洮河流域一种野生侧耳分离鉴定及其生物学特性

Isolation and identification of a wild Pleurotus species from the Taohe River Basin and its biological characteristics

摘要

目的 探究侧耳属木腐真菌的生物学特性及最佳栽培条件。 方法 以甘南藏族自治州洮河国家级自然保护区的一种野生侧耳属木腐真菌为试验材料，采用组织分离法，分离纯化野生侧耳，获得菌丝体纯培养物，基于形态学和分子生物学方法对其进行分类学研究，并对其进行生物学特性研究。 结果 经鉴定，该野生侧耳为冷杉侧耳（Pleurotus abieticoa）。菌丝体在15、20、25、30 ℃下均能正常生长，其中25 ℃生长最佳；在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0中均能生长，最适pH为7.0；在供试碳源中，菌丝体在玉米淀粉中生长最快，乳糖中生长最慢；在供试氮源中，蛋白胨中生长最适，尿素中停止生长。 结论 该菌种的最适培养温度为25 ℃，最适pH为7.0，最佳碳源为玉米淀粉，最佳氮源为蛋白胨。

Abstract

Objective To study the biological characteristics and the best cultivation conditions of Pleurotus. Method In this study，a wood-decaying fungus of Pleurotus collected from the Taohe National Nature Reserve of Gannan Tibetan Autonomous Prefecture was used as the test material.The pure culture was isolated by tissue separation，and the biological characteristics were studied. Result The fungus was identified as Pleurotusabieticoa and the mycelium was able to grow normally at the test temperature，and the most suitable being 25 ℃.It can also grow in the test pH，of which the optimum pH is 7.0.The fungus grows corn starch grows fastest and lactose grows slowest in the test carbon source.Peptone is the most suitable for the growth of the test nitrogen source mycelium，urea does not grow in the test nitrogen source. Conclusion The optimum culture temperature of this species was 25 ℃，the optimum pH was 7.0，the best carbon source was corn starch，and the best nitrogen source was protein.

Graphical abstract

关键词

侧耳属 / 组织分离 / 形态学 / 分子生物学 / 生物学特性

Key words

Pleurotus / tissue isolation / morphology / molecular biology / biological characteristics

Author summay

陈炳，林业工程师，从事森林资源保护与利用。E-mail：[e-mail]

侧耳属（Pleurotus （Fr.） P.Kumm.）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、伞菌目（Agaricales）、侧耳科（Pleurotaceae），是一类具食药用价值的经济类木腐真菌^［1-2］。其中包括我国栽培面积最大的食用菌糙皮侧耳（P.ostreatus）、人工栽培平菇的近缘品种肺形侧耳（P.pulmonarius）、具有食药用双重价值的盖囊侧耳（P.cystidiosus）以及具有潜在药用价值的金顶侧耳（P.citrinopileatus）、刺芹侧耳（P.eryngii）和紫孢侧耳（P.sapidus）等^［2-9］。侧耳属真菌不仅有食用菌，有些还是引起立木和木材腐朽的林木病原真菌。它们能引起林木病害，造成林业生产上的损失。侧耳属也有部分真菌参与森林生态系统的物质循环，促进林木的新陈代谢^［9-11］。如糙皮侧耳和刺芹侧耳是一类具有高效降解木质纤维素能力的白腐菌，它们广泛存在于各种枯死的树干、倒木及人工木制品上，通过分泌产生各种生物酶，降解木材中的纤维素、半纤维素和木质素，以及降解人工染料和分解污水中的有害物质等多种重要的应用价值。侧耳属真菌子实体普遍含有膳食纤维，在糙皮侧耳中含量是10.21%，在肺形侧耳中含量是14.7%，在刺芹侧耳中含量是28.29%。在侧耳属子实体膳食纤维中，枝状的β-葡聚糖是主要化学成分，具有很好的生理功能和营养价值。侧耳属子实体中虽然脂类含量较低，但是能够提供亚油酸和油酸等不饱和脂肪酸，以及极低密度的脂蛋白，有助于降低人体中的胆固醇含量。此外，侧耳属物种还含有三萜、醇类和酚类，以及锌、铜、碘、硒和铁等矿物质元素，这些都是有益于人体健康的成分^{［1，2，5，7，12］}。另外部分侧耳属真菌在林业生态保护和病害防治中也充当重要角色，部分真菌还具有专性产毒能力，在林业线虫病害防治中起着关键作用，它更是森林生态系统中重要的分解者，侧耳属真菌多数为木腐真菌，在分解枯枝和倒木以及参与森林生态系统的能量循环流动中都具有积极效应，该属真菌在维持森林生态平衡，促进森林生态环境修复中具有重要作用^［9］。

随着经济稳步发展，食用菌产业逐渐在农业生产中占据了不可或缺的地位。野生食用菌味道鲜美营养丰富，子实体含有丰富的蛋白质和维生素。大多数野生食用菌具有重要的市场潜力。甘南山区是甘肃省森林植被覆盖面积较大、树种和经济林资源较为丰富的地区，甘南山区气候湿润，具有丰富的真菌及麦草、玉米秸秆资源，适合木腐类等多种食用菌的栽培，但当地黄土高原区食用菌产业起步晚、发展慢、规模小、技术相对比较落后，栽培种类较少^［13］。

试验所用样品均采自甘肃省甘南藏族自治州洮河国家级自然保护区内的针叶林中，经过子实体组织分离获得菌丝体纯培养物，在实验室对标本进行鉴定和基础生物学特性研究，为甘肃省本土森林野生菌物资源的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本次试验所用野生侧耳子实体于2022年7月采自甘南藏族自治州卓尼县洮河国家级自然保护区大峪沟国家森林公园。

1.2 分离与培养

采用组织分离法分离纯化获得菌丝体纯培养物，选用PDA培养基在25 ℃下暗光培养。

1.3 形态学鉴定

1.3.1 宏观形态观察

在野外对其形态特征进行观察，如菌盖的颜色、形状、大小、表面是否光滑，菌盖及菌肉的厚度、菌褶形态以及菌盖和菌柄的着生关系，菌柄的长度、粗细和着生方式，菌环、菌托的有无等^［13-16］。

1.3.2 微观形态观察

将菌株子实体切片制作临时玻片，以3% KOH和2% Phloxine b作为浮载液，在光学显微镜下观察担子、担孢子、菌丝等微观形态并用测微尺测量担孢子大小^［14-16］。

1.4 系统发育分析

1.4.1 DNA提取

从采集并烘干的子实体上刮取适量粉末并放入灭菌的研钵中，加入液氮研磨后放入离心管中，用DNA提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）根据使用说明提取子实体和菌丝体DNA。

1.4.2 ITS基因扩增

选择通用引物ITS（ITS5和ITS4）进行PCR扩增。扩增体系为20 µL，含1 µL模板，9.5 µL mix，引物ITS（ITS5和ITS4）各加1 µL，最后加ddH₂O到20 µL。扩增程序为95 ℃预变性3 min；34个循环，94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃，60 s，72 ℃延伸10 min，4 ℃，保存。最终将纯化后的PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.4.3 构建系统发育树

将测得的序列进行Blast同源性比对，同时在NCBI数据库下载侧耳属相关物种序列构建系统发育树。使用MAFFT软件进行比对，使用BioEdit软件进行剪齐，Mesquite校正并进行格式转换，通过MrBayes软件构建系统发育树。

1.5 生物学特性试验

1.5.1 温度对菌丝体生长的影响

菌饼统一使用5 mm打孔器在纯化后的菌丝培养基上打孔获得，将菌饼接种在PDA培养基的中央，然后分别放置在15、20、25、30 ℃的条件下暗光培养，每个温度处理重复3次，并用十字划线法测量和记录菌丝在不同温度下的日生长速率^［2，4］。

1.5.2 pH对菌丝生长的影响

探究菌丝在不同pH下的日生长速率时，以PDA培养基为基础培养基，滴加1 mol/L HCl和2 mol/L NaOH溶液并使用pH计测量pH值，配制不同pH的培养基，pH值梯度为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。试验方法同1.5.1^［2，4］。

1.5.3 碳源对菌丝体生长的影响

探究菌丝在不同氮源下的日生长速率时，将不添加任何碳源的培养基设置为空白对照，用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、麦芽糖作为试验碳源，进行碳源培养基的制作。每种培养基中添加试验碳源40 g，琼脂40 g，蛋白胨4 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄ 1 g，GaCl₂ 1 g，硫胺素20 mg，加蒸馏水定容至2 L，试验方法同1.5.1^［2，4］。

1.5.4 氮源对菌丝体生长的影响

探究菌丝在不同氮源下的日生长速率时，将不添加任何氮源的培养基设置为空白对照，用尿素、牛肉膏、酵母浸粉、蛋白胨作为试验氮源，进行氮源培养基的制作。每种培养基中添加试验氮源4 g，琼脂40 g，葡萄糖40 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄ 1 g，GaCl₂ 1 g，硫胺素20 mg，加蒸馏水定容至2 L。试验方法同1.5.1^［2，4］。

1.6 数据分析

数据经过 Excel 初步处理后，通过 SPSS 软件采用Duncan多重比较法对所得数据进行差异显著性统计分析，制作菌丝平均生长速率柱状图。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

2.1.1 形态学特征

野生侧耳子实体小至中型，长0.5~6.4 cm，宽1.9~5.3 cm，侧生，呈现扇形或贝壳形。菌盖表面光滑但不平整，稍具沟壑，野生子实体一般为黄褐色，有些呈灰白色并带有褐色条纹。菌盖边缘向内弯曲，菌肉呈白色，稍具韧性，从远柄到近柄处逐渐增厚（图1-A~B）。

担孢子长7.0~8.0 µm，宽3.0~4.0 µm，椭球形或球形，外壁薄而光滑，易被染色剂染色。担子呈棍棒状或宽棒状，末梢具4小梗。菌丝无色透明，宽棒状或棒状，锁状联合丰富，多具分支，宽5.0~10.0 µm（图1-C~D）。

2.1.2 ITS系统发育分析

ITS测序结果在Blast进行同源性比对，与前几个已经鉴定为冷杉侧耳的序列的同源性较高，最高达99.68%。从NCBI数据库下载该属真菌的其他序列使用贝叶斯法构建系统发育树。由图2可知，野生侧耳的子实体（FLF259）和菌株（WBY07）与已报道的冷杉侧耳聚在同一个分支，且具有较高的支持率，将该菌株鉴定为冷杉侧耳Pleurotus abieticola。

2.2 生物学特性分析

2.2.1 温度对菌丝生长影响

冷杉侧耳菌丝在4个温度环境中均可以生长，菌丝在不同温度梯度中生长速率差异显著。在25 ℃培养条件下，菌丝生长速率较其他温度更快；当培养温度环境为15 ℃时，菌丝生长速率较慢；在培养温度为30 ℃时，菌丝体生长较25 ℃有所减缓（表1）。综合分析菌丝在25 ℃左右生长最为适宜。

2.2.2 pH对菌丝生长影响

冷杉侧耳菌丝在供试的5种pH梯度中均可以生长，综合菌落生长速率的统计图和菌丝长势，可得出当pH梯度为7.0时，菌丝日生长速率最优；在pH梯度为9.0和5.0中，菌丝日生长速率较7.0时稍慢，且二者差异不显著；当pH梯度为8.0和6.0时，菌丝生长速度较为适中（表2），由此可见冷杉侧耳菌丝生长最适pH为7.0。

2.2.3 碳源对菌丝生长影响

冷杉侧耳菌丝在4种供试碳源中均可以生长。试验结果表明，当以玉米淀粉作为供试碳源，菌丝在培养基上生长速度最快；麦芽糖、蔗糖、碳源对照培养基上菌丝生长速率差距不大；当供试碳源为乳糖培养时，菌丝生长速率最慢（表3）。综合菌丝生长速率统计图和菌落生长状况，分析得到菌丝在玉米淀粉培养基上生长最佳。

2.2.4 氮源对菌丝生长的影响

冷杉侧耳菌丝在4种供试氮源中生长差异显著，试验观测期间在氮源为尿素的培养基中菌丝不生长，不加氮源作为对照培养基中菌丝长势非常缓慢；在其余3种供试氮源中均能生长。在以牛肉膏和酵母浸粉作为氮源时，菌丝生长较供试氮源为蛋白胨的培养基中较慢，但二者差异并不显著；当蛋白胨作为供试氮源的培养基时，冷杉侧耳菌丝生长速度最快（表4），故蛋白胨为冷杉侧耳菌丝最适生长氮源。

3 讨论

传统分类学对木腐真菌的鉴定主要是基于形态学特征进行鉴定，但是当越来越多的真菌被发现并报道后，很多近缘种和相似种之间，宏观形态就很难进行区分，后来随着分子生物学技术在大型真菌分离鉴定中的应用。真菌分类学家发现当鉴定物种的rDNA的ITS序列与已知种的相似程度≥99%，即可鉴定其为同一物种。所以目前多采用形态学和分子生物学相结合的方法来进行真菌的分类鉴定。本试验基于形态学及分子生物学方法对洮河国家级自然保护区野生侧耳属标本进行鉴定，经过形态学鉴定发现采集的标本与以往报道的侧耳属真菌种类特征相似，并将野生侧耳标本进行分子生物学鉴定，发现ITS测序结果在Blast进行同源性比对后与冷杉侧耳的序列的同源性较高，最高达到99.68%。系统发育分析结果显示野生侧耳子实体和菌株与冷杉侧耳已报道的冷杉侧耳聚在同一个分支且支持率较高，结合形态特征与分子生物学方法最终将其鉴定为冷杉侧耳（P. abieticola）。

目前多数野生菌株不同物种之间甚至同一物种不同菌株之间在生长发育过程中所需要的营养条件和生存环境都具有较大的差异^［2］。同一物种所需的环境温度和营养条件在不同地区可能差异较大，所以本试验对采自甘南藏族自治州卓尼县洮河国家级自然保护区大峪沟国家森林公园的野生冷杉侧耳进行了菌丝阶段生物学特性研究，发现冷杉侧耳菌丝为白色菌落齐整或呈放射状，记录菌丝生长过程中，还发现菌丝在培养基中伴随着试验天数的增加而逐渐产生色素，菌丝分泌色素的能力在逐渐靠近接种块时变强，后期培养基接种菌块处菌种老化呈黄褐色。

洮河国家级自然保护区平均气温在20~28 ℃，在试验环境中菌丝生长的适宜温度范围为20~30 ℃，最适温度为25 ℃，在25 ℃下生长速率达到最大为5.95。试验过程观察到，冷杉侧耳菌丝体的生长在15~20 ℃下稍有减缓，但菌丝长势较25 ℃更为浓密。在试验提供的5种pH梯度中均可生长，对比几种不同pH培养基中菌丝生长差异显著，对试验数据进行统计分析，可得冷杉侧耳菌丝在pH为7.0时生长最适，其中生长速率为5.05 mm/d。野生菌绝大多数都为嗜弱酸性菌，但研究结果发现野生冷杉侧耳菌丝体在中性环境中生长最佳，当培养基中酸碱度变化时，都会抑制菌丝体的生长，造成这种现象的部分原因可能是配制的溶液在灭菌后PH会有所变化。对比冷杉侧耳菌丝在试验温度和不同pH条件下的日生长速率，可知冷杉侧耳和大多数侧耳属真菌相同，最适生长温度为25 ℃，最适pH为7.0^{［2，4-5，7-8］}。

冷杉侧耳菌丝在供试碳源培养基上均可生长，最适碳源为玉米淀粉，可能是由于冷杉侧耳在分解玉米淀粉过程中会产生与吸收相作用的活性物质，促进菌丝快速吸收营养，故而菌丝生长速度较其他供试碳源更快。虽然冷杉侧耳菌丝在玉米淀粉作为供试碳源的培养基上菌丝生长速度较快，达5.95 mm/d，但菌丝没有在麦芽糖和蔗糖培养基上粗壮、整齐。在几种供试氮源中，菌丝体在蛋白胨上生长最为适宜，在牛肉膏和蛋白胨作为供试氮源时菌丝体生长差异不显著。在氮源对照中菌丝体因缺少氮源生长发育十分缓慢，而在尿素作为供试氮源的培养基中则完全抑制冷杉侧耳菌丝的生长。对多数食药用菌来说比较容易利用有机氮，本次试验也验证了冷杉侧耳菌丝在生长发育过程中对氮源的需求较为重要，菌株在其他3种氮源培养基上最适生长速率为5.07 mm/d比生长速率为0.36 mm/d的尿素培养基上明显较好。对比冷杉侧耳菌丝生长的碳源、氮源对照，表明菌丝在生长发育过程中对氮元素的需求量较大，因此在进行冷杉侧耳菌种的驯化栽培时应该多添加麦麸、玉米淀粉等含氮量大的营养物质调整到适宜的碳氮比，以满足冷杉侧耳菌丝生长发育的需要，更快培育健壮菌丝。

4 结论

本研究主要用传统形态学鉴定结合分子生物学方法，确定了采自甘南藏族自治州洮河国家级自然保护区的野生侧耳菌种为冷杉侧耳，在生物学特性的研究中发现，该菌种的最适培养温度为25 ℃，最适pH为7.0，最佳碳源为玉米淀粉，最佳氮源为蛋白胨。而且冷杉侧耳作为一种具有良好开发前景的食药用真菌，具有重要的开发利用价值，如进行冷杉侧耳栽培技术以及它的药理学研究等，本研究可为当地野生菌资源合理开发和可持续利用提供参考。

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基金资助

甘肃农业大学人才引进科研启动基金项目(GAU-KYQD-2021-26)

甘肃省高校青年博士基金项目(2022QB-080)