武威市林木枝干病害调查及主要病原真菌鉴定

Survey on tree stem diseases and identification of pathogenic fungal in Wuwei，Gansu Province，China

摘要

目的 明确甘肃武威地区林木枝干病害种类。 方法 本研究采用踏查法对武威市主要树种的病害进行调查，并对发病部位进行子实体分离、形态学鉴定，采用多基因序列的系统发育分析方法对引起主要病害种类的病原真菌进行鉴定。 结果 调查涉及林木树种共计40属58种，其中出现病害的树种有11属16种，其病害种类分为22种，其中杨树（Populus spp.）及国槐（Styphnolobium japonicum）腐烂病发生最为严重。经分子生物学鉴定主要病原真菌7种，主要类群为非洲小单孢腔菌Aplosporella africana、臭椿壳囊孢Cytospora ailanthicola、卫矛壳囊孢Cytospora euonymin和拟国槐壳囊孢Cytospora sophoriopsis。此外，记录了林木病原真菌的非洲小单孢腔菌Aplosporella Africana 1个中国新记录和17个新寄主记录。 结论 武威市林木中，杨树及国槐腐烂病发生最为严重。

Abstract

Objective The objective of this study was to elucidate the types of branch and stem diseases in forest trees in Wuwei of Gansu Province. Method Typical symptoms were utilized to investigate the major diseases，and the pathogenic fungi responsible for these diseases were identified through entity isolation，morphological characterization of disease site substrates，and phylogenetic analysis of multi-gene sequences. Result The survey encompassed 40 genera and 58 plant species，with 11 genera and 16 species exhibiting signs of disease.A total of 22 disease types were identified，with poplar （Populus spp.） and acacia （Styphnolobium japonicum） rot disease being the most severe. Seven primary pathogenic fungi were identified by using molecular biology techniques，including Aplosporella africana，Cytospora ailanthicola，Cytospora euonymin，and Cytospora sophoriopsis. Additionally，one new Chinese record and 17 new host records of a forest pathogenic fungus，i.e.，Aplosporella africana，were recorded. Conclusion In Wuwei，poplar （Populus spp.） and acacia （Styphnolobium japonicum） exhibited the most severe rot diseases.

Graphical abstract

关键词

中国新记录种 / 新寄主记录 / 枝枯病 / 腐烂病

Key words

new recorded species in China / new host records / branch wilt disease / rot disease

Author summay

王多文，高级工程师，农学学士，主要研究方向为林业技术推广及病虫害防治。E-mail：[e-mail]

武威市位于甘肃省中部，河西走廊东端石羊河流域中游，地处腾格里沙漠、巴丹吉林沙漠的交汇地带。地势呈西南高东北低，境内有灌溉绿洲、荒漠、高山草地、祁连山天然水源涵养林带及沙漠、浅山地带，是甘肃的缩影。武威地区属温带大陆干旱气候，具有干旱少雨、日照充足、昼夜温差大的特点；植被组成复杂，以高山灌木和天然乔灌林、梭梭、毛条等沙生灌木为主^［1］。

病原菌多样性是导致病害爆发和难以防治的主要因素之一，探明引起特定植物病害病原菌的多样性是深入研究该植物病害及防治的基础，在自然界中，能够引起植物病害的生物（病原生物）主要有11类，包括寄生性种子植物、微生物（真菌、细菌、病毒、类菌质体）、线虫、藻类等，这些病原生物均能引起重要作物的严重病害，对经济和社会造成重大影响。植物病原真菌具有丰富的物种及遗传多样性，很多时候植物病害的发生是由多种病原菌引起的，而相同植物病害在不同地区往往又可由同一类型病原菌所致^［2］。

林木枝干经常会出现严重的病害，直接对林木正常生长造成严重影响。研究报道杨树枝干经常会产生杨树枝瘤病、杨树烂皮病、溃疡病和破皮病等^［3］。王轶菲等^［4］研究表明引起银杏干枯病病原为栗疫枝枯病菌（Gryphonectria parasit）。王慧敏^［5］在对景泰县国槐主要病虫害发生调查中发现国槐烂皮病又称腐烂病，是一种真菌性病害，主要为害国槐的枝干，造成皮层开裂、腐烂，树势减弱，严重时导致整株死亡。王红梅^［6］的研究表明国槐烂皮病其病原菌主要为木霉属（Trichoderma spp），而曾菲^［7］又发现根据病原菌不同，可分为小穴壳菌型和镰刀菌型2种。因此，引起林木枝干病害的病原菌存在差异，所以探明引起特定植物病害病原菌的多样性以及发生规律，是深入研究该植物病害及针对性采取防治措施的基础。

根据我们的前期调查，发现甘肃武威地区的林木枝干病害发生严重，但却没有相关研究及对其进行调查和病原菌鉴定，因此，在本区域开展林木病害及病原真菌的种类及病害发生规律的研究迫在眉睫。本研究从林木病原真菌的分类和病理学角度出发确定主要病害及病原名录，为武威市林木病害的研究提供理论依据和基础数据。

1 材料与方法

1.1 调查地概况

调查地位于甘肃省武威市凉州区、民勤县、古浪县和天祝县，地处黄土高原、青藏高原和蒙新高原三大高原交汇地带，地势呈西南高东北低，局部地形复杂。武威属典型的大陆性气候，年平均气温7.8 ℃，降水量60~610 mm，蒸发量1 400~3 010 mm，日照时数2 200~3 030 h，无霜期85~165 d，太阳辐射量147~160 Kcal/cm²。南部祁连山区年降水量为310~522 mm，平均气温零度以下，无明显夏季。中部绿洲灌溉区属温带干旱区，夏季气温在24.2~36 ℃之间，昼夜温差较大。全年日照3 000 h，降水量102~200 mm，蒸发量2 000 mm以上。北部干旱区干旱缺水，年降水量52 ~185 mm，蒸发量3 000 mm。

1.2 病害调查与标本采集

本研究自2023年7月开展，在凉州区、民勤县、古浪县和天祝县等区域采用踏查^［8］的方法，对主要树种植物病害的发生进行调查和采样^［9］。记录所见树种是否感病，若感病则记录病害标本的症状、采集经纬度、海拔等信息。对症状典型的标本拍摄生态照。每份标本装袋后干燥常温保存。

1.3 病原菌鉴定方法

1.3.1 病原菌的分离、纯化及保存

收集不同地区林木树种的发病部位，用75%酒精消毒的无菌手术刀切去子实体表面树皮进行致病菌的分离 （将其接种至PDA培养基待菌丝生长后挑取菌丝至离心管，通过加灭菌水，吸打混匀后将其稀释至50倍，涂布于PDA培养皿，待长出菌丝挑取单个菌丝接种于PDA培养皿）、纯化（观察分离的单菌丝生长状态和菌丝形态，确保菌丝纯度。若不是单菌落，继续分离纯化） 。分离以及纯化过程中，通过不断稀释分离，选择平板上单独长出的菌落，使其接种生长以供后期致病菌鉴定^［10］。

1.3.2 DNA提取及系统发育学分析

在PDA培养皿上刮取适量菌丝置于2 mL离心管。采用CTAB法^［11］进行DNA提取。将提取后的DNA送至擎科生物技术有限公司进行正反双向ITS序列的PCR扩增。得到的序列用Seqman v.7.1.0进行检查和拼接。在NCBI网站上使用BLAST功能对拼接好的序列进行初步鉴定至属水平。使用特异性引物序列对其所在属的特征片段进行特异性扩增，即对小单孢腔菌属Aplosporella 菌株的扩增转录延长因子（tef1-α）基因片段进行扩增，对壳囊孢属Cytospora菌株的扩增肌动蛋白（act）、扩增 RNA 合成酶第二亚基（rpb2）、扩增转录延长因子（tef1-α）、扩增微管蛋白（tub2）4个特异性基因片段进行扩增，引物信息见表1。使用MEGA v.6.0对全部碱基序列进行查看和比对。分别使用PhyML v.3.0^［12］和MrBayes v.3.1.2^［13］程序以最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）^［14］构建多基因系统发育树。系统发育树使用Figtree v.1.3.1进行构建。引物序列为多基因，单基因无法在Aplosporella和Cytospora两个属中起到区别物种的作用。

1.3.3 形态学观察

对子实体的顶盘、孔口、腔室结构等宏观形态特征和分生孢子梗、产孢细胞、分生孢子和子囊、子囊孢子等微观形态特征进行观察。培养形态主要记录菌落大小、菌丝质地及颜色等特征。每个样本数n=3，为3个重复试验。

2 结果与分析

2.1 主要植物种类和病害调查

调查涉及植物种类共计40属58种，其中出现病害的有11属16种。病害普遍且严重的树种有核桃（Juglans regia）、河北杨（Populus × hopeiensis）、二白杨（Populus ×xiaohei var.gansuensis）、新疆杨（Populus alba var.pyramidalis）、黑杨（Populus nigra）、小叶杨（Populus simonii）、旱柳（Salix matsudana）、国槐（Styphnolobium japonicum）；病害偶发的树种有臭椿（Ailanthus altissima）、红瑞木（Cornus alba）、白蜡（Fraxinus chinensis）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、圆柏（Juniperus chinensis）、侧柏（Platycladus orientalis）、欧洲李（Prunus domestica）、垂柳（Salix babylonica）；其余树种无发病情况。

2.2 病原菌种类分子生物学鉴定

对发病比较严重的臭椿、白蜡、侧柏和国槐等树种的枝枯病菌构建进化系统发育树并进行了进化关系分析（图1）。结果表明，臭椿枝枯病、白蜡枝枯病、核桃枝枯病等6种枝枯病菌（菌株号：CFCC59794、CFCC59800、CFCC59759、CFCC59754、CFCC 59756、CFCC59760）均与非洲小单孢腔菌Aplosporella africana序列同源性最高。此外，圆柏枝枯病菌（菌株号：CFCC59779）与贾氏小单孢腔菌Aplosporella javeedii的进化关系最近。

进一步对红瑞木、核桃、河北杨和新疆杨等16个树种腐烂病菌进行了发育树构建（图2），红瑞木腐烂病、河北杨腐烂病、二白杨腐烂病、旱柳腐烂病等腐烂病菌株（菌株号：MQ-HBY-2、MQ-GH-17、MQ-HRM-21-1、MQ-GH-16、MQ-HL-10、MQ-HL-23）与臭椿壳囊孢Cytospora ailanthicola进化关系最近；核桃腐烂病、新疆杨腐烂病、黑杨腐烂病、小叶杨腐烂病等菌株（菌株号：LZ-XJY-7、JD-QY-29、LZ-HT-19-1、JD-QY-30-1、JD-HY-10、LZ-HT-14）与拟国槐壳囊孢Cytospora sophoriopsis进化关系最近，而红瑞木腐烂病、黑杨腐烂病、欧洲李腐烂病等腐烂病菌（菌株号：LZ-HT-17-2、LZ-HT-21、LZ-HT-17-3、MQ-OZL-20、JD-CL-6、JD-HY-9、MQ-HRM-21-2）与卫矛壳囊孢Cytospora euonymina进化关系最近。此外，沙棘枝枯病菌（菌株号：MQ-SJ-32）和新疆杨腐烂病菌（菌株号：MQ-XJY-27-1）分别与沙棘壳囊孢 Cytospora hippophaes Thüm和类半明壳囊孢 Cytospora paratranslucens高度同源，存在最为接近的进化关系。

2.3 病害及病原菌种类

通过对元宝槭、臭椿、紫叶小檗等树种的枝干病害发生情况进行调查，共调查到16种树种的22种病害，经分离鉴定病原菌共7种。主要为非洲小单孢腔菌Aplosporella africana，其树种及病害分别为臭椿枝枯病、白蜡枝枯病、核桃枝枯病、侧柏枝枯病和国槐枝枯病；臭椿壳囊孢，其树种及病害分别为红瑞木腐烂病、河北杨腐烂病、二白杨腐烂病、旱柳腐烂病、国槐腐烂病；卫矛壳囊孢，其树种及病害分别为红瑞木腐烂病、核桃腐烂病、黑杨腐烂病、欧洲李腐烂病、垂柳腐烂病；拟国槐壳囊孢的树种及病害分别为新疆杨腐烂病、黑杨腐烂病和小叶杨腐烂病；沙棘壳囊孢的物种为沙棘枝枯病；贾氏小单孢的物种为圆柏枝枯病；以及类半明壳囊孢的物种为新疆杨腐烂病；均可侵染多种寄主植物。在调查中杨属植物的病害最为严重，病原为壳囊孢属，具体种类有待进一步分析。

2.4 中国新记录及新寄主记录真菌

本研究中共调查到非洲小单孢腔菌1个中国新记录种和17个新寄主记录。在本次调查中于国槐、核桃、臭椿、白蜡、侧柏5种寄主的枝枯病标本上均分离得到该病菌，此5个树种同时也是新寄主记录，此外，本调查还发现12个新寄主记录，分别为臭椿壳囊孢（Cytospora ailanthicola），其寄主种名有红瑞木、河北杨、二白杨（Populus × xiaohei var.gansuensis）、国槐；卫矛壳囊孢，其寄主种名有红瑞木、核桃、黑杨 （Populus nigra）、欧洲李、垂柳 （Salix babylonica）；拟国槐壳囊孢，其寄主种名有核桃、黑杨、小叶杨，所以，本调查发现了1个中国新记录种和17个新寄主记录。

进一步对非洲小单孢腔菌发病症状、孢子侵染特点和孢子形态特征进行了观察（图3）。结果发现，分生孢子体埋生于寄主树皮下，成熟后完全突出寄主表皮，散生或聚生，暗褐色至黑色，多腔室。分生孢子梗多退化为产孢细胞，着生于分生孢子器内壁，棍棒状至长椭圆形，尖端渐细，透明。分生孢子无隔，椭圆形，光滑，端部钝圆，初始时透明，随后变为浅棕色，完全成熟时为褐色，体积随成熟逐渐增长，成熟时孢子13.5~18.5 μm×8.5~12.5 μm。

3 讨论与结论

壳囊孢属Cytospora真菌能够危害多种寄主植物^［15-18］，85种以上的寄主易受其引起的腐烂病的影响，其中以杨柳科及蔷薇科上侵染的种类较多^［19］。壳囊孢属Cytospora spp．真菌属于子囊菌门Ascomycota、粪壳纲Sordariomycetes、间座壳目Diaporthales、黑腐皮壳科Valsaceae无性阶段为壳囊孢科Cytosporaceae^［16］，是引起林木腐烂病的真菌病原菌之一^［20］。

在对新疆杨进行了基于科赫氏法则的致病性接种，最终验证臭椿壳囊孢、拟国槐壳囊孢、类半明壳囊孢都会导致严重的新疆杨腐烂病^［21］。臭椿壳囊孢和拟国槐壳囊孢都属于金黄壳囊孢复合种C.chrysosperma complex，有着与金黄壳囊孢非常相似的子实体腔室特征和孢子大小，仅凭形态特征很容易被鉴定为金黄壳囊孢。这一类真菌主要通过伤口侵染生长势弱的寄主植株，其孢子存活最适温度为25~30 ℃^［22］。

病原菌的形态特征是鉴别其归属的重要依据，也是病害鉴别过程中必不可少的环节。在本研究的调查中，杨属和柳属的腐烂病发生较为严重，尤其是河北杨和旱柳。经鉴定病原类群主要集中在壳囊孢属真菌。在民勤县的河北杨、旱柳、红瑞木、国槐以及凉州区的旱柳腐烂病标本上均分离出了臭椿壳囊孢。在凉州区的小叶杨、黑杨、新疆杨、核桃上均分离出了拟国槐壳囊孢。由此可知臭椿壳囊孢C.ailanthicola的扩散和蔓延是导致武威市林木腐烂病的重要因素，民勤县尤为严重。而凉州区的林木腐烂病则主要由拟国槐壳囊孢引起。在武威市由壳囊孢属引起的病害防治工作中，可以尝试使用戊唑醇膏剂等^［23］。

本次调查中在国槐、核桃、臭椿、白蜡和侧柏5种寄主的枝枯病标本上均分离到非洲小单孢腔菌。该种于2014年在非洲纳米比亚的豆科植物香花儿茶上首次被发现，孢子大小12.5~16 μm× 6.5~10 μm，与本研究中在中国发现的该种孢子大小区间重叠^［24］。这是该种首次在亚洲被发现，目前还没有对其致病性进行探索。因此，该种在我国的地理分布、寄主范围、致病性强弱都还存在着一定的探索空间。

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基金资助

武威市国家杨树樟子松良种基地良种补贴项目

2023年中央财政林业科技推广示范项目“西北寒旱地区优良月季引种繁育及栽培技术推广示范项目”(2023ZYTG011)

2022年甘肃省林业和草原科技项目“毛条种质资源收集评价及良种选育和示范推广”(2022kj015)

2022年武威市科技重点研发项目“市花月季优良品种选育和高效栽培管理技术研究”(WW2201YFN009)