旱地元帅系苹果果肉质地发绵与果实品质及酶活性相关性研究

Study on the correlation between flesh quality and fruit quality and enzyme activity in dryland marshal apple

摘要

目的 探究苹果果实发绵与品质、酶活性变化的相关关系具有重要意义。 方法 以元帅系品种天汪1号为试材，测定分析其果实不同发育期品质、酶活性变化以及与果肉发绵的相关性，探明影响果肉发绵的关键酶和品质指标。 结果 随着果实成熟度的增加，果肉硬度、含水量、可滴定酸含量显著降低，而可溶性糖含量显著增加；可溶性固形物、VC含量呈先升后降的变化特征。果实中丙二醛（MDA）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、淀粉酶（AM）活性随果实发育进程呈“升-降-升”变化，β-半乳糖苷酶（β-Gal）和纤维素酶（Cx）呈“升-降”趋势，而果胶甲酯酶（PME）显著上升。苹果果实冷藏（4 ℃）条件下，随贮藏期延长，果实可溶性糖含量显著增高；而水分、可溶性固形物、可滴定酸、VC含量均显著下降，果肉硬度冷藏60 d后显著下降。果实中PG、AM、PME活性随贮藏期显著上升，而Cx活性显著下降，MDA和β-Gal活性变化不大。果实硬度和水分与PME、PG和AM均表现为极显著负相关，与β-Gal为极显著或显著负相关，MDA为显著负相关，而与Cx呈极显著或显著正相关。影响果实硬度、含水量的酶活性排序分别为：PME >AM >PG >Cx >β-Gal>MDA 与AM>PME>PG>Cx>β-Gal>MDA。果肉硬度和水分均与可溶性糖呈极显著负相关，而与VC、可滴定酸呈极显著或显著正相关。 结论 综合分析认为，影响元帅系苹果果实发绵的关键酶为PME、PG和AM；影响果实发绵的品质指标除果肉硬度和水分外，VC、可溶性糖和可滴定酸也影响果实发绵的程度。

Abstract

Objective To investigate the correlation between apple fruit morulae and changes in quality and enzyme activities. Method Quality，enzyme activity and correlation with flesh development were analyzed at different development stages of Marshal variety Tianwang 1，and the main enzymes and quality indices affecting flesh development were investigated and analyzed. Result With increasing fruit maturity，the firmness，water content and titratable acid content of the pulp decreased significantly，while the soluble sugar content increased significantly; the content of soluble solids and VC first increased and then decreased.The activities of malondialdehyde (MDA)，polygalacturonase (PG) and amylase (AM) in the fruit changed from "up down up" with the development of the fruit，β-galactosidase（β-Gal) and cellulase (Cx) showed an "up down" trend，while pectin methylesterase (PME) increased significantly.Under cold storage (4 ℃)，the soluble sugar content of apple fruit increased significantly with the prolongation of the storage period; the contents of water，soluble solids，titratable acid and VC decreased significantly，and the firmness of the pulp decreased significantly after 60 days of cold storage.The activities of PG，AM and PME in fruit increased significantly with storage，while the activities of Cx decreased significantly，MDA and β-Gal activity changed little.Fruit firmness and water content were significantly negatively correlated with PME，PG and AM β-Gal is highly significant or significantly negative correlation，MDA is significantly negative correlation and Cx is highly significant or significantly positive correlation.The order of enzyme activities affecting fruit firmness and water content was PME>AM>PG>Cx> β- Gal>MDA and AM>PME>PG>Cx> β- Gal>MDA.The firmness and water content of the pulp were negatively correlated with soluble sugars，but positively correlated with VC and titratable acid. Conclusion The main enzymes affecting fruit development in Marshall are PME，PG and AM; the quality indices affecting fruit development are flesh firmness and moisture，but VC，soluble sugar and titratable acid also affect the degree of fruit development.

Graphical abstract

关键词

果肉发绵 / 酶活性 / 果实品质 / 花牛苹果

Key words

soft pulp / enzyme activity / fruit quality / Huaniu apple

Author summay

徐紫兆，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

花牛苹果是甘肃元帅系苹果的代表品种和地方传统优势品种，果实外观艳丽、漂亮，果肉香味浓郁、硬度松脆适中，深受消费者青睐^［1］。天水市作为花牛苹果主产区，也是目前我国元帅系苹果最集中产区，现有栽培面积11.1万hm²，占全省苹果面积的26.4%^［2］。以天汪1号、首红、俄矮2号、瓦里等短枝型品种为主的‘花牛苹果’在地方农业产业发展和乡村振兴中发挥着重要作用。

果实质地是评价苹果品质的重要指标之一，也是影响消费者喜好程度的关键因素^［3］。对于苹果来说，果实硬度、脆度、肉质、汁液、软、绵等均可以描述果实的质地特性^［4］，这些性状特征均为受多基因控制的数量性状^［5］。从生理上看，影响果实质地的主要因素为细胞间的结合力、细胞壁构成物质的机械强度和细胞间的紧张度，而起重要作用的分别是果胶物质、纤维素和细胞壁的结构^［6］。

发绵和软化是果实质地变化的两个主要方面，是果实成熟与衰老的典型特征。果实发绵与软化有着本质的区别，一般认为，软化主要是表征果实硬度的下降，也会发生细胞壁降解、呼吸上升、内含物变化、风味物质形成以及其它一系列代谢变化^［7］；而发绵不仅是果肉硬度的降低，同时伴随着水分及内容物的流失，发绵更能表明果实内部生理生化的变化状况。不同苹果品种果肉质地发绵特征不同，元帅系品种表现更为明显。

在元帅系品种品质优化和改良进程中，果实外观品质、结果性状、短枝性等特征优势明显提升，而果实采后发绵的问题仍未从根本上解决，其发绵机制也不清楚。果实发绵成为制约元帅系苹果品质提升的瓶颈。国内外关于果实质地的研究热点在贮藏期果实软化生理、分子机理等方面，研究者获得了大量可靠的结论和理论支撑，一定程度上有效抑制了果实软化速度，果实的贮藏性也得到提高，但对果肉质地发绵机理、特别是元帅系苹果果实生育期发绵机理研究较少。

果实发绵的表征是果肉硬度的降低和水分及内容物的散失，苹果果实细胞壁结构和细胞膜透性与果实软化相关，细胞壁结构改变和各成分物质降解，涉及多种水解和氧化还原酶的参与^［8］。苹果在贮藏过程中的各种物质变化与酶的活动密切相关，而酶的催化活动会导致果实品质发生相应变化。许多果实后熟和贮藏期间的果肉软化与降解细胞壁多糖的一些水解酶有关^［9］，其中多聚半乳糖醛酸酶（PG）一直被认为是分解果胶而引起果实软化的关键酶^［10］，而果胶甲酯酶（PME）的主要功能是影响细胞壁多聚半乳糖醛酸的充分去酯化，为PG的作用准备底物，对果胶的降解起辅助作用。有研究认为，PG和PME是降解果胶的两个关键酶，二者共同作用，影响果实质地的改变^［11］。

本文以天汪一号苹果为试材，研究果实发育期及贮藏期果实品质、酶活性变化，分析其相关关系，以期探明影响元帅系苹果果实发绵的关键酶及品质指标，为元帅系品种及同类果实品质改善提供理论依据和支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地选在天水市秦州区天水果树研究所苹果园，园内主栽品种为天汪1号，授粉品种为金矮生，砧木为八棱海棠，树龄9 a，栽植株行距3 m×4 m，树形为纺锤形，水肥条件较好。

1.2 试验设计与取样方法

本试验分为两部分：不同发育期果实品质及酶活变化和常规采收果实低温贮藏期果实品质及酶活变化。

1.2.1 不同发育期果实品质及酶活变化

选择生长发育一致、无病虫害、主干粗度相同的天汪1号苹果树12株，在树体东南方向、高度1.5~2.0 m处选取样果，分别于果实发育90 d（8月4日）、105 d、120 d、135 d和150 d后5个时期进行采样，每次选取大小一致、正常发育的果实36个，带回实验室后测定果实硬度、含水量、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和维生素C等品质指标，同时测定果实中MDA、PG、β-Gal、Cx、AM和PME等酶活性，剩余果实皮肉分离后将果肉进行预处理保存，用于后续试验。样果预处理：在无菌条件下，先用无水乙醇清理果实表面，然后用小刀削去果皮，取皮下1 cm处果肉，锡纸包好后用液氮迅速冷冻，标记后放入-76 ℃超低温冰箱中保存。

1.2.2 常规采收果实低温贮藏期果实品质及酶活变化

成熟期（果实发育135 d）采样：于果实成熟期按照“1.2.1”方法采样果72个，平均分为2份，每份36个；其中一份按照“1.2.1”方法进行预处理，另一份于4 ℃低温保存60 d和120 d后，测定果实硬度、含水量、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和维生素C等品质指标，同时测定果实中MDA、PG、β-Gal、Cx、AM和PME等酶活性。

1.3 测定方法

1.3.1 果实品质测定

用GY-1数显水果硬度计测定果实硬度；果实含水量参考曹建康等^［12］的方法测定；可溶性糖、可滴定酸和VC分别用蒽酮比色法^［13］、NaOH中和滴定法和2，6-二氯靛酚滴定法测定^［14］。

1.3.2 酶活性测定

MDA用TCA比色法进行测定。

PG用NaOH滴定生成的果胶酸来表示PE活力，以产生的半乳糖醛酸量来表示PG酶活性。

β-Gal参照β-半乳糖苷酶试剂盒（上海索桥生物科技有限公司提供）方法测定。

Cx的活性采用3，5-二硝基水杨酸法^［15］测定。

AM同参照曹建康等方法测定。

PME用果胶甲酯酶试剂盒（上海机纯实业有限公司提供）方法测定。

1.6 数据分析

用Microsoft Excel 2010软件进行数据统计分析，用SPSS 22.0软件对试验结果进行多因素方差分析，用Pearson相关系数法进行相关显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同发育期果实品质变化

2.1.1 硬度和水分变化

图1~2中可见，随着果实发育进程，果实硬度和水分含量均呈下降的趋势。其中，果实硬度随着生长发育进程，不同时期较上一个时期均显著下降，而果实水分含量从105 d开始，每个时期均较前一时期显著下降；果实硬度和水分含量均在果实发育150 d时达到最低。果实硬度和水分含量的降低，说明果实内部一些物质发生了变化，从而导致这一结果。

2.1.2 果实可溶性固形物、可溶性糖、可滴定酸和VC含量变化。

图3~4显示，随着果实发育进程，可溶性固形物含量在果实发育150 d时含量达到最高；果实可溶性糖含量，随着果实发育进程呈显著上升的趋势，不同发育期差异均显著。试验结果表明，果实可溶性糖和可溶性固形物含量与果实硬度和含水量变化趋势相反，果实可溶性糖和可溶性固形物含量的升高，加剧了果实的发绵程度。

图5表明，果实可滴定酸在发育前期没有显著变化，而果实发育120 d时含量显著低于105 d，120 d后急剧下降，至果实成熟期达到低值，而此期也是果实开始发绵的关键时期。因此，较高的果实酸度是否有利于减缓果实发绵，这种作用机制有待于进一步研究。图6显示，果实VC含量呈先升高后降低的趋势，果实发育105 d时最高，150 d最低，不同采样时期差异显著。试验结果表明，果实可滴定酸、VC含量与果肉硬度、含水量的变化趋势基本相同，即呈正比关系，可滴定酸、VC含量的降低促进了果实发绵，其作用机理有待于进一步研究。

2.2 不同发育期果实丙二醛及酶活性变化

2.2.1 MDA含量变化

图7中可以看出，果实MDA含量呈“升-降-升”的变化趋势，果实发育105 d时达到最高，随后迅速下降，至120 d时达到最低值，之后又缓慢上升。果实中MDA在果实后熟过程中，会使生物膜中的酶蛋白交联和失活，加速果实衰老。

2.2.2 不同发育期果实酶活性变化

在果实发育进程中，不同酶活性变化特征不同。图8~12中，PG和AM随果实发育进程均呈“升-降-升”趋势，果实发育105 d达到高值，随后急剧下降，至120 d时最低，之后又快速升高，不同时期差异显著；β-Gal呈显著上升趋势，至135 d时达到最高，之后缓慢下降；Cx呈“升-降”趋势，果实发育105 d达到最高，然后显著下降，150 d时达到最低，不同时期差异显著；PME呈持续上升的变化规律，果实发育前期差异不显著，120 d时开始显著上升，至150 d时达到最高。对于元帅系苹果来说，果实不同发育时期，不同酶活性变化不同且差异显著，说明果实酶活性变化影响了苹果果实发绵程度。

2.3 冷藏条件下果实品质及酶活性变化

2.3.1 果实品质变化

表1可见，元帅系苹果果实在4 ℃冷藏条件下，贮藏120 d后果实硬度变化没有显著差异；而果实含水量在冷藏120 d后下降了3.34%，显著低于冷藏初期；果实可溶性固形物在贮藏60 d时没有显著差异，当贮藏至120 d时显著下降；可滴定酸含量在贮藏60 d和120 d时均显著低于贮藏初期，分别降低了1.79%和10.71%；可溶性糖含量在贮藏中期（60 d）无显著差异，至120 d时显著升高，比对照上升2.41%；VC含量在贮藏60 d时显著降低，而贮藏后期变化较小，与贮藏60 d时没有显著差异。在贮藏期间的果实中，发现冷藏可以有效的延长果实生理指标的变化。

2.3.2 贮藏期丙二醛及酶活性变化

由表2可知，果实贮藏0 d、60 d和120 d的Cx、β-Gal、和MDA变化不大，不同时期均没有显著差异；而AM和PME酶活性呈上升趋势，但贮藏前期差异不显著，贮藏120 d时显著提高，成熟期到贮藏120 d，AM和PME酶活性分别增加了8.97%、3.98%；贮藏120 d时PG酶活性显著高于冷藏60 d，但与成熟期差异不显著。酶活性的变化是果实发绵的关键，而贮藏温度的降低可以有效使酶活性变化的周期延长。

2.4 贮藏期果实硬度、含水量与果实品质及酶活性相关性分析

硬度的降低和水分的散失是影响苹果果实发绵的最直接因素，而酶活性是导致果实硬度降低和水分散失的重要相关影响因素。对果实品质及酶进行斯皮尔曼相关性分析的结果表明，果实硬度与含水量、可滴定酸和VC含量呈极显著正相关关系；与可溶性糖含量呈极显著负相关关系；与可溶性固形物含量显著负相关；相关程度大小为VC>可溶性糖>可滴定酸>含水量>可溶性固形物。果实硬度与PG、β-Gal、AM、PME呈极显著负相关；与MAD呈显著负相关；与Cx酶呈极显著正相关；其相关程度大小为PME >AM >PG >Cx >β-Gal >MAD。果实含水量与硬度、VC呈极显著正相关；与可滴定酸显著正相关；而与可溶性糖呈极显著负相关；与可溶性固形物显著负相关；其相关程度大小为为VC>硬度>可溶性糖>可滴定酸>可溶性固形物。果实含水量与Cx呈显著正相关；与PG、AM、PME呈极显著负相关；与MDA、β-Gal显著负相关；其相关程度大小为AM> PME >PG>Cx>β-Gal>MAD。果实硬度和水分与PME、PG和AM均表现为极显著负相关，而与β-Gal为极显著或显著负相关，与Cx表现为极显著或显著正相关。综合分析，影响果实发绵的关键酶为PME、PG和AM；其VC、可溶性糖和可滴定酸等品质指标也影响果实发绵。

3 讨论

发绵和软化是果实质地变化的2个主要方面，是果实成熟与衰老的典型特征。果实发绵与软化有着本质的区别，一般认为，软化主要是表征果实硬度的下降，也会发生细胞壁降解、呼吸上升、内含物变化、风味物质形成以及其它一系列代谢变化^［16］；而发绵不仅是果肉硬度的降低，同时伴随着水分及内容物的流失，发绵更能表明果实内部生理生化的变化状况。不同苹果品种果肉质地发绵特征不同，元帅系品种表现更为明显。硬度和含水量是影响苹果果肉脆度和发绵的最直观的品质指标。随着成熟度增加，苹果果肉硬度、水分呈下降趋势，这与已有研究结果相同，包括梨^［17］、杏^［18］、草莓^［19］等。本研究结果表明，随着果实成熟度的增加，果实可溶性糖含量呈上升趋势，而这种含量增加必然与淀粉等物质转化成果糖有关，有研究表明，淀粉会在AM的作用下发生水解转化成可溶性糖，导致果实的软化，在不耐贮藏的猕猴桃果实中，AM酶活性会随着果实软化的进程逐渐升高，对甜樱桃的研究显示，它们的可溶性糖和总糖含量通常会增加，并且大体上保持与水果生长相同的趋势^［20］，从而导致果实发绵软化，与本研究结果相同；而可滴定酸呈下降趋势，特别是果实发育120 d时急剧下降，此期与苹果果实开始发绵时期相同，表明酸度的降低加速了果实的发绵，其他学者研究发现，苹果果实在早期发育中可滴定酸含量最高，随着果实逐渐成熟，后期降至最低^［21］，这与本研究结果相同，但其作用机理有待于进一步研究。

前人对果实质地变化的研究主要集中在贮藏期果实软化生理、分子机理以及控制方面，包括果胶和基质聚糖的解聚、果胶聚合物的增溶以及果胶侧链中性糖的损失^［22］，其中涉及多种酶的协同参与，并由于不同品种果实，不同酶发生的作用及时期也存在差异^［8］，而对苹果果实发绵特征及相关生理变化研究较少。研究表明，苹果果肉细胞壁结构改变以及相关物质的降解，涉及到多种水解和氧化还原酶的参与，这些酶影响苹果果实品质发生变化。在果实成熟衰老过程中，组成细胞壁的纤维素、果胶质等发生酶促分解，在多种细胞壁水解酶相互协调和作用下，导致果胶质、纤维素和半纤维素等细胞壁物质的成分和含量发生变化。有研究认为，PG等果胶酶类活性增加，果胶物质分解，果胶酸钙的连接作用就被会破坏^［23］；而PME的主要功能是影响细胞壁PG的去酯化，为PG的作用准备底物。PG和PME是降解果胶的两个关键酶，二者共同作用，影响果实质地的改变^［24］；也有研究者认为，PG对果胶多糖的降解不足以造成果实软化，因此并不是造成果实软化的决定性因素^［25］。而β-Gal作为细胞壁多糖组分降解酶，参与降解细胞壁的半乳糖苷键，能降解果胶和半纤维素^［26］。本研究结果表明，苹果果实硬度与水分的变化与酶活性变化显著相关，不同酶变化趋势不同。PG和AM随果实发育进程呈“升-降-升”波动变化趋势，至120 d时达到最低，随后又快速升高，此期苹果果实开始发绵，说明其活性增高加剧了果实发绵速度。β-Gal和PME随果实发育进程呈上升趋势，分别与果实发育期的135 d和150 d达到高值，其活性增大，也促进了果实发绵。不同酶活性消长变化以及促进或抑制苹果果实发绵的作用机制有待于进一步研究。

4 结论

综合分析认为，果实硬度、含水量，VC、可滴定酸、可溶性固形物和可溶性糖等果实品质指标均会影响果实发绵程度，大小排序为：VC>可溶性糖>可滴定酸>可溶性固形物；影响果实发绵的关键酶是PME、PG和AM。

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基金资助

甘肃省技术创新引导计划项目(23CXNA0003)

甘肃省现代农业科技支撑体系区域创新中心重点科技项目(2022GAAS03)

静宁县苹果营养诊断及果园土壤质量提升技术研究与应用(JNJY2022ZC-068)

静宁县苹果营养诊断及果园土壤质量提升技术研究与应用(JNJY2023ZC-132)