美仁牦牛FABP7基因克隆、生物信息学及表达分析

Cloning，bioinformatics and expression analysis of FABP7 gene in Meiren yak

摘要

目的 为探究牦牛脂肪酸结合蛋白7基因（Fatty Acid Binding Protein 7，FABP7）的结构与功能。 方法 以美仁牦牛为试验对象，克隆FABP7基因的编码区（Coding sequence CDS）以及检测该基因在不同组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、肌肉、脂肪）中的表达差异。以美仁牦牛心脏组织cDNA为模板，利用RT-PCR技术克隆牦牛FABP7基因的CDS区序列，并使用多种软件和在线工具进行生物信息学分析，利用qPCR技术检测FABP7基因在美仁牦牛8个组织中的表达情况。 结果 美仁牦牛FABP7基因编码区全长为399 bp，编码132个氨基酸，已上传至美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库中，获得基因序列号为OQ730164；分析牦牛FABP7蛋白显示，不稳定指数为26.27、理论等电点为5.38，脂肪系数73.71、总平均亲水指数-0.387，属于稳定的亲水性蛋白质，FABP7蛋白中存在1个N-糖基化潜在位点和14个潜在的磷酸化位点，该蛋白没有信号肽区域，不存在跨膜结构；在氨基酸组分中缬氨酸含量最高（11.4%），通过亚细胞定位发现，美仁牦牛FABP7基因分布在细胞质、细胞核、线粒体中；通过预测蛋白二、三级结构可知，蛋白质的高级结构主要由无规则卷曲和延伸链构成。同源性比对发现，美仁牦牛和牦牛、牛的亲缘关系最近（100%），与蜥蜴的最远（91.67%），FABP7基因与FABP2、FABP4、FABP5、FABP6以及APOA4等相关蛋白相互作用，对机体的脂质代谢具有重要的调控作用；qPCR结果显示，美仁牦牛的8个组织中FABP7基因的表达量存在明显的差异性，在心脏组织中的表达量最高，显著高于其他组织（P<0.05），在脾脏组织中低度表达。 结论 本试验成功克隆了美仁牦牛FABP7基因的编码区，且该基因在美仁牦牛心脏组织中表达最高，可为FABP7基因在牦牛后续的研究中提供理论依据。

Abstract

Objective The study was conducted to explore the structure and function of Fatty Acid Binding Protein 7 （FABP7） gene of yak，with Meiren yak as the experimental object，cloning the coding sequence CDS of FABP7 gene and detecting the difference in gene expression in different tissues （heart，liver，spleen，lung，kidney，testis，muscle，fat）. Method Using the cDNA of heart tissue as template，the CDS sequence of FABP7 gene was cloned by RT-PCR，and bioinformatics analysis was carried out by various software and online tools.The expression of FABP7 gene in 8 tissues of Meiren yak was detected by qPCR. Result The FABP7 coding region of Meiren yak was 399 bp，encoding 132 amino acids，which had been uploaded to the GenBank database of the National Center for Biotechnology Information （NCBI） and obtained the sequence number of OQ730164.The analysis of FABP7 protein showed that it belonged to the stable hydrophilic protein，with the instability index of 26.27，the theoretical isoelectric point of 5.38，the fat coefficient of 73.71，and with the total average hydrophilic index of -0.387.FABP7 protein had 1 potential N-glycosylation site and 14 potential phosphorylation sites，and had no signal peptide region and transmembrane structure.Among the amino acids，the content of Valine was the highest （11.4%）.According to subcellular mapping，FABP7 gene was distributed in cytoplasm，nucleus and mitochondria of Meiren yak.By predicting the secondary and tertiary structures of proteins，it was showed that the higher structure of proteins was mainly composed of random coiled and extended chains.The homology analysis showed that Meren yak had the closest relationship with Bos mutus and Cattle （100%），and the furthest relationship with lizard （91.67%）.FABP7 gene interacted with the related proteins such as FABP2，FABP4，FABP5，FABP6 and APOA4，which played an important role in regulating lipid metabolism in the body.The results of qPCR showed that FABP7 gene expression was significantly different in 8 tissues of Meiren yak，and the highest expression occurred in heart tissue，which was significantly higher than other tissues （P<0.05），and the lower expression occurred in spleen tissue. Conclusion In this experiment，the coding region of FABP7 gene was cloned successfully，and the expression of FABP7 gene was the highest in the heart tissue of Meiren yak，which could lay a theoretical basis for the subsequent research of FABP7 gene in yak.

Graphical abstract

关键词

美仁牦牛 / FABP7基因 / 克隆 / 生物学分析 / 表达

Key words

meiren yak / FABP7 / cline / biological analysis / expression

Author summay

张娟香，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein，FABPs）是细胞内脂质结合蛋白（iLBPs）的基因家族，包含9种脂肪酸结合蛋白^［1］。FABP家族普遍存在一个保守的高级结构^［2］，即位于相同的位置分隔编码序列有三个可变长度的内含子^［3］。此外，FABP家族调节脂质运输、参与基因表达的调节、细胞增殖和分化、脂质氧化、信号传导、酶活性的调节和细胞质中脂滴的储存^［4］。FABP7基因（fatty acid binding protein 7 gene）是一种脑型脂肪酸结合蛋白（brain lipid binding protein）^［5］。研究发现，FABP7存在于脂质糖代谢调节的PPAR（PPAR signaling pathway）^［6］经典通路中，参与脂肪细胞的分化^［7］，而且FABP7参与妊娠后期脂肪酸的转运^［8］。综上所述，该基因可能在脂^［9］质代谢中具有一定的调控作用^［10-12］。

牦牛生活在青藏高原及毗邻地区，具有肉用、奶用等重要价值，是部分高原地区居民的支柱性产业和资源，具有“高原之舟”的美誉^［13］。美仁牦牛是甘肃特有的地方种质遗传资源，经过长期自然选择而形成的特有品种，在民间有句谚语说：“美仁的牦牛一堵墙”可见美仁牦牛是甘南牦牛家族中的佼佼者^［14］。但是，牦牛作为肉用品种，存在生长缓慢，脂肪沉积少，肌肉发育迟缓，肉质口感不佳等问题，影响牦牛的畜产品价值。目前关于FABP7基因在牦牛上的研究较少。因此，本文利用PT-PCR技术克隆了美仁牦牛FABP7基因的编码序列，并进行生物学分析，通过q-PCR技术检测FABP7基因在美仁牦牛8个组织中的表达情况，分析FABP7基因的功能，为进一步研究FABP7基因在美仁牦牛脂质代谢方面的作用机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验样品采集

试验样品来自甘肃省甘南藏族自治州合作市，选取3头体质健康的36月龄美仁牦牛公牛进行屠宰，并剖取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、肌肉、脂肪等8个内脏组织，放入液氮进行保存，后转到-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要仪器与试剂

PCR仪（Pro Flex TMPCR）；电泳仪（DYY-6C）；超微量分光光度计（Nano Drop2000）；凝胶成像系统（Tanon 2500）；金属浴；Trizol up试剂盒、Evo M-ML V反转录试剂盒Ⅱ、LA Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker采购自宝生物工程有限公司（中国，大连）。

1.3 总RNA的提取及反转录

利用Trizol法提取上述各组织的总RNA，使用超微量分光光度计Nano Drop（Thermo，北京）来检测RNA的质量和浓度（D_{260 nm}/D_{280 nm}值在1.8~2.0），检测合格的RNA按照反转录试剂盒（Takara，大连）中的操作方法反转录成cDNA，存放在-20 ℃冰箱备用。

1.4 牦牛FABP7基因引物设计与合成

使用GenBank上野牦牛FABP7基因序列登录号：（XM_005890114.2），在NCBI在线软件Pick Primers设计用于克隆（PCR）以及实时荧光定量（qPCR）所使用的扩增引物，由西安擎科生物科技公司合成。具体信息如表1所示。

1.5 牦牛FABP7基因的克隆与测序

使用美仁牦牛心脏组织cDNA为模板进行PCR反应的扩增，PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min；95℃变性30 s，58.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。反应体系（25 μL）：dd H₂O 8.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，c DNA 2 μL，上下游引物各1 μL。PCR扩增产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，后使用凝胶成像系统来观察条带，符合后收集条带送西安擎科生物科技公司进行测序。

1.6 牦牛FABP7基因的生物信息学分析

在得到FABP7基因的测序结果后，利用多种在线软件进行分析FABP7基因的生物信息学（表2）。

1.7 实时荧光定量PCR

以美仁牦牛采集的各组织cDNA为模板，选择GAPDH为内参基因，利用qPCR技术检测FABP7基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、肌肉、脂肪8个组织中的表达情况。反应体系共20 μL，体系包括2X SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH₂O 8.2 μL。qPCR反应程序为95 ℃ 30 min，95 ℃ 5 s，58.6 ℃ 30 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 min，共45个循环。

1.8 统计分析

qPCR结果采用{\mathrm{2}}^{-\Delta \Delta Ct}方法进行统计分析，利用GraphPad Prism 8进行独立样本t检验分析结果的差异性，P<0.05判定为差异性显著。

2 结果与分析

2.1 牦牛FABP7基因的扩增及克隆

以美仁牦牛心脏组织的cDNA为模板，进行RT-PCR特异性扩增，产物使用1%琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统检测，结果如图1所示，扩增片段长度大约在504 bp左右，条带单一且明显，与预期目的条带相符，送公司测序后进行结果分析，得到美仁牦牛FABP7基因的编码区，即表示克隆成功。

2.2 牦牛FABP7 mRNA CDS区序列分析

测序结果拼接后，同Gen Bank中牦牛FABP7 mRNA CDS区序列比对发现，美仁牦牛的CDS区为399 bp，与牦牛（XM_005890114.2）的基因编码区一致，氨基酸序列未发生变化，同源性为100%。通过NCBI的ORF Finder预测发现，存在4个开放阅读框，编码132个氨基酸。利用Bio Edit软件对该序列的碱基组成进行分析，其碱基含量分别为A（29.57%）、T（24.31%）、C（16.29%）和G（29.82%）。

2.3 牦牛FABP7基因同源性分析和系统进化树构建

利用NCBI-BLAST在线软件对牦牛（XM_005890114.2）、牛（NP_001071630.1）、绵羊（XP_004011201.1）、山羊（XP_005684563.1）、猪（NP_001020400.1）、猫（XP_003986566.1）、人类（NP_001437.1）、鲸鱼（XP_022418441.1）、海龟（XP_032646546.1）、鸟类（NXS46719.1）、蜥蜴（XP_042302995.1）的FABP7氨基酸序列进行对比，其同源性分别为100%、100%、99.24%、98.48%、97.73%、96.97%、95.45%、94.7%、93.94%、92.42%、91.67%。利用MegAlign软件将美仁牦牛与其他物种的核苷酸序列进行同源性比对，结果如图2所示，美仁牦牛和牦牛、牛的同源性高达100%，与其他物种的同源性在91%以上，说明FABP7基因与以上物种具有较高的保守性，在进化过程中变异程度小。通过氨基酸序列比对（图3）和构建系统进化树（图4）可知，牦牛与牛归为一类，其次是绵羊和山羊为一类，猪、猫、人还有鲸鱼归为一类，最后乌龟、鸟类、蜥蜴归为一类，可以看到美仁牦牛与牦牛和牛的亲缘关系最近（100%），与蜥蜴的最远（91.67%）。

2.4 牦牛FABP7蛋白质分析

2.4.1 蛋白质理化性质分析

使用在线软件ProtParam分析该蛋白理化性质可知，FABP7蛋白分子式C₆₅₉H₁₀₃₇N₁₇₉O₂₀₆S₆、原子总数2 087、相对分子质量（Mr）14 955.92 kD、理论等电点（PI）5.38，在氨基酸组分中含量最高的是缬氨酸（11.4%），脯氨酸的含量最低（0.8%，表3）。FABP7蛋白带正、负电荷残基总数分别为Arg + Lys=17个、Asp + Glu=21个，FABP7脂肪系数（AI）73.71、体外半衰期30 h、不稳定指数（II）为26.27、总平均亲水指数（GRAVY）-0.387，如图5所示，FABP7蛋白氨基酸残基大多数在亲水区，属于稳定型的亲水性蛋白。

2.4.2 FABP7蛋白信号肽和跨膜结构域预测

通过分析软件SignalP5.0可预测美仁牦牛的FABP7蛋白信号肽，Y-max为0.140、C-max为0.184、S-max为0.130，该蛋白不存在信号肽区域（图6）。在线软件TMHMM2.0预测跨膜结构，FABP7蛋白存在于膜内，不存在跨膜结构（图7）。

2.4.3 FABP7亚细胞定位

通过在线软件PSORT Ⅱ分析FABP7蛋白的亚细胞位置，结果如表4所示，FABP7蛋白主要位于细胞质（62.20%）、其次是细胞核（21.70%）和线粒体（13.0%）中。

2.4.4 FABP7蛋白糖基化位点、潜在磷酸化位点预测

利用软件NetNGlyc1.0预测糖基化位点，如图8所示，FABP7蛋白在第35位处存在1个N-糖基化潜在位点，N-糖基化势能0.783 8。通过预测潜在的磷酸位点发现，FABP7蛋白存在14个磷酸潜在位点，其中就包括苏氨酸9处、丝氨酸4处、酪氨酸1处（图9）。

2.4.5 FABP7蛋白二、三级结构预测

使用在线软件分析FABP7蛋白的二级结构，如图10所示，FABP7蛋白的二级结构由延伸链为主（35.61%），包含47个氨基酸；α-螺旋21.97%，有29个氨基酸；β-转角（8.33%）和无规则卷曲（34.09%），分别包含11个和45个氨基酸。利用在线软件SWISS-MODEL预测蛋白三级结构，如图11所示，模板的相似性为95.45%，GMQE值0.9。

2.4.6 FABP7蛋白互作网络预测

利用在线软件 STRING构建牦牛FABP7互作蛋白网络，如图12所示，牦牛FABP7的互作蛋白共有10个，包括与FABP7蛋白同为一个基因家族的FABP1、FABP2、FABP3、FABP4、FABP5、FABP6，还包括NOTCH1以及APOA4和DLGAP5蛋白。

2.4.7 FABP7基因在美仁牦牛不同组织的表达量

利用实时荧光定量PCR检测FABP7基因在美仁牦牛不同组织的表达差异，如图13所示，FABP7基因在美仁牦牛8个组织中均有表达，表达量从高到低依次为心脏、肝脏、肺脏、脂肪、睾丸、肾脏、肌肉、脾脏。

3 讨论

在神经胶质方面，FABP7基因在大脑中的神经干细胞和径向神经胶质细胞发育中大量表达^［15］，通过控制细胞脂肪酸稳态而参与星形胶质细胞的生长增殖^［16-17］。大脑中多不饱和脂肪酸（PUFAs）的运输与脂肪酸结合蛋白紧密相关^［17］，而FABP7是ω-3 PUFA的强结合剂^［18］，具有调节脂质代谢或信号传导的作用^［19-21］。

在畜禽脂质代谢方面FABP7基因主要是通过结合和运输PUFAs^［7］发挥一定的作用。在家禽脂质代谢的分子机制中FABP7基因存在于PPAR信号通路中。而在猪的研究中^［10］提到，淮南猪去势后导致的脂肪沉积增多，FABP7基因表现为上调。在鸡禁食48 h后FABP7基因下调基本可以说明与糖脂代谢有一定的联系^［22］。此外，FABP7基因与固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1C）显著相关，而SREBP-1C在胆固醇和脂肪酸的合成代谢中发挥了重要作用^［23］。但目前该基因在牦牛物种上未曾有过相关研究。

本研究成功克隆了美仁牦牛心脏组织FABP7基因完整的CDS区。分析蛋白理化性质发现，FABP7基因在氨基酸组分中，含量最高是缬氨酸，带正、负电荷残基总数分别为Arg + Lys=17个、Asp + Glu=21个，所以推测该蛋白质可能带有负电荷。在预测信号肽和跨膜结构分析中可知，FABP7不存在信号肽和跨膜结构，这与亚细胞定位的结果相一致，不存在运输，可能在蛋白质合成后就于合成处发挥作用，推测该蛋白在细胞质中起主要作用，不属于分泌蛋白^［24］。FABP7蛋白的三级结构符合于该蛋白的二级结构^［25］，由2个α-螺旋和10条反向平行β链折叠形成稳定结构，有助于脂肪酸的摄取和运输等^［25］；该蛋白在35位氨基酸处存在1个N-糖基化潜在位点，糖基化是一种关键的翻译后修饰 （PTM），它影响蛋白质的功能从而调节各种生物过程^［26］；FABP7蛋白有14处磷酸潜在位点，磷酸化可以修饰蛋白，对于细胞信号转导发挥重要作用^［27-28］，FABP7蛋白互作的基因有10个，其中FABP2、FABP4、FABP5蛋白通过KEGG富集分析存在于PPAR信号通路中，参与调控脂肪代谢、糖代谢、细胞增值与分化^［29］，另外，APOA4蛋白在山羊过表达后抑制肌内脂肪细胞分化^［30］。可见与FABP7蛋白的互作蛋白与脂肪沉积相关，综上所述，FABP7基因作为FABPs家族的一员，在细胞功能的调控和脂质代谢方面具有不可忽视的作用。

通过qPCR技术检测FABP7基因在美仁牦牛不同组织的表达情况，心脏组织的表达量显著高于其他组织（P<0.05），在肝脏组织和肺脏组织的表达仅次于心脏组织，睾丸组织和脂肪组织中中度表达，在脾脏组织、肌肉组织、肾脏组织中低度表达；在本文中FABP7基因在美仁牦牛心脏组织中显著表达，与草原红牛中FABP7基因在心脏组织的表达量相似^［31］，在河鲀、青鳉中FABP7基因在心脏组织中表达显著^［32］，可能FABP7基因在不同物种各组织的表达差异与基因本身发挥的作用有关系，具体的机制尚不清楚，需进一步探究，本文主要为FABP7基因在牦牛后续的研究中提供基础数据，可以作为牦牛遗传育种的参考资料。

4 结论

本试验成功克隆了美仁牦牛FABP7基因CDS区，能够编码132个氨基酸；美仁牦牛与牦牛、牛的同源性最近。FABP7蛋白的等电点是5.38，存在14个潜在的磷酸位点和1个糖基化位点。FABP7蛋白主要存在于细胞质内，是一类稳定型的亲水蛋白。FABP7基因在美仁牦牛心脏组织中表达最高（P<0.05）。

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基金资助

合作市牦牛种质提升与提质增效项目

甘肃省科技计划项目(20JR5RA580)

甘肃省科技重大项目(21ZD10NA001)

甘肃省科技重大项目(GZGG-2021-1)

现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项资金项目(CARS-37)

中国农业科学院科技创新工程项目(25-LZIHPS-01)