丹元糖痹乳膏对小鼠的镇痛和活血化瘀作用的效果评价

Evaluation of analgesic and promoting blood circulation effects of a compound preparation of DYTB Cream in mice

摘要

目的 探讨丹元糖痹乳膏（DYTB）对小鼠镇痛和活血化瘀作用，并应用网络药理学探讨其作用机理。 方法 通过小鼠热刺痛、甲醛致痛模型评价DYTB对小鼠镇痛作用；通过耳廓微循环实验，判断DYTB活血作用的功效。采用TCMSP数据库检索DYTB活性成分潜在靶点并通过GeneCards数据库获取疾病相关靶基因。最后应用分子对接技术，检验DYTB主要组分与靶基因之间的结合活性。 结果 小鼠药效试验提示，与模型组比较，DYTB工艺1、2组对神经和/或炎性疼痛均具有显著镇痛效果和促进微循环作用（P<0.01或0.05）。通过网络分析获取DYTB治疗疼痛和血栓的主要活性成分为槲皮素、木犀草素、大黄素和β-谷甾醇等，潜在关键靶点包括IL6、TNF、IL1B和AKT1等。分子对接结果提示，主要成分与关键靶点可有效结合。 结论 DYTB乳膏具有镇痛和活血化瘀作用，为后续DYTB乳膏的研究提供试验研究依据。

Abstract

Objective To study the effects of Danyuan Tangbi (DYTB) Cream on analgesia and promoting blood circulation in mice，and to explore its mechanism by network pharmacology. Method The effects of DYTB were evaluated on analgesia using heat prickle and formaldehyde-induced pain models in mice.The efficacy of DYTB in promoting blood circulation was assessed by studying auricular microcirculation.Potential targets of DYTB's active components were searched using the TCMSP database，and pain and thrombosis targets were obtained using the GeneCards database.Finally，molecular docking technology was used to test the binding activity between DYTB components and target genes. Result The pharmacodynamic tests showed that the process of DYTB process 1 and 2 group had significant analgesic effect on nerve and/or inflammatory pain and microcirculatory promotion (P<0.05 or 0.01) in mice.Through network analysis，the main active components of DYTB were quercetin，daidzein，emodin and bata-sitosterol，etc.，and the potential key targets included IL6，TNF，IL1B and AKT1，etc.in the treatment of pain and thrombosis.The molecular docking results indicated that the key components could effectively bind to the key targets. Conclusion DYTB Cream has analgesic and circulatory promoting effects which provide an important test base for further research on DYTB Cream.

Graphical abstract

关键词

丹元糖痹乳膏 / 镇痛 / 活血化瘀 / 小鼠

Key words

DYTB cream / analgesic / promoting blood circulation / mice

Author summay

黄木兰，广州中医药大学申请硕士学位。E-mail：[e-mail]

以前兽医认为手术疼痛对动物是有利的，疼痛会限制动物活动，更利于动物机体恢复^［1］。但是随着人们对疼痛的研究，发现疼痛对动物生理机能和器官功能有较大影响。此外，美国宠物医院协会于2007年发布了《犬和猫的疼痛管理指南》^［2］，提出了动物疼痛管理能有效的改善康复过程。犬、猫作为伴侣动物，且容易出现手术或者外伤性疼痛，直接影响动物和人的生活质量，加速动物“疼痛最小化”，已成为亟需关注的社会问题^［3］。

血瘀与血管微循环障碍有着必然的联系，血瘀可诱发形成血栓，如在中老年犬猫中易高发血栓性疾病，最终可导致其后肢麻痹/瘫痪等；临床上治疗血瘀是从病理向生理转化的过程^［4］。丹元糖痹（DYTB）乳膏依据中医临床多年的经验方，对传统用药方剂进行增减优化研制出的一款新型外用涂抹制剂，克服临床上用药量大、携带和储存不便等缺陷。DYTB由醋延胡索（158 g）、鸡血藤（105 g）、川芎（105 g）、两面针（105 g）和乳香（53 g）5味中草药组成的复方制剂，中草药富含生物碱、黄酮类等多种活性成分^［5］。其中延胡索、川芎分别为罂粟科植物和伞形科藁本属植物^［6-7］，具有镇痛抗炎、活血化瘀的药效作用^［8-10］；鸡血藤为豆科植物，具有活血化瘀功效，被称为“血分之圣药”，同时还具有抗炎和镇痛作用等^［11-12］。目前DYTB在在治疗镇痛和活血化瘀方面的治疗作用机理报道较少。

本研究通过考察不同制备工艺下丹元糖痹（DYTB）乳膏对镇痛和活血化瘀的药效作用，并结合网络分析和分子对接探讨其发挥疗效的作用机制，为后续DYTB的进一步研究提供试验研究依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

甲醛溶液（批号：20221005，厂家：天津市大茂化学试剂厂）；纯化水（由博济医药科技股份有限公司自制）；聚乙二醇400（PEG400，批号：N20230203，厂家：南京威尔药业集团股份有限公司）；白凡士林（批号：20221101，厂家：天津市大茂化学试剂厂）；95%乙醇（批号：P2548827，厂家：上海泰坦科技股份有限公司）；羊毛脂（批号：2022062，厂家：山西锦洋药用辅料有限公司）；天平（型号：YP2001，厂家：上海津平科学仪器有限公司）；热刺痛仪（型号：PL-200，厂家：成都泰盟科技有限公司）；体视显微镜（型号：S9E，厂家：德国/Leica）。

1.2 试验动物

动物种属为ICR小鼠，体质量范围为13.4~19.4 g，性别为雄性，购自广东维通利华实验动物技术有限公司，合格证为SCXK（粤）2022-0063。

1.3 供试品和对照品

DYTB乳膏，工艺1（批号DYTB-0101-230217，每1 g相当于饮片0.43 g）；工艺2（批号DYTB-0101-230218，每1 g相当于饮片0.43 g），空白对照样品（批号DYTB-0201-230218），以上均由博济医药科技股份有限公司自制。云南白药（批号ZLA2217，厂家云南白药集团股份有限公司）。双氯芬酸二乙胺乳胶剂（批号8P3L，GSK Consumer Healthcare S.A.）。

1.4 受试物制备方法

受试物及其制备方法如表1所列。

1.4 试验方法

1.4.1 体内药效研究

1.4.1.1 镇痛试验

热刺痛试验：选取健康雄性ICR小鼠50只，分组前测定动物右足的基础阈值^［13］，选择基础痛阈值在4.35~7.05 s者入组。设模型组（空白对照样品）、云南白药组（云南白药）、双氯芬酸二乙胺组（双氯芬酸二乙胺乳胶剂）、DYTB工艺1、2组（DYTB乳膏工艺1、2），共5组，8只/组。给药前重复测定2次各组动物的右足痛阈值，取2次测定结果平均值作为正常值。痛阈值测定结束后，取30 mg/30 μL药物（分别为空白对照样品、云南白药、双氯芬酸二乙胺乳胶剂和DYTB乳膏工艺1、2）涂于对应组别小鼠腿足部，2次/天。于末次药后30 min、1 h、2 h、3 h使用热刺痛仪对动物的痛阈值进行检测。

甲醛致痛试验：分组同热刺痛试验。取30 mg/30 μL药物（分别为空白对照样品、云南白药、双氯芬酸二乙胺乳胶剂和DYTB乳膏工艺1、2）涂于对应组别小鼠腿足部，给药当天分两次给药，次日给药后在动物足底皮下注射2%甲醛溶液25μL。造模后立即将小鼠放入适宜的容器（烧杯）中，连续观察30 min，每5 min为1个时间段，分别记录各时间段内痛反应累积时间，即小鼠右后足不接触烧杯底部，处于舔足、抬足和退缩状态的累积时间^［14］。计算30 min内总痛反应时间，第Ⅰ相反应（0~5 min，神经疼痛）和第Ⅱ相反应（10~30 min，神经疼痛和炎性疼痛）的累积痛反应时间。

1.4.1.2 耳廓微循环试验

分组同热刺痛试验。给药前1天对小鼠耳廓进行脱毛，取20 mg/20 μL药物（分别为空白对照样品、云南白药、双氯芬酸二乙胺乳胶剂和DYTB乳膏工艺1、2）涂于对应组别小鼠耳廓内侧，给药前、后分别用体视显微镜观察和拍摄小鼠耳廓的微循环情况，记录微血管较大主支管径，计算同一位置管径变化率^［15］，计算公式：微血管管径变化率（%）=（给药后微血管直径-给药前微血管直径）/给药前微血管直径✕100%。

1.4.2 网络机理研究

1.4.2.1 药物与疾病靶点获取

使用TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php）分别通过检索“延胡索、鸡血藤、川芎、两面针、乳香”获取相应的活性成分。但因DYTB 乳膏拟开发成外用药品，故不考虑生物利用度OB 值，以DL≥0.18为筛选条件^［16］，获得药物潜在靶点，经STRING 12.0数据库（https：//cn.string-db.org/）将获取的靶基因转化为标准名称^［17］。应用关键词“pain”和“thrombus”，使用GeneCards数据库（https：//www.gene-cards.org/）搜索疼痛和血栓相关的靶基因^［18-19］。

1.4.2.2 核心靶点网络构建

将DYTB成分对应靶点和2.1.1筛选得到的疾病靶点上传至Venny2.1.0可视化平台（http：//www.liuxiaoyuyuan.cn/），获取DYTB治疗疼痛和血栓的潜在靶点。于STRING 12.0数据库中上传DYTB与镇痛/血栓共有基因，并构建PPI蛋白网络。再将交集靶基因的互作网络导入Cytoscape3.9.1软件，通过分析参数“degree、closeness和betweenness”筛选DYTB治疗镇痛和活血化瘀核心靶点，然后将核心靶点蛋白进行可视化，并对核心靶点拓扑参数进行分析。

1.4.2.3 药物-活性成分-靶点网络构建

将药物与活性成分相对应的基因数据文件上传至Cytoscape3.9.1软件创建DYTB、药物潜在的有效成分与交汇基因的网络关系图，并分析网络节点的度值，从而筛选出可能发挥主要药效作用的活性成分^［20］。

1.4.2.4 交集靶点通路富集分析

通过Metascape数据库（https：//metascape.org /gp/index.html），将DYTB和镇痛/血栓的共同基因进行GO及KEGG通路分析，并通过微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）将分析结果可视化生成条形图或气泡图^［16］。

1.4.2.5 分子对接验证

为了检验网络预测结果的可靠性，将度值排序靠前的5个核心靶基因输入PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）获取相应基因的结构^［21］，再通过TCMSP数据库下载主要成分的分子结构，然后使用AutoDock软件对靶基因及配体结构进行去水分子、加氢和加电荷等处理，再进行分子对接验证，最后对结果构像应用PYMOL软件进行分析处理^［22］。

2 结果与分析

2.1 体内药效学研究结果

2.1.1 镇痛试验

热刺痛试验：模型组给药后各时间点（除药后30 min外）的痛阈值与给药前比较基本一致，未体现出明显差异，但痛阈值于药后30 min的时间呈明显下降的趋势（P<0.05）；与自身给药前相比，云南白药组和双氯芬酸二乙胺组在给药后所有检测时间痛阈呈先增高后下调趋势，其中分别于药后1 h、30 min的时间，痛阈值具有明显差异（P<0.05或0.01），可提示云南白药组和双氯芬酸二乙胺组动物经药后1 h、30 min可明显提高痛阈值，从而此时发挥镇痛作用；DYTB工艺1组在药后各检测时间痛阈与自身给药前相比，呈现先上升后下降趋势，在药后30 min和4 h，痛阈值具有显著差异（P<0.01或0.05）；DYTB工艺2组在药后各检测时间痛阈与自身给药前相比，呈现先上升后下降趋势，在药后30 min的时间，痛阈值具有显著差异（P<0.01），见表2。

甲醛致痛试验：与模型组相比，云南白药组和DYTB工艺1组的第I相痛反应时间均有降低趋势，其中DYTB工艺1组的降低幅度大于云南白药组，但未见显著差异（P>0.05）；与模型对照组相比，各组别的第II相痛反应时间和总痛反应时间均有所降低，但仅DYTB工艺1、2组痛反应存在显著差异（P<0.05）；与模型对照组相比，各组总痛反应时间均有所降低，但仅DYTB工艺1组具有显著差异（P<0.01），见表3。

2.1.2 耳廓微循环试验

与模型组比较，除双氯芬酸二乙胺组外，其余各组均能提高小鼠耳廓微血管管径的变化率，且差异具有统计学意义（P<0.05或0.01）；其中云南白药组促微循环效果最优（P<0.01），其次分别为DYTB工艺2组、DYTB工艺1组，因此以上结果表明DYTB工艺1、2组和云南白药组均具有促微循环作用，即活血化瘀作用，见下表4。

2.2 网络分析

2.2.1 药物与疾病靶点获取

通过TCMSP数据库获取DYTB各活性成分结果为延胡索71个、鸡血藤49个、两面针43个、乳香38个、川芎20个，前25个活性成分按DL值按高到低排列（表5）；将各药物活性成分获取对应的药物作用靶点，合并后删除重复项共得到32个靶点基因。运用GeneCards数据库搜索到血栓靶基因共1 114个，疼痛靶基因经相关数值的中位数3.057 385 445进行筛除后得到有效作用靶点1 650个。

2.2.2 核心靶点网络构建

通过Venny2.1.0可视化平台获取DYTB和疼痛、血栓交集基因共99个（图1），然后将镇痛/血栓共有靶点导入STRING数据库，选择物种为“Homo sapiens”，创建PPI基因蛋白网络（图2）。再将DYTB靶点与疾病靶基因的互作关系网络上传至Cytoscape 3.9.1软件，经过网络参数“degree、closeness和betweenness”筛选出DYTB治疗镇痛和活血化瘀核心靶点共28个，并进行可视化网络构建（图3），按Degree值筛选出前10个核心靶点（表6），Degree值大小代表该靶点在PPI网络中重要性程度。

2.2.3 药物-活性成分-靶点网络构建

将药物各组分对应的基因数据文件导入Cytoscape3.9.1软件构建网络可视化图（图4），通过Degree值筛选出排名前10的药物活性成分（表6），结果显示槲皮素、木犀草素和大黄素等的度值排名较前，从而判断这些活性成分可能为治疗疼痛和血栓的主要药效成分。

2.2.4 交集靶点通路富集分析

经Metascape数据库进行KEGG通路富集分析，结果提示关键通路为HIF-1、PI3K-Akt、NF-kB等（图5）。GO通路分析结果提示，与疼痛/血栓疾病相关的基因主要参与的生物过程（Biological process）主要涉及细胞迁移的积极调节、磷代谢过程正调节、炎症反应调节等过程调节；分子功能（Molecular function）富集分析结果提示，在分子功能上主要包括信号受体激活活性、激酶结合、蛋白酶结合等方面；细胞组成（Cell composition）分析结果显示，细胞组成主要包括官腔囊泡、膜筏和受体复合物等方面。GO通路分析富集结果通过微生信在线

2.2.5 分子对接验证

将DYTB镇痛和抗血栓按度值排序靠前的5个核心靶点（IL6、TNF、IL1B、AKT1和INS）及有效成分（槲皮素、木犀草素、大黄素、β -谷甾醇、花椒碱）进行分子对接。通过结合能判断蛋白和配体结合的可行性。当结合能<0 kJ/mol，提示分子对接有效，结合能越低，表明活性成分与分子配体结合越稳定^{［15，21］}。本研究以结合能≤-5.0 KJ/mol为条件。分子对接结果表明，DYTB中大部分有效成分与关键基因的结合能均<-5 kJ/mol。因此认为DYTB中主要活性成分与镇痛/抗血栓中的核心靶基因具有较好的结合活性。各核心靶蛋白与主要活性成分的对接结合能见表7，代表性分子对接图见图7。

3 讨论

针对体内药效试验，热刺痛和甲醛致痛为研究镇痛药的经典方法。热刺痛为动物足部受到热刺激后随后出现的疼痛反应，即动物表现出舔后足现象，痛阈值以动物接触热板到出现舔足行为所需时间，以此确定药物所具有的镇痛效果^［23-24］。热刺痛试验结果显示，DYTB工艺1组可提高小鼠热刺痛痛阈的作用，其中云南白药组在给药后1 h时药效最优，双氯芬酸二乙胺组和DYTB工艺1组在给药后30 min时药效最佳，且DYTB工艺1组在药后4 h仍具有一定的镇痛作用，因此提示DYTB工艺1组能有效提高神经疼痛的热刺痛值，减轻大鼠热痛觉敏感反应。甲醛致疼痛模型通常动物在造模后一定时间内出现舔足、抬足和退缩作为疼痛指标，痛反应I时相为化学直接刺激神经末梢所引起（造模后0~5 min），II时相为由前列腺素引起的炎症反应（造模后10~30 min）依赖于外周炎症及中枢神经系统共同参与^{［14，25］}。甲醛致痛试验结果表明DYTB工艺1组对神经性和炎性疼痛均有镇痛作用，DYTB工艺2组仅对炎性疼痛的有一定镇痛效果。微循环障碍会造成血液物理性质改变，使血管腔体变狭小，血液流动速率变缓或诱发血栓。微循环试验主要通过观察药物引起耳廓血管主支管径的变化，从而判定药物具有活血化瘀的疗效。耳廓微循环试验中提示，云南白药组、DYTB工艺1、2组均具有促微循环作用，即活血化瘀作用，其中促微循环作用效果的先后顺序为云南白药组>DYTB工艺1组>DYTB工艺2组。

根据网络药理学和分子对接结果分析，可得出槲皮素、木犀草素和大黄素等为DYTB治疗疼痛和血栓的主要药效活性成分，具体情况还有待进一步研究。槲皮素属天然黄酮类，有研究表明槲皮素对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的神经性疼痛，起到改善神经传到速度效果和坐骨神经病理变化，同时可降低炎症因子水平^［26］。槲皮素对四氧嘧啶所致糖尿病大鼠周围神经病变模型，随着槲皮素药物使用剂量递增，可致动物热痛觉的潜伏阶段显著缩短^［27］。关键靶点网络筛选结果提示TNF、IL6、IL1B和AKT1等为药物起治疗作用的关键靶点。有研究表明，血瘀会导致TNF-α、IL1β等炎症因子水平升高^［28］；AKT1可诱导各种生长因子的效应作用，如血小板衍生、表皮等生长因子^［29］。通路分析发现DYTB可能通过调控HIF-1、PI3K-Akt、NF-kB等关键通路发挥作用。HIF-1是血管内皮生长因子VEGF-A的主要调节因子^［30］。有研究表明，川芎赤芍对脑缺血再灌注模型中可明显提高脑组织中HIF-1α RMA的表达水平，进而能够调节脑血管微循环^［31］。同时在大鼠坐骨神经异位症模型中，可见模型动物的痛阈值显著下降，同对照组相比，经造模后的动物PI3K、AKT有较好的蛋白表达能力，使用LY294002后可使动物的痛阈值有所回升，PI3K、AKT蛋白表达降低^［32］。

4 结论

通过小鼠热刺痛、甲醛镇痛模型及耳廓微循环实验初步评价DYTB具有显著镇痛和活血化瘀的作用，同时应用网络分析和分子对接探讨其发挥镇痛和活血化瘀的靶基因和机制，得出相应疗效作用的主要活性成分、靶基因和关键信号调节通路，为后续DYTB乳膏进一步研究提供重要的试验依据，同时DYTB乳膏有望成为治疗疼痛和血栓的理想药物。

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基金资助

广东省工程技术研究中心认定项目(粤科函产学研字［2015］1487号)

广东省科技计划项目(2017B020228002)

广州市天河区科技计划项目(2018BY002)

GLP规范的老年病创新药物筛选与评价公共服务平台建设（广州市发改委备案号：2019-440112-75-03-000650）