，八级职员，硕士。E-mail： [e-mail]

肾脏作为清除特定代谢废物和毒素的主要场所，是人体重要的器官之一。由于肾脏长期和无保护状态下暴露于高浓度的代谢产物、药物及外源性物质中，极易受损，引起泌尿系统疾病，尤其是急性肾损伤（AKI）。AKI是一种临床综合征，其特点是由各种病因引起的肾功能迅速下降，如肾毒素、糖尿病、药物、缺血/再灌注等^［1-4］。值得注意的是，由于药物的广泛使用，肾毒性，如顺铂（DDP）诱导的AKI，占AKI临床病例的20%~30%。临床发现，早期检测肾损伤的发生和进展对于指导及时采取补救措施，促进肾脏恢复和预防严重并发症、肾移植甚至死亡的发生至关重要^［5-7］。目前，肾功能的临床评估方案主要是通过测量血清肌酐（sCr）和血尿素氮（BUN）。然而，sCr和BUN在肾小球滤过率（GFR）下降到50%时仍处于正常范围内，只能反映肾损伤晚期的肾功能^［8-10］。虽然肾活检可以早期检测AKI的分子信息，但该程序复杂且存在潜在风险，包括血尿、血管栓塞和感染，可能导致严重的二次损伤，因此不适用于高危患者的肾脏监测及随访^［11-13］。因此，开发非侵入性方法及时检测肾脏分子信息的变化对于早期诊断药物性AKI具有重要的临床意义，但也面临着巨大的挑战。

磁共振成像（MRI）技术具有非电离辐射、无限穿透深度和高空间分辨率等特点，已广泛用于临床中各类疾病的诊断。研究人员不断突破现有技术瓶颈，利用T1WI，DTI，IVIM-DWI，BLOD 等MRI技术在内分别实时监测肾脏中造影剂滤过，水分子运动和血氧信息，致力于建立诊断AKI 的影像学方法^［14-17］。遗憾的是，临床现有的MRI方法只能诊断肾损伤晚期肾脏组织和解剖结构的变化，无法获取AKI早期肾脏损伤相关分子含量和动态分布信息，导致AKI早期MRI诊断研究仍是一项巨大的挑战^［18］。

研究发现，5-羟色胺系统对于肾小管上皮细胞（PETCs）维持胞内氧化平衡具有重要作用^［19-20］。5-羟色胺受体的过表达是药物性AKI早期的关键标志物，对于AKI的发生和发展具有重要意义。当PTECs摄入肾毒性药物后，其表面会过度表达5-羟色胺受体，并从血液或组织液中摄取大量的5-羟色胺进入线粒体，产生过量的活性氧物质，引发PTECs氧化损伤。因此，本文提出利用5-羟色胺与DOTA和Gd³⁺顺次性键合后形成的磁共振成像（MRI）对比剂HT-Gd在体可视化检测肾脏部位5-羟色胺受体的动态变化，为药物性AKI早期无创诊断提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

5-羟色胺盐酸盐，1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸 1-（2，5-二氧代-1-吡咯烷基）酯（DOTA-NHS），氯化钆六水合物（GdCl₃·6H₂O）购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。BALB/c雌性小白鼠购于湖北省实验动物研究中心（许可证号：SCXK（鄂）2020-0018）。人源性肾小管上皮细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司。化学试剂如乙腈、浓硝酸、浓硫酸购自国药集团化学试剂有限公司。生物试剂如青霉素链霉素（Hycolon^®）、高糖培养基（Hycolon^®）、胎牛血清（Gibco^®）均通过国内采购商购买。

1.2 方法

1.2.1 5-HT-DOTA的制备

三口干燥的烧瓶中分别加入0.5 g DOTA-NHS，1.0 g 5-羟色胺盐酸盐，2.0 g DIPEA及10 mL无水DMF。混合溶液在N2保护下，反应24 h后利用LC-MS制备得到白色粉末5-HT-DOTA。制备条件：λ=220 nm，5% H₂O（+0.1% Formic acid）与95% CH₃CN （+0.1% Formic acid）作为淋洗剂，以流速0.8 mL/min制备。

1.2.2 HT-Gd的制备

5-HT-DOTA（1.0 mmol，1.0 eqv.）在N₂保护下溶于20 mL醋酸钠缓冲溶液中（1.0 mol/L，pH = 6），向上述溶液中加入GdCl₃·6H₂O（1.5 mmol，1.5 eqv.）搅拌16 h。利用LC-MS制备得到白色粉末HT-Gd。制备条件：λ = 254 nm，5% H₂O （+0.1% Formic acid）与95% CH₃CN （+0.1% Formic acid）作为淋洗剂，以流速0.8 mL/min制备。

1.2.3 HT-Gd的细胞毒性

将人源性肾小管上皮细胞（HK-2）以5×10⁴个/孔的细胞密度接种于96 孔板内，置于37 ℃，5% CO₂的培养箱内培养24 h。将不同浓度的HT-Gd或商用对比剂马根维显 （Magnevist）与HK-2细胞共培养24 h后，用PBS洗去未吸收的HT-Gd，并加入新的培养基。噻唑兰（MTT）与上述处理后的细胞共培养4 h，吸尽MTT后，再加入150 μL的二甲亚砜（DMSO），充分振荡1 min后，用酶标仪测量各孔在570 nm处的吸光值。

1.2.4 HT-Gd的细胞摄取

将人源性肾小管上皮细胞（HK-2）以5×10⁴个/孔的细胞密度接种于96 孔板内，置于37 ℃，5% CO₂的培养箱内培养24 h。细胞与顺铂（20 μmol/L）共培养12 h后，加入5.0 μmol/L HT-Gd，继续培养8 h。洗去未被摄取的HT-Gd后，收集细胞，并平均分成2份。一份细胞用含有浓硫酸：浓硝酸的混合溶液加热处理，并调节pH = 7.4，利用电感耦合等离子体-质谱法（LC-MS）检测溶液中的Gd³⁺浓度。另一份细胞液利用标准法检测细胞蛋白含量。最终的Gd³⁺浓度采用μg/mg蛋白表示。

1.2.5 体外分析顺铂诱导肾脏5-羟色胺受体表达

16~20 g的雌性BALB/c小白鼠，经腹腔注射顺铂（20 mg/kg）构建顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）模型。首先，通过检测血清肌酐（sCr）和尿素氮（BUN）验证成功构建顺铂诱导的AKI模型。其次，在顺铂给药后的第12，24，48 h分别处死小鼠并保留肾脏组织，用于切片、染色检测肾脏中5-羟色胺受体的表达情况。

1.2.6 体内磁共振成像

16~20 g的雌性BALB/c小白鼠，经腹腔注射顺铂（20 mg/kg）构建顺铂诱导的急性肾损伤（AKI）模型。顺铂给药后的第48 h，经尾静脉注射HT-Gd （100 μmol/L/kg）。在3.0 T Siemens Prisma 磁共振仪器上，使用小口径动物线圈进行MRI。采用T1WI序列对小鼠进行基线成像。T1WI 成像参数：TR =750 ms，TE = 13.5 ms。图像在 Matlab 通过绘制感兴趣区域（ROI）并测量相关组织的信号强度。

1.3 数据处理

所有试验数据使用用Excel表格记录，并采用SPSS 17.0软件处理分析数据，以P<0.05 作为差异有统计学意义，以P<0.01 作为差异有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 HT-Gd的制备

HT-Gd的合成过程及中间产物¹H NMR表征如图1~2所示。

2.2 HT-Gd的细胞毒性

如图3所示，与商用磁共振对比剂Magnevist一样，HT-Gd对人源性肾小管上皮细胞HK-2的毒性也较小，即使HT-Gd浓度达到20 μmol/L，也表现出较低的细胞毒性。MTT结果表明，HT-Gd具有良好的生物安全性，适宜于体内动物成像。

2.3 HT-Gd的细胞摄取

如图4所示，Gd³⁺在顺铂处理的HK-2细胞中的浓度更高，是未用顺铂处理HK-2细胞中Gd³⁺浓度的2.5倍。结果表明，HT-Gd可以特异性靶向顺铂处理后的HK-2细胞，对于体内可视化检测顺铂诱导的AKI具有潜在价值。

2.4 AKI早期肾脏5-羟色胺受体过表达

如图5-A~B，顺铂给药后的前48 h，小鼠的血清肌酐和尿素氮均处于正常范围。而在给药后的第72 h，小鼠的血清肌酐和尿素氮显著升高，提示肾脏受到严重损伤。图5-C中5-羟色胺受体免疫组化分析显示，肾脏中5-羟色胺受体的表达量在顺铂给药后的第12 h显著上升。以上结果表明，在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，肾脏5-羟色胺受体的过表达早于临床肾脏检测指标，血清肌酐和尿素氮，可以用于药物性肾损伤早期诊断研究。

2.5 顺铂诱导AKI的早期MRI诊断

如图6，小鼠经腹部注射顺铂（20 mg/kg）24 h后，通过尾静脉注射HT-Gd对比剂1 h，检测肾脏T1加权磁共振信号（T1WI）。未注射顺铂的老鼠肾脏部位TIWI信号强度较低（SNR = 20.2%），而在顺铂诱导的AKI小鼠模型中，肾脏T1 WI信号升高至40.5%，约为未经顺铂处理组小鼠的2倍。以上结果表明，HT-Gd可以经过肾脏过滤，且能在早期诊断顺铂诱导的AKI。

如图7，正常小鼠经静脉注射HT-Gd后的第3天，主要器官组织，如心、肝、脾、肺、肾，离体切片HE染色分析显示均未发现明显的细胞损伤和坏死。结果表明HT-Gd良好的生物安全性，具有潜在的临床应用价值。

3 讨论

急性肾损伤（AKI）定义为在数小时或数天内突然发生的肾损伤或肾衰竭，是一种以肾功能急剧下降引起血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）升高为特征的临床综合征。AKI 早期无特征临床表现，极易发展为慢性肾病、代谢性酸中毒、高血压、中风等，具有高发病率和死亡率的特点，是临床中长期存在的严重问题。早期无创诊断AKI的发生和发展可以指导及时采取预防或治疗措施，有助于肾损伤的恢复，防止发生严重的并发症、肾脏移植甚至死亡情况，但尚未解决^［1-3］。临床常规的无创影像学方法，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MR）、超声成像（US）等，已广泛用于AKI诊断^［21-22］。而当前的影像学方法主要成像肾损伤晚期的肾脏组织和解剖结构的变化，无法准确获取肾脏组织的分子信息^［18］。

本文关注到肾脏5-羟色胺受体在药物性AKI的发生和发展过程中起着重要作用，是药物性AKI早期的关键标志物^［19-20］。在动物体内我们发现，随着顺铂（20 mg/kg）给药时间的延长，小鼠肾脏部位的5-羟色胺受体表达量逐渐升高。同时，顺铂给药后，体内肾脏5-羟色胺受体表达量的升高时间（24 h）早于临床检测血清肌酐和尿素氮异常的时间（72 h）。我们推断，在体内肾脏5-羟色胺受体的动态变化可以用作用药物性AKI早期诊断的标志物，其可视化检测有助于探索早期AKI无创影像诊断方法，而当前尚未有相关成像方法的报道。

磁共振成像（MRI）技术具有非电离辐射、无限穿透深度和高空间分辨率等特点，已广泛用于临床中各类疾病的诊断。探索肾脏5-羟色胺受体的MRI方法对于药物性AKI的早期诊断具有重要临床价值。本文利用具有5-羟色胺的磁共振探针（HT-Gd），拟特异性靶向肾脏肾小管上皮细胞5-羟色胺受体，探索可视化检测顺铂诱导急性肾损伤过程中肾脏部位5-羟色胺受体的表达情况，无创可视化早期诊断顺铂诱导的急性损伤。在体外细胞毒性研究中发现，该对比剂与商用对比剂马根维显一样，对肾小管上皮细胞（PTECs）的毒性较低，具有良好的生物安全性。从细胞摄取试验发现，顺铂处理后的PTECs对HT-Gd的摄取量显著提升，是未经顺铂细胞摄取量的2.5倍。体内MRI研究中发现，顺铂（20 mg/kg）处理小鼠24 h虽然未检测到血清肌酐和尿素的异常，但其肾脏部位的T1WI信号升高至40.5%，约为未经顺铂处理组小鼠的2倍（SNR= 20.2%）。以上结果表明，HT-Gd可以检测小鼠肾脏5-羟色胺受体的动态变化。最后，从小鼠主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾的HE染色发现，HT-Gd具有良好的体内生物安全性。

4 结论

肾脏中5-羟色胺受体在顺铂诱导的急性肾损伤中的表达量显著上调，是急性肾损伤早期的关键标志物。HT-Gd可视化检测肾脏部位的5-羟色胺受体，实现了对顺铂诱导急性肾损伤的早期诊断，为药物性急性肾损伤早期诊疗研究提供了新的参考方法。

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基金资助

湖北省卫生健康委科研资助(WJ2023Q009)