5株外源嗜热固氮菌对堆肥碳氮损失及其细菌群落的影响

Effects of 5 strains of exogenous thermophilic nitrogen-fixing bacteria on carbon and nitrogen losses and bacterial community in composting

摘要

目的 减少堆肥过程中碳氮损失，提高堆肥质量。 方法 本研究通过添加5株外源嗜热固氮菌株，设置6个处理分别为：CK（不添加外源固氮菌） 、A₁（根癌异根瘤菌）、A₂（亮杆菌）、A₃ （头状葡萄菌）、B₁（液化沙雷菌）和B₂（蜡样芽孢杆菌）进行堆肥，研究外源嗜热固氮菌对堆肥碳氮损失、养分含量和细菌微生物群落的影响。 结果 5株外源嗜热固氮菌均减少了堆肥中碳氮损失，提高了养分含量。A₁、A₂、A₃、B₁、 B₂与CK相比碳氮损失分别减少了38.74%、26.99%、33.09%、28.75%、34.35%和25.23%、11.20%、22.58%、20.77%、20.51%，氮含量增加了279.15%、42.74%、344.31%、277.51%、1.42%；磷含量增加了49.21%、16.19%、51.33%、24.26%、58.90%；全钾含量增加了27.76%、17.41%、16.35%、11.80%、29.12%；有机质增加了31.41%、20.56%、27.15%、30.19%、26.61%，总体上A₁>A₃>B₁>A₂>B₂。细菌群落结构演替表明，A₁和B₁菌株的丰度在堆肥过程中始终高于对照处理。外源固氮菌均显著提高了堆肥中土著固氮细菌Pseudomonas（假单胞菌属），Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）、Saccharomonospora（糖单孢菌属）、Planifilum（直丝菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）等的相对丰度，降低具有反硝化能力的Acinetobacter（不动杆菌属）、Corynebacterium（棒状杆菌属）和Halomonas（盐单胞菌属）等的丰度。KEGG分析表明，外源固氮菌剂影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢和次生代谢产物的生物合成功能基因。 结论 A₁和B₁菌株能够较好地在堆肥中定殖，具有开发固氮菌生物有机肥的潜力；添加外源固氮菌均可通过影响优势微生物群落及氨基酸代谢、碳水化合物代谢等功能基因抑制堆肥过程中的碳氮代谢，提高养分含量，减少堆肥过程中碳氮损失。

Abstract

Objective To reduce the loss of carbon and nitrogen during composting and improve the quality of the compost. Method This study investigated the effects of 5 strains of exogenous thermophilic nitrogen-fixing bacteria on carbon and nitrogen losses，nutrient content and the bacterial microbial community of composting using 6 treatments: CK (without exogenous nitrogen-fixing bacteria)，A₁ (Allorhizobium tumefaciens)，A₂ (Leucobacter sp.4J7B1)，A₃ (Staphylococcus capitis)，B₁ (Serratia liquefaciens) and B₂ (Bacillus cereus). Result 5 strains of exogenous thermophilic nitrogen-fixing bacteria reduced the carbon and nitrogen losses in compost and increased the nutrient content.A₁，A₂，A₃，B₁，B₂ compared with the control，the losses of carbon and nitrogen decreased by 38.74%，26.99%，33.09，28.75，32.25% and 25.33%，11.20%，22.25%，20.77%，20.51%，respectively; the nitrogen content increased by 279.15%，42.74%，344.31%，277.51%，1.42%; phosphorus increased by 49.21%，16.19%，51.33%，242.26%，58.90%; potassium increased by 27.76%，17.14%，15.36%，11.80%，29.12%; and organic matter increased by 31.41%，20.56%，27.15%，30.19%，25.61%.In general，A₁>A₃>B₁>A₂>B₂.The succession of the bacterial community showed that the abundance of A₁ and B₁ strains was always higher than that of the control.Exogenous nitrogen-fixing bacterial agents significantly increased the relative abundance of indigenous nitrogen-fixing bacteria in composting，such as Pseudomonas，Sphingobacterium，Saccharomonospora，Planifilum and Bacillus，and decreased the relative abundance of denitrifying bacteria，such as Acinetobacter，Corynebacterium and Halomonas.KEGG analysis showed that exogenous nitrogen-fixing bacteria affected functional genes involved in amino acid metabolism，carbohydrate metabolism and biosynthesis of secondary metabolite biosynthesis. Conclusion It can be seen that A₁ and B₁ strains can colonize well in composting，which has the potential to develop nitrogen-fixing bacteria as bioorganic fertilizer.The addition of exogenous nitrogen-fixing bacteria can inhibit carbon and nitrogen metabolism during composting by influencing dominant microbial communities and functional genes such as amino acid metabolism and carbohydrate metabolism，improve nutrient content and reduce carbon and nitrogen loss during composting.

Graphical abstract

关键词

堆肥 / 外源嗜热固氮菌 / 碳氮损失 / 细菌群落

Key words

composting / exogenous thermophilic nitrogen-fixing bacteria / C and N losses / bacterial community

Author summay

杨迎香，硕士生研究生。E-mail：[e-mail]

堆肥过程中的碳氮损失是不可避免的。研究证实，堆肥期间有机碳损失率约为31%~68%^［1］，因CO₂释放造成的碳损失约占原料总碳（TC）的31.4%~57.9%^［2-5］；氮损失约为13%~78%，其中NH₃挥发导致的氮素损失可达总氮损失的32.3%~50.0%^［6-8］。大量的碳氮损失不仅直接影响微生物的新陈代谢和有机肥的品质^［9-10］，还会造成温室效应和大气污染等环境二次污染问题^［11-12］。因此，减少堆肥过程中碳氮损失对减少堆肥环境的二次污染问题，提高堆肥质量具有重要意义。

为了减少堆肥过程中的碳氮损失，国内外针对堆肥氮素损失途径、机理以及氮素保留技术已经开展了大量的研究^［13］，对于氮素损失控制技术主要集中在调节原料C/N、通风与控制氧气供应、接种微生物菌剂、添加物理吸附剂和化学添加剂等^［14-17］。外源微生物菌剂对提高微生物活性、缩短堆肥周期，保持堆肥养分和加快肥料腐熟具有重要意义^［18-19］。固氮菌剂作为微生物菌剂的主力军在提高堆肥肥效和品质方面具有重要作用^［20-21］。然而，传统的筛选于土壤和植物根系的固氮菌的自生固氮效率较低，且很难定殖于堆肥过程的高温环境，而来自于高温堆肥中的固氮菌由于其已经驯化适应了堆肥的高温过程，所以能够更好地适应堆肥环境。

因此，本研究以羊粪和玉米秸秆为原料，分别接种筛选于堆肥的单一嗜热固氮菌剂进行好氧堆肥试验，探讨不同外源嗜热固氮菌剂对提高堆肥养分含量和减少碳氮损失的作用；并使用16S rRNA基因组测序来表征堆肥过程中微生物群落的演替，研究固氮菌株在堆肥过程中的定殖效果和微生物群落的演替过程，明确不同外源嗜热固氮菌的作用机理，为固氮菌微生物有机肥的研制提供优良菌种和技术支持。

1 材料与方法

1.1 堆肥材料

以羊粪为主料，玉米秸秆为辅料，玉米秸秆粉碎至1 cm左右，原料主要性质见表1。堆肥用嗜热固氮菌由本实验室分离筛选，5株嗜热固氮菌分别为：根癌异根瘤菌（Allorhizobium tumefaciens）、亮杆菌（Leucobacter sp.4J7B1）、头状葡萄菌（Staphylococcus capitis）、液化沙雷菌（Serratia liquefaciens）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。

1.2 堆肥过程和样品采集

试验设置6个处理，分别为CK（未接种固氮菌的液体培养基）、A₁（根癌异根瘤菌）、A₂（亮杆菌）、A₃（头状葡萄菌）、B₁（液化沙雷菌）和B₂（蜡样芽孢杆菌）。将培养到10⁹ CFU的菌液按照10%（v/m）加入堆肥原料中（羊粪用玉米秸秆调节到C/N 25∶1，含水量（60±1）%，充分混匀，装箱至60 cm×60 cm×45 cm的泡沫箱中敞口放置在校园带彩钢板顶的室外进行堆肥，堆肥时间为2021年8月28日~9月15日。每个处理重复3次，所有堆肥箱每3 d翻堆一次，翻堆前、后称质量，记录堆肥箱质量。分别于第1、4、7、10、13、16、和19天翻堆并采集样品，采样之前先放到塑料布上翻堆，充分混匀并铺平，多点取样混合。每份样品均分为3份，一份保存于4 ℃冰箱中用于测定pH、电导率（EC）和种子发芽指数（GI）；一份风干、粉碎过0.1 mm筛用于测定全氮、全磷、全钾和有机质含量；一份保存于-80 ℃冰箱中用于16S rRNA基因测序。根据温度的测定数据，选择第1天（初始期）、第4天（高温期）和第19天（腐熟期）将样品送至北京百迈客生物技术有限公司进行基因测序。

1.3 理化指标测定

每天9∶00和15∶00分别用温度计记录堆箱中心温度，堆肥温度取两次的平均值。取各堆肥样品5.00 g与蒸馏水按1∶10的比例充分混匀，于摇床摇2 h之后过滤，过滤到离心管后配平，再用转速为5 000 r/min的离心机离心5 min，然后吸取5 mL上清液加入已铺有滤纸的培养皿中，在滤纸上整齐摆放大小、形状相似的小白菜种子30 粒，同时用蒸馏水设置空白对照试验，将放好种子的培养皿放入25 ℃的培养箱中培养2 d后，取出计算每个培养皿中种子的发芽率，小白菜种子的根长用游标卡尺来测量，根据公式计算发芽指数^［22］。

GI（%）=\frac{\mathrm{处理}\mathrm{种子}\mathrm{发芽}\mathrm{率}(\mathrm{\%})\times \mathrm{处理}\mathrm{根长}(\mathrm{c}\mathrm{m})}{\mathrm{对照}\mathrm{种子}\mathrm{发芽}\mathrm{率}(\mathrm{\%})\times \mathrm{对照}\mathrm{根长}(\mathrm{c}\mathrm{m})}×100%

同时利用上述所制备的待测液，用pH计和电导率仪分别测定pH和EC。

全氮（TN）采用凯氏定氮法测定；全磷（TP）用吸光光度法测定；全钾（TK）用火焰光度法测定；有机质（OM）采用重铬酸钾容量法，具体方法参照有机肥料行业标准（NY/T525-2021）^［23］，氮损失（N-loss）、碳损失（C-loss）按照下式计算^［22］。

N-loss_（i）=［PM_i+1×（1-MC_i+1）×TN_i+1-PM_i×（1-MC_i）×TN_i］/TN_intiai

C-loss_（i）=［PM_i+1×（1-MC_i+1）×TOC_i+1-PM_i×（1-MC_i ） ×TOC_i ］/TOC_intiai

式中：PM为堆体质量（kg），MC为含水量，TN为全氮含量（g/kg），TOC为总有机碳含量（g/kg），i代表采样次数。

1.4 堆肥样品DNA提取和16S rRNA基因测序

样品采集完成后送至北京百迈客生物技术有限公司进行16S rRNA基因测序（仅第1、4、和19天样品用于测序，分别代表堆肥初始阶段I、高温阶段H、和腐熟阶段M），DNA提取和16S rRNA基因测序分析按照Zhang等^［22］的方法进行。

1.5 数据处理

用Excel 2019进行折线图绘制，用百迈客生物云计算平台（BMKCloud）内置R语言工具绘制物种组成柱状图，使用PICRUSt软件进行KEGG代谢途径的差异分析。

2 结果与分析

2.1 菌株对堆肥腐熟相关指标的影响

堆肥腐熟度相关指标如图1所示。6个处理堆肥温度在第2天均达到高温期（T>50 ℃），其中CK、A₁和A₂处理在第二天达到最高温度，分别为71.0、70.3和70.5 ℃，A₃、B₁和B₂处理在第3天达到最高温度，分别为67.2、67.2和72.0 ℃。除B₂处理在50 ℃以上持续的时间为5 d外，其余处理都为7 d（图1-A）。

6个处理的pH值均呈现出先增大后减小的趋势（图1-B），高温期迅速升高，最高pH值达到8.81，至堆肥结束后，分别降为8.35、8.36、8.27、7.96、7.89和8.43。GI先减小后增大（图1-C），在第3天下降到最低，然后逐渐升高，直到堆肥结束均达到80%以上。EC是评价堆肥质量的指标之一，EC表现为先升高后略有下降的趋势，前期EC升高可能是由于微生物代谢活动从有机物中释放出大量可溶性盐，使得堆体EC升高，后期随着堆肥进程，各种离子又在微生物的作用下逐渐形成稳定的腐殖质，堆体的EC降低，堆肥结束时均低于4 mS/cm（图1-D）。

2.2 菌株对氮、磷、钾、有机质含量和碳、氮损失的影响

6个处理的堆肥总含氮量呈现先下降后升高再趋于平稳的态势（图2-A），这主要可能是堆肥前期大量含氮有机物被微生物降解成铵，并以氨的形式挥发造成损失，而后随着堆肥浓缩效应和固氮菌的固氮，导致后期全氮上升。外源嗜热固氮菌显著提高了堆肥的含氮量，至堆肥结束，各处理的含氮量分别比CK增加了279.15%、42.74%、344.31%、277.51%和1.42%。全磷和全钾的含量呈增加趋势（图2-B，2-C），堆肥结束时A₁、A₂、A₃、B₁、B₂处理的全磷和全钾含量分别比CK增加了49.21%、16.19%、51.33%、24.26%、58.90%和27.76%、17.41%、15.36%、11.80%、29.12%。6个处理有机质总体呈下降趋势（图2-D），但外源嗜热固氮菌显著提高了堆肥中有机质含量。堆肥结束时，各处理腐熟期有机质含量分别比CK增加了31.41%、20.56%、27.15%、30.19%、25.61%。

碳、氮损失会严重影响堆肥质量。CK、A₁、A₂、A₃、B₁、B₂处理的累积碳、氮损失分别为16.48%、10.09%、12.03%、11.03%、11.74%、10.82%和20.09%、15.02%、17.84%、15.55%、15.91%、15.97%。相对于CK，A₁、A₂、A₃、B₁和B₂处理的碳、氮损失分别减少了38.74%、26.99%、33.09%、28.75%、34.35%和25.23%、11.20%、22.58%、20.77%、20.51%，这与堆肥中固氮菌丰度和活性密切相关，说明添加固氮菌剂有利于减少碳氮损失。

2.3 菌株对堆肥中细菌群落结构演替的影响

外源固氮菌株能否在堆肥中成功定殖对于外源菌株的实际应用具有重要意义。A₁和B₁菌株的丰度在处理中均高于CK，而B₂菌株在处理中略低于对照，A₂和A₃菌株在属水平未检测到（图3）。

外源菌剂的作用不仅体现在其自身定殖效果，更体现在和土著微生物间的相互作用。各处理在3个阶段属水平上的微生物群演替如图3所示。堆肥初始期（I），6个处理丰度前15的属中有8种是相同的，且6个处理中相对丰度最高的均是Pseudomonas（假单胞菌属），A₁、A₂、A₃、B₂处理中该菌属的丰度均高于CK处理，外源固氮菌剂的添加促进了Cellvibrio（纤维弧菌属）的生长，抑制了Acinetobacter（不动杆菌属）的生长。

堆肥高温期（H），CK处理丰度前3的属分别是：Bacillus（芽孢杆菌属，21.66%）、Halocella（盐孢菌属，6.60%）、Planifilum（直丝菌属，6.30%）；A₁处理丰度前三的属分别是芽孢杆菌属（13.28%）、假单胞菌属（10.51%）、盐孢菌属（6.02%）；A₂处理丰度前三的属分别是芽孢杆菌属（12.45%）、盐孢菌属（10.69%）、假单胞菌属（7.15%）；A₃处理丰度前三的属分别是盐孢菌属（6.77%）、芽孢杆菌属（6.01%）、Thermobacillus（热芽孢杆菌属，4.89%）；B₁处理丰度前三的属分别是芽孢杆菌属（10.99%）、unclassified_Bacillaceae（4.98%）、盐孢菌属（4.38%）；B₂处理丰度前三的属分别是芽孢杆菌属（13.59%）、假单胞菌属（6.09%）、盐孢菌属（5.30%）。初始阶段相对丰度低于0.2%的芽孢杆菌属迅速上升，除A₃处理外，芽孢杆菌属成为其他5组处理的最优势菌属，A₃处理中为第二优势菌属。同样在6个处理中相对丰度在0.1%左右甚至更低的Saccharomonospora（糖单孢菌属）的相对丰度也上升至1.6%~3.6%，B₂处理中丰度最高。外源固氮菌剂的添加显著提高了Sphingobacterium（鞘氨醇杆菌属）的丰度，抑制了Corynebacterium（棒状杆菌属）的生长。

堆肥腐熟期（M），CK处理中unclassified_Fodinicurvataceae（12.47%）、鞘氨醇杆菌属（11.19%）、Halomonas（盐单胞菌属）（5.73%）位于丰度前三位；A₁处理中unclassified_Fodinicurvataceae（14.88%）、鞘氨醇杆菌属（7.04%）、芽孢杆菌属（6.97%）位于丰度前三位；A₂处理中unclassified_Fodinicurvataceae（11.72%）、糖单孢菌属（7.06%）、芽孢杆菌属（6.11%）位于丰度前三位；A₃处理中unclassified_Fodinicurvataceae（14.76%）、unclassified_ Sphingomonadaceae（5.97%）、Parapedobacter（类土地杆菌属）（5.53%）位于丰度前三位；B₁处理中unclassified_Fodinicurvataceae（14.74%）、鞘氨醇杆菌属（7.98%）、糖单孢菌属（6.87%）位于丰度前三位；B₂处理中糖单孢菌属（11.64%）、unclassified_Fodinicurvataceae（10.95%）、鞘氨醇杆菌属（9.07%）位于丰度前三位。与CK处理相比，外源固氮菌剂的添加降低了盐单胞菌属丰度。

2.4 KEGG差异性分析

通过KEGG代谢途径的差异分析，可以观测不同分组的样品之间微生物群落的功能基因在代谢途径上的差异和变化，是研究群落样本为适应环境变化发生的代谢功能改变的有效手段^［24］。如图4所示，外源固氮菌剂改变了优势微生物群落的功能基因，CK处理的氨基酸代谢（Amino acid metabolism）和碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism）均大于其他5个处理，而外源固氮菌显著提高了次级代谢产物的生物合成（Biosynthesis of other secondary metabolites）功能。

3 讨论

温度是直接反映堆肥发酵效果及微生物活性的重要指标^［25］，显著影响堆肥过程中有机物质的降解和微生物群落结构的演替^［26］，本研究6个处理均达到了50 ℃以上保持5~7 d的堆肥卫生指标和堆肥腐熟要求^［27］。微生物的分解活动会影响堆肥pH值的变化，过酸或过碱都会影响堆肥腐熟过程^［28］，本研究各处理pH值先增大后减小，可能是由于高温期氨的大量释放，导致堆肥初期pH值快速升高，随着氨的挥发和有机酸的大量产生，后期pH值呈下降趋势^［29］，堆肥结束时满足pH值在8.0~9.0左右的堆肥腐熟标准^［30］。GI是综合评价堆肥腐熟度的生物指标^［31］，各处理在堆肥结束均达到80%以上的腐熟标准^［32］，电导率（EC）通常与堆肥可溶性盐有关^［33］，是评价堆肥腐熟的重要指标^［34］，本研究6个处理的最终EC值均低于4 mS/cm 的腐熟堆肥标准^［35］。由以上参数可知，6 个处理均达到了腐熟堆肥的标准。

堆肥过程中有机物的降解和转化显著影响养分和有机质含量，以及碳氮损失^［17］。外源固氮菌显著减少了堆肥中碳氮损失，提高了养分含量，但B₂处理含氮量较CK 没有显著变化，且A₂和A₃ 处理在属水平未检测到。由此说明，外源固氮菌剂添加到堆肥中的定殖和演替是一个复杂的过程，即使是筛选于堆肥的固氮菌由于堆肥过程中堆肥原料性质差异和土著微生物种群的竞争而影响外源固氮菌的定殖和活性^［36］；同时，也可能由于检测技术的精度也影响了菌株在堆肥中的检出效率。

属水平上的细菌种类及相对丰度更能反映堆肥中微生物群落结构的变化^［37］，本研究表明，添加外源固氮菌促进了堆肥不同阶段假单胞菌属、纤维弧菌属、芽孢杆菌属、糖单孢菌属、直丝菌属、鞘氨醇杆菌属和类土地杆菌属等的生长。假单胞菌属有固氮能力^［38］，与铵氮、生物可利用有机氮和氨基酸态氮呈显著相关^［39］，具有强烈的氧化能力，且假单胞菌属是报道较多的能够高效降解木质纤维素类物质的微生物种类^［40］。纤维弧菌属能够以氧化的方式利用葡萄糖，且能水解纤维素以及其他多糖复合物^［41］，具有固氮能力^［42］。芽孢杆菌属可促进堆体腐熟和稳定化，具有固氮能力^［43］，对植物生长有促进作用^［44］。糖单孢菌属有降解木聚糖的能力，有一定的固氮能力^［45］。直丝菌属可以分泌木聚糖酶并具有固氮作用^［46］。鞘氨醇杆菌属有一定的固氮能力^［42］。类土地杆菌属不具备硝酸盐还原能力^［47］，有一定的固氮能力^［14］。添加外源固氮菌抑制了不动杆菌属、棒状杆菌属、盐单胞菌属的生长。不动杆菌属具有反硝化作用^［48］。棒状杆菌属和盐单胞菌属具有反硝化能力^［49-50］。由此可见，加入外源固氮菌显著提高具有固氮作用的菌属丰度、降低具有反硝化作用的菌属丰度。

KEGG代谢途径的差异表明，5株固氮菌株抑制了碳水化合物和氨基酸代谢相关功能基因；同时，5株固氮菌株显著增加了次级代谢产物的微生物合成。碳水化合物代谢和氨 基酸代谢是微生物的重要生物代谢，它们的代谢产物能够调控微生物群落结构和丰度变化^［51］，而氨基酸作为细菌代谢的能量和碳源^［52］，被认为是调节碳氮转化的主要影响因素^［53］。微生物次级代谢产物的生物合成能够满足自身的内源性和外源性需求，调控内在的代谢过程促进碳氮代谢的中间产物的生物再合成，促使种群更好地应对极端条件提高种群稳定性，适应周围环境^［54］。由此可见，外源固氮菌剂通过改变氮代谢优势微生物群落及其功能基因而影响氨基酸和碳水化合物代谢，从而减少堆肥过程中的碳氮损失。

4 结论

1） 外源嗜热固氮菌显著减少了堆肥中碳氮损失，提高了养分含量，总体表现为A₁>A₃>B₁>A₂>B₂。

2） A₁（根癌异根瘤菌）和B₁（液化沙雷菌属）能够较好地在堆肥中定殖。5株外源固氮菌显著增加各处理中土著固氮菌的丰度，而减少反硝化菌的丰度。

3） 外源固氮菌通过影响固氮菌和反硝化菌相对丰度而影响氨基酸代谢和碳水化合物代谢功能基因，抑制堆肥过程中的碳氮代谢，从而减少碳氮损失。

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基金资助

甘肃农业大学研究生导师基金项目(GAU-QDFC-2021-20)

甘肃农业大学学科建设基金项目(GAU-XKJS-2018-212)

甘肃省自然科学基金项目(18JR3RA180)