乳酸片球菌对初生肉仔鸡盲肠菌群结构的影响

Effects of Pediococcus acidilactici on the gut microbiota structure of broilers

摘要

目的 为探究乳酸片球菌对初生肉仔鸡盲肠菌群结构的影响。 方法 从1日龄开始在饲料中添加乳酸片球菌对肉仔鸡进行饲喂，在第21天和第42天，取肉仔鸡盲肠内容物，通过对盲肠肠道微生物16S rDNA基因V3+V4区高通量测序，检测饲喂乳酸片球菌后对初生肉仔鸡盲肠菌群结构的变化。 结果 各组42 d时的Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均高于21 d时其指数，21 d时各试验组的OTU数目、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均高于对照组；通过PCoA分析和NMDS分析发现，各组在21 d时散在分布聚类，42 d时各中部明显聚类；试验组与对照组相比降低了变形菌门的相对丰度，提高了厚壁菌门、拟杆菌属、巨细胞菌属、另枝杆菌的相对丰度；通过LEfSe分析显示21 d和42 d时各组存在差异微生物，可见不同试验组肉仔鸡肠道微生物在结构和组成上相对稳定但存在差异。 结论 饲喂乳酸片球菌可以提高初生肉仔鸡盲肠菌群的丰度和多样性，在一定程度上促进有益菌群数量的增加。

Abstract

Objective To investigate the effects of Pediococcus acidilactici on the cecal microbiota structure of neonatal broilers. Method Broilers were fed with P.acidilactici from 1 day of age.On days 21 and 42，the cecal contents of the broilers were collected.The changes in cecal microbiota structure after feeding P.acidilactici were detected by high-throughput sequencing of the V3+V4 region of the 16S rDNA gene in cecal gut microbiota. Result The Chao1 index，Ace index，Shannon index and Simpson index of each group on day 42 were higher than those on day 21，and the OTU number，Chao1 index，Ace index，Shannon index and Simpson index of each experimental group were higher than those of the control group on day 21.Through PCoA analysis and NMDS analysis，it was found that each group was scattered and clustered on day 21，with obvious clustering on day 42.Compared with the control group，the relative abundance of Proteobacteria decreased，the relative abundance of Firmicutes，Bacteroides，Megamonas and Altistipe were increased.LEfSe analysis showed that there were different microorganisms in each group on day 21 and 42，indicating that the gut microorganisms in different groups were relatively stable but different in structure and composition. Conclusion Feeding P.acidilactici can improve the abundance and diversity of the cecal microbiota in newborn broilers and，to some extent，promote the increase of beneficial microbiota.

Graphical abstract

关键词

乳酸片球菌 / 生长性能 / 菌群结构

Key words

Pediococcus acidilactici / growth performance / microflora structure

Author summay

王轶男，博士研究生，研究方向为动物遗传育种与繁殖。E-mail：[e-mail]

当肉仔鸡孵化出壳后，大量微生物进入其肠道内迅速形成一个微生物多样性的肠道菌群系统，正常情况能够维持稳定的平衡状态。禽类肠道微生物菌群在抵制病原体入侵、免疫系统发育和营养物质消化吸收中起着重要作用，其组成与单胃哺乳动物有很大的差别^［1-3］。伴随着研究的深入发展，不断有研究证实不同种类的饲料添加剂能够影响家禽肠道微生物菌群的结构、组成和多样性等各个方面^［4-5］。益生菌是一种活性微生物，在家禽养殖业的前景较好，很多研究和报道中表明益生菌能够改善家禽肠道的微生态^［6］。在前期的工作中，本实验室筛选出1株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），为研究乳酸片球菌对初生肉仔鸡盲肠菌群结构的影响，以各组肉仔鸡盲肠内容物为检测样品，通过高通量测序分析饲喂乳酸片球菌后的初生肉仔鸡盲肠中菌群分布的特点，为探究初生肉仔鸡消化特点与盲肠菌群分布之间的关系提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用乳酸片球菌由延边大学农学院微生物实验中心提供。试验前经复苏、优化和实测后，乳酸片球菌有效活菌数达到10⁹ CFU/mL，放置备用。选用健康、状态良好、体质量接近的1日龄AA肉仔鸡，共120只，均购自延吉市某鸡雏孵化厂。

1.2 试验设计

选取120只1日龄健康肉仔鸡，试验开始前对鸡舍进行全面冲洗、清理和消毒。雏鸡到达后，先饮用温开水，2~3 h后开始进食。试验期内自由采食和饮水。同时，参考肉鸡推荐免疫程序，7 日龄时对试验鸡进行新城疫滴鼻免疫，14 日龄进行法氏囊疫苗饮水免疫，21 日龄时进行新城疫饮水免疫，28 日龄进行法氏囊疫苗饮水免疫。基础饲粮以玉米-豆粨为主，参照美国NRC（1994）进行配制，详见表1。将试验动物随机分为4个处理组，每组3个重复，每个重复10只鸡，各组间试验鸡体质量差异不显著。各处理组分别为：P1低剂量组饲喂1×10⁸ CFU/mL的菌液，P2中剂量组饲喂1×10⁹ CFU/mL的菌液，P3高剂量组饲喂1×10¹⁰ CFU/mL的菌液，CON对照组喂同等剂量的无菌生理盐水。将制备好的菌液采用口服灌喂的方式进行饲喂，每天灌喂一次，每次灌喂0.5 mL，灌喂前与灌喂后2 h停止饲喂饲料与饮水。试验期为42 d，分为试验前期（1~21 d）与试验后期（21~42 d）。

1.3 样品采集

分别于试验第21天和42天，各处理组随机抽取体质健康且与平均体质量接近的健康鸡1只，即每组取3只鸡。屠宰后，在无菌条件下，剖取盲肠肠道内容物0.5 g放入无菌的10 mL EP管中，迅速投入液氮后转至-70 ℃保存备用，样品用于盲肠菌群结构的分析。共采集4组24个样品，分为对照组CON（21 d：CON21a，CON21b，CON21c；42 d：CON42a，CON42b，CON42c），低剂量组P1（21d：P121a，P121b，P121c；42d：P142a，P142b，P142c），中剂量组P2（21d：P221a，P221b，P221c；42d：P242a，P242b，P242c），高剂量组P3（21d：P321a，P321b，P321c；42d：P342a，P342b，P342c）。

1.4 肠道微生物基因组测序分析

委托北京百迈克生物科技有限公司提取样本肠道微生物基因组DNA，根据16S rDNA基因V3+V4区片段设计通用引物进行扩增后产物回收纯化，然后构建片段文库，基于Illumina Novaseq 6000进行双末端测序。通过对Reads拼接过滤，聚类或去噪后进行物种注释及丰度分析，同时进一步进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析多样性分析及菌群结构分析，探讨不同组别间菌群结构之间的差异。

1.5 数据处理

数据采用SPSS 16.0统计软件ANOVA程序进行显著性分析，采用Duncan's法进行多重比较，测定结果以\overline{x}±s表示，以P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 稀释曲线分析

由图1所示，通过Shannon曲线和稀释曲线进行互相验证，开始时曲线直线上升，伴随着测序深度的增加，曲线呈现出拐点并趋于平缓，表明试验采样合理。

2.2 Alpha多样性分析

对各试验组进行Alpha分析，由表2在第21日龄时，P3组的OTU数目、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数与对照组相比，均差异性显著（P<0.05）；在第42日龄时，各试验组的各项指数均差异不显著（P>0.05）。整体来看，P3组的群落丰富度和群落多样性最高，表明饲喂乳酸菌影响了肉仔鸡盲肠Alpha多样性。

2.3 Beta多样性分析

对各试验组Beta多样性分析，由图2所示，第21日龄时各试验组呈散状分布，第42日龄时各试验组呈中部明显聚类分布；在第21日龄时P2组的PCoA分析和NMDS分析组间距远，表明饲喂乳酸菌影响了肉仔鸡盲肠Beta多样性。

2.4 菌群结构分析

基于门（phylum）水平分析。如表3所示和图3所示，8组样品的菌群组成在门水平上优势菌门分别是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria），其中厚壁菌门和拟杆菌门合占总菌的90%左右。其中，厚壁菌门和拟杆菌门在P3组的第21日龄时和第42日龄时均显著高于CON组（P<0.05）。

基于属（genus）水平分析。由表4和图4所示，8组样品的菌群组成在属分类水平上的前三名菌属是拟杆菌属（Bacteroides）、巨单胞菌属（Megamonas）和另枝菌属（Altistipe）。在第21日龄时另枝菌属在CON组显著高于其它各试验组（P<0.05）；在第42日龄时各试验组之间差异不显著（P>0.05）。

2.5 菌群组成差异性分析

LEfSe（line discriminant analysis（LDA）effect size）分析是用于两组或多组的比较分析工具，检测细菌分类群组成的变化及不同丰度相关联的类别。由图5所示，LEfSe分析结果表明，根据LDA分值>4.0，第21日龄时各组鉴定了9种丰度差异显著的分类群，即氨基酸球菌科（f-Acidaminococcac⁃eae）、考拉杆菌属（g-Phascolarctobacterium）、扭链瘤胃球菌属（g-Ruminococcus-torques-group）、脱硫弧菌属（g-Desulfovibrio）、普拉梭菌属（g-Faecalibacterium）、普雷沃氏菌科（f-Prevotellaceae）、普雷沃氏菌科UCG-001菌属（g-Prevotellaceae-UCG-001）、另枝菌属（g-Alistipes）、理研菌科（f-Rikenellaceae）。如图6所示，第42日龄时各组鉴定了2种丰度差异显著的分类群，即普雷沃氏菌科UCG-001菌属（g-Prevotellaceae-UCG-001）和脱硫弧菌属（g-Desulfovibrio）。

3 讨论

高通量测序技术，自问世至今飞速发展，此项技术较为深入揭示了菌群结构的复杂性和多样性，是研究肠胃微生物菌群变化的重要技术之一^［7-9］。由于食物在盲肠中停留时间较长，发酵较为彻底，盲肠的微生物多样性远远高于十二指肠、空肠和回肠^［10］，因此本试验选取盲肠段进行菌群多样性的分析。有研究表明，当动物机体肠道微生物菌群多样性增高时会伴随着其对脂肪能量的吸收能力也逐渐增强^［11］和对外界应激的抵抗力增强^［12-13］。本试验利用16S rDNA基因高通量测序技术对饲喂不同剂量乳酸片球菌的肉仔鸡盲肠样品中的微生物多样性进行了研究，发现饲喂乳酸片球菌肉仔鸡的肠道菌群多样性高于未饲喂乳酸片球菌肉仔鸡的肠道菌群多样性（OTU数目、Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均提高），并且不同剂量的样品之间的菌群结构存在差异性。但第42 日龄时各试验组之间alpha多样性分析的相关指数均差异不显著的原因可能是由于随着肉仔鸡饲养的天数不断增加，肉仔鸡日龄因素影响较大且肠道菌群结构基本建立完毕，添加乳酸菌对肉仔鸡肠道菌群的塑造作用不是那么大，因此与对照组差异不显著。Beta多样性分析研究中，第21日龄时PCoA分析中P2组和P3组组间距较远，在第21日龄时NMDS分析P2组组间距较远，表明饲喂乳酸菌影响了肉仔鸡盲肠Beta多样性，但随着日龄增加各试验组之间的菌群多样性差异性越小、相似度越高。

从门分类水平上看，主要的优势菌门是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria），结果表明饲喂乳酸片球菌不会破坏肉仔鸡盲肠主体优势菌门类的地位。变形菌门作为细菌中最大的一门，包含很多病原菌，如沙门氏菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌等，这些细菌易定植在机体肠道内引起动物腹泻^［14］。本试验结果中P1组在第42日龄时变形菌门占总细菌比较第21日龄时降低，同时P1组在第42日龄时变形菌门占总细菌比较其他各试验组是最低的，表明低剂量组的干预降低了肉仔鸡盲肠变形菌门的比例。拟杆菌门作为细菌门的第二大门，是革兰氏阴性菌，其很多种类生活在动物或人体肠道内。本试验结果中P1组在第42日龄时拟杆菌门占总细菌比较第21日龄时降低。厚壁菌门是革兰氏阳性菌，其中最重要的一个纲是芽孢杆菌纲，对动物肠道起到有益的作用。本试验结果中P1组在第42日龄时厚壁菌门占总细菌比较第21日龄时提高。综上所述，摄入适量的乳酸片球菌对肉仔鸡盲肠微生物菌群在门水平分布方面起到了优化肉仔鸡盲肠菌群结构的作用，在一定程度上能提高有益菌的增加和降低有害菌的增加。

从属分类水平上看，主要的优势菌属是拟杆菌属（Bacteroides）、巨细胞菌属（Megamonas）和另枝杆菌（Altistipe）。这其中拟杆菌属在禽类属水平分类中常见，具有可促进动物对饲料中淀粉的消化吸收且调节肠道炎症的功能^［15］；巨细胞菌属常见分离于人、动物和家禽的肠道内，具有预防和治疗炎症等相关作用^［16］，其下调与动物致病性相关^［17］；另枝杆菌是革兰氏阴性菌，是拟杆菌门的一个属，与肠道健康有关的肠道厌氧菌^［18］，对某些疾病具有保护性。本试验结果中拟杆菌属在各处理组间和不同试验阶段均相对含量较高。同时还发现，P3组在第42日龄时拟杆菌属、巨细胞菌属和另枝杆菌占总细菌比均较对照组高，与一些研究的相关结果一致^［19-21］。综上所述，摄入适量的乳酸片球菌对肉仔鸡盲肠微生物菌群在属水平分布方面起到了优化肉仔鸡盲肠菌群结构的作用，在一定程度上促进有益菌群数量的增加。

从菌群差异性组成LEfSe分析上看，主要从科、属水平上体现出菌群差异性，第21日龄时各组盲肠富集菌群有厚壁菌门的氨基酸球菌科、考拉杆菌属、普拉梭菌属和扭链瘤胃球菌属，拟杆菌门的普雷沃氏菌科、普雷沃氏菌科UCG-001菌属、理研菌科和另枝菌属，变形菌门的脱硫弧菌属。随着试验周期的增加，不同试验组的菌群差异性不显著，到第42日龄时各组盲肠富集菌群有变形菌门的脱硫弧菌属和拟杆菌门的普雷沃氏菌科UCG-001菌属。其中差异最大的是另枝菌属（g-Alistipes）和理研菌科（f-Rikenellaceae）。研究表明另枝菌属对一些疾病具有保护性，其中包括结肠炎、癌症免疫治疗等；理研菌科多见于哺乳动物肠道内，其丰度与动物机体平均日增质量呈负相关。同时，丰度增加的普拉梭菌属、普雷沃氏菌科和考拉杆菌属都是有益菌。

4 结论

在本试验条件下，连续饲喂益生菌能提升肉仔鸡肠道菌群的丰富度和多样性，使肉仔鸡肠道菌群结构发生变化，并在一定程度上能提高有益菌的增加和降低有害菌的增加。该株乳酸片球菌对肉仔鸡具有益生作用，高剂量作用效果更加明显。

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基金资助

吉林省教育厅项目(JJKH20200522KJ)

高等学校学科创新引智计划项目(D20034)