低温下不同光照对菜豆幼苗生长与光合特性的影响

Effects of illumination at low temperature on seedling growth and photosynthesis characteristic of kidney bean

摘要

目的 阐明菜豆响应低温光照胁迫的生理机制。 方法 试验设置正常温光管理（CK）、低温下高光（T₁）和弱光（T₂）处理，研究光照对菜豆幼苗生长、叶绿素含量、气体交换、荧光参数和抗氧化系统的影响并进行相关性与主成分分析。 结果 低温光照胁迫抑制菜豆幼苗生长，与CK相比，T₁和T₂处理7 d幼苗株高、茎粗、叶面积、总根长、总根表面积和平均根系直径分别降低18.3%和18.9%、14.6%和19.5%、36.7%和38.5%、21.8%和24.8%、8.7%和14.0%、5.5%和7.3%。随胁迫时间延长，净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）和蒸腾速率（T_r）降低，胞间CO₂浓度（C_i）升高。PSⅡ的最大光化学效率（F_V/F_m），实际光化学效率（Φ_PSⅡ）和光化学淬灭系数（qP）降低，非光化学淬灭系数（NPQ）升高。叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和总叶绿素［Chl （a+b）］含量降低，叶绿素a/b升高。丙二醛（MDA）和过氧化氢（H₂O₂）含量增加，过氧化氢酶（CAT）活性呈先升后降的趋势，抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性和谷胱甘肽（GSH）含量呈下降趋势，谷胱甘肽还原酶（GR）活性呈上升趋势。相关性分析表明，P_n与T_r、qP呈显著正相关（P<0.05），与MAD显著负相关（P<0.05）。主成分分析显示，提取到特征值>1的2个主成分，方差累计贡献率为95.002%。依据主成分得分排序，芸豆在低温不同光照胁迫处理下CK>T>t。 结论 低温弱光较低温高光胁迫对幼苗的伤害严重。

Abstract

Objective The study aimed to elucidate the physiological mechanism of kidney bean in response to low temperature and light stresses. Method In this study，three treatments were set，i.e.,normal light and temperature(CK)，high light (T₁) and low light (T₂) at low temperature，and the morphological indexes，chlorophyll content，gas exchange，fluorescence parameters and antioxidant system were determined for the kidney bean seedlings under different treatments，followed by the correlation analysis and principal component analysis. Result Light stress at low temperature treatments inhibited the growth of seedlings.Compared with control，the plant height，stem diameter，leaf area，total root length，root surface area and average root diameter of the seedings with T₁ and T₂ treatments for 7 days decreased by 18.3% and 18.9%，14.6% and 19.5%，36.7% and 38.5%，21.8% and 24.8%，8.7% and 14.0%，5.5% and 7.3%，respectively.With the prolongation of stress time，the net photosynthetic rate (P_n)，stomatal conductance (G_s) and transpiration rate (T_r) decreased，and intercellular CO₂ concentration (C_i) increased.Maximum photochemical efficiency (F_V/F_m) of PS Ⅱ，photochemical quenching coefficient (qP) and actual photochemical efficiency of PS Ⅱ（Φ_PSⅡ) decreased，whereas nonphotochemical quenching coefficient (NPQ) increased.The contents of chlorophyll a (Chla)，chlorophyll b (Chlb) and total chlorophyll [Chl(a+b)] decreased，and the Chl a/b increased.The contents of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) increased，the activity of catalase (CAT) increased first and then decreased，the activity of ascorbic acid peroxidase (APX) and the content of glutathione (GSH) decreased，and the activity of glutathione reductase (GR) showed the upward tendency.The correlation analysis showed that P_n was positively correlated with T_r and qP (P<0.05)，and negatively correlated with MAD (P<0.05).With the principal component analysis，two principal components with eigenvalue>1 were extracted，and their cumulative variance contribution rate was 99.707%.According to the ranking of principal component scores，the kidney beans under different light stress at low temperature treatments was as follows: CK>T>t. Conclusion The weak light intensity at low temperature stress caused more serious damage to the kidney bean seedlings than that of the high light intensity at low temperature stress.

Graphical abstract

关键词

菜豆 / 低温光照胁迫 / 叶绿素荧光 / 光合特性 / 相关性分析 / 主成分分析

Key words

red kidney bean / low temperature and light stress / chlorophyll fluorescence / photosynthetic characteristics / correlation analysis / principal component analysis

Author summay

张兴民，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

菜豆（Phaseolus vulgaris L.2n=2X=22），豆科菜豆属，一年生草本植物，为全球重要的蔬菜和经济作物^［1］。芸豆喜温不耐寒，在我国华北、东北和西北地区种植面积较大^［2］。温度和光照是影响植物分布、光合和生长发育的重要环境因子^［3］。研究表明低温和光照单一胁迫下，菜豆幼苗叶片叶绿素含量下降，可溶性蛋白和可溶性糖的含量上升，游离脯氨酸含量上升，POD的活性升高^［4-5］。菜豆在我国多采用露地栽培，在北方冬季和早春时低温和强光对芸豆的生长和产量造成严重影响。随着设施农业的发展，菜豆的设施栽培面积逐年增加，然而我国北方设施结构简单，低温和弱光胁迫发生频率较高，并成为主要的环境限制因素^［6］。目前，低温和光照复合胁迫对番茄^［7］、黄瓜^［8］、棉花^［9］等作物的影响研究已有报道，菜豆的非生物胁迫研究大多集中在单一胁迫对生长和生理特性的影响^［10-11］，而关于低温光照复合胁迫对菜豆幼苗影响的研究报道较少。

本试验研究低温条件下不同光照对菜豆幼苗形态建成、光合、荧光特性和抗氧化系统的影响，并进行相关性分析和主成分分析，探索菜豆对低温光照胁迫的生理适应机理，为菜豆露地栽培以及北方地区冬春季温室高产栽培提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

以普通菜豆为材料，挑取饱满、健康的种子洗净晾干，在蒸馏水中浸泡12 h后，置于铺有湿润滤纸的培养皿中萌发，将发芽的种子移栽在装有基质的小花盆中，浇灌1/2的Hoagland营养液，正常温光管理，25 ℃/18 ℃、光周期12 h/12 h，光照强度200 μmol/（m²·s）。待幼苗长出3~4片真叶时，挑选生长健壮、长势一致的幼苗转移至人工气候箱进行低温不同光照胁迫处理。试验设置1个对照（CK）和2个处理（T₁和T₂）。CK：温度25 ℃/18 ℃，光强200 μmol/（m²·s），光周期12 h/12 h。T₁：温度8 ℃，光强600 μmol/（m²·s），光周期12 h/12 h。T₂：温度8 ℃，光强80 μmol/（m²·s），光周期12 h/12 h。每处理10盆，每盆1株，重复3次。试验处理时间为7 d，取0、3、5和7 d的植株测定相关指标。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 形态指标测定

用电子游标卡尺测量株高（地面到植株生长点）和茎粗（植株的上、中、下3个部位取平均值）；叶面积的测定采用方格法；采用根系分析仪和WinRHIZO软件测量总根长、总根表面积和平均根系直径。

1.2.2 叶绿素荧光参数测定

将幼苗暗适应30 min后，从上往下取第二片功能叶，用德国WALZ公司的IMAPING-PAM调制叶绿素荧光仪测定光化学淬灭系数（qP）、PSⅡ的最大光化学效率（F_v/F_m）、PSⅡ实际光化学效率（Φ_PSⅡ）、非光化学淬灭系数（NPQ）等荧光参数。

1.2.3 光合气体交换参数

晴天上午9∶00选取幼苗从上往下第二片功能叶片，用英国PP Systems公司生产的CIRAS-2便携式光合荧光测定系统测定其净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、胞间CO₂ （C_i）和蒸腾速率（T_r）。测定时环境温度25 ℃、光量子通量密度800 μmol/（m²·s）、CO₂浓度为大气CO₂浓度、相对湿度75%。

1.2.4 生理指标测定

参照李合生^［12］的方法，叶绿素（Chl）和过氧化氢（H₂O₂）含量采用分光光度法测定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定；过氧化氢酶（CAT）活性采用高锰酸钾滴定法测定。参照Cakmak^［13］的方法测抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性和谷胱甘肽还原酶（GR）活性。谷胱甘肽（GSH）含量用南京建成生物工程研究所有限公司的试剂盒测定。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016软件处理数据，数据表示为\overline{x}±s，重复3次。利用SPSS 19.0进行方差分析、相关性分析和主成分分析，利用Duncan法进行差异显著性多重比较。

2 结果与分析

2.1 低温不同光照对菜豆幼苗形态指标的影响

表1显示，低温光照胁迫显著抑制芸豆幼苗地上和地下部生长。低温高光（T₁）和低温弱光（T₂）处理7d株高分别比对照（CK）降低18.3%和18.9%，茎粗分别比CK降低了14.6%和19.5%，叶面积分别比CK降低了36.7%和38.5%，总根长分别降低了21.8%和24.8%，总根表面积降低了8.7%和14.0%，平均根系直径分别比对CK降低了5.5%和7.3%。说明低温弱光较低温高光对幼苗生长的抑制作用更明显。

2.2 低温不同光照对幼苗叶绿素含量的影响

由图1可知，在低温光照胁迫下，Chl a、Chl b和Chl （a+b）含量呈下降趋势，Chl a/b呈上升趋势，但低温不同光照处理变化幅度不同。低温高光和弱光下，Chl a分别较CK降低4.5%~24.0%和9.0%~29.9%，Chl b下降8.9~50.0%和17.8~61.4%，Chl （a+b）下降5.5%~29.8%和10.9%~36.9%，Chl a/b较CK分别上升4.9%~52.0%和10.7%~81.4%。结果表明，低温弱光胁迫下，叶绿素含量降低幅度较大，Chl a/b上升幅度较大，说明低温弱光胁迫下叶绿素降解更为严重，光能的吸收效率更低。

2.3 低温不同光照对幼苗叶绿素荧光参数的影响

低温不同光照胁迫下菜豆幼苗叶片的qP、F_V/F_m和Φ_PSⅡ均呈下降趋势，NPQ呈上升趋势（图2）。T₁处理第3、5和7天时，qP分别较CK下降9.2%、12.9%和26.2%，F_V/F_m较CK降幅分别为18.5%、35.2%和43.6%，Φ_PSⅡ下降了23.1%、38.0%和64.2%，NPQ较CK上升了30.1%、36.9%和62.5%。T₂处理第3、5和7天时，qP分别较CK下降32.2%、49.3%和60.3%，F_V/F_m较CK降幅分别为21.1%、37.7%和46.4%，Φ_PSⅡ分别下降了34.7%、47.0%和71.0%，NPQ较CK分别上升了25.5%、28.7%和36.0%。低温弱光下菜豆叶片的qP、F_V/F_m和Φ_PSⅡ与CK相比，下降幅度较低温高光下的更明显，而NPQ的上升幅度小于低温高光下的。

2.4 低温不同光照胁迫对幼苗光合参数的影响

随低温光照胁迫时间延长，P_n、C_s和T_r均呈现下降趋势，C_i呈现上升趋势（图3）。T₁和T₂处理7 d与CK相比，P_n、C_s和T_r分别下降24.0%和55.3%，50.0%和72.0%，15.6%和41.8%，C_i上升18.2%和15.1%。

2.5 低温不同光照对幼苗MDA及H₂O₂含量的影响

低温光照胁迫下菜豆MAD及H₂O₂含量均呈上升趋势（图4）。其中T₁处理第3、5、7天时，MDA含量较CK分别升高了6.8%、34.1%和43.0%，H₂O₂含量较CK分别升高了23.1%、33.4%和57.3%。T₂处理第3、5、7天时，MDA含量较CK分别升高了23.4%、83.5%和114.3%，H₂O₂含量较对照分别升高了51.2%、61.6%和95.7%。因此，低温弱光对菜豆叶片细胞的氧化损害较低温高光胁迫更严重。

2.6 低温不同光照对幼苗抗氧化酶活性及GSH含量的影响

低温不同光照对幼苗抗氧化酶活性及GSH含量的影响不同（图5）。随着低温光照胁迫时间的延长，CAT活性呈先升后降的趋势。当胁迫至第3天时，菜豆叶片CAT活性显著升高且达到峰值，其中T₁和T₂处理下CAT活性相较CK上升了53.8%和65.2%。处理第5天时，CAT活性显著下降，与胁迫第3天相比各处理的降幅分别为7.5%和8.9%。处理第7天时，各处理相较于第5天降幅分别为12.9%和13.2%。APX活性和GSH含量随胁迫时间的延长，呈下降趋势。T₁和T₂处理下，芸豆幼苗在第3、5、7天的APX活性分别比CK降低了13.3%和18.7%、45.9%和56.5%、58.4%和77.5%，GSH含量分别比CK降低了22.4%和30.6%、30.3%和45.7%、60.8%和76.4%。GR活性随胁迫时间的延长呈上升趋势，T₁和T₂处理下，幼苗在第3、5、7天的GR活性分别较CK升高了23.9%和40.2%、28.6%和48.1%、63.8%和78.0%。

2.7 相关性分析和主成分分析

由表2可知，菜豆叶片的P_n与T_r、qP呈显著正相关（P<0.05），与MAD呈显著负相关（P<0.05）。对低温不同光照胁迫处理下的18个生理指标进行主成分分析，提取特征值大于1的两个主成分，其特征值分别为16.136和1.236，总贡献率贡为95.002%，符合分析要求。表3显示，PC₁综合了P_n、G_s、T_r、Chl a、Chl b、Chl（a+b）、qP、F_v/F_m、ΦPSⅡ、APX、GSH等指标的信息，PC₂综合了C_i、Chl a/b、NPQ、MDA、H₂O₂、CAT、GR等指标的信息。得分（F）是每个主成分得分与对应贡献率乘积之和，即F=F₁×89.644%+F₂×5.358%。由表4可知，菜豆在低温不同光照胁迫处理下的综合得分排名为CK>T₁>T₂，说明低温弱光对菜豆幼苗生理伤害更大。

3 讨论

温度和光照是植物生长发育的关键环境因素，低温光照胁迫对植物的生长发育有明显的抑制作用。根系长度、表面积和直径是根系吸收能力的重要参数，不仅能反映植物生长发育情况，也是植物抗逆性指标之一^［14］。本研究发现，芸豆幼苗在低温弱光和高光胁迫下株高、茎粗、叶面积、总根长、总根表面积和平均根系直径均受到抑制，与前人研究结果相似^［15］，且在低温弱光下的抑制作用较低温高光下更大，即低温弱光对菜豆幼苗的生长发育伤害更大。可能是植株在低温胁迫下，地上部分光合作用受到阻碍，导致地下部的光合产物减少，根部呼吸作用减弱，根系生长缓慢，根系的总长度和体积均比在常温对照的降低^［16］。

叶绿素是植物吸收光能、进行光合作用的重要条件，也是衡量非生物胁迫的指标之一^［17］。叶绿素合成过程是一系列的酶反应，低温会影响酶的活性，从而影响叶绿素的合成^［18］。植物在低温光照胁迫下，叶绿素的含量有所降低，植物的光合作用下降，植物的生长发育受到抑制^［19-20］。本试验中，低温光照胁迫显著降低了菜豆幼苗叶绿素含量，其中低温弱光胁迫下较低温高光降幅更大，可能是低温弱光对叶绿素合成酶的活性抑制较严重。

叶绿素荧光参数反映植物在胁迫条件下，光能的分配、耗散及光合机构的损伤。逆境环境下，F_v/F_m降低表示PSII发生了光抑制^［21］。本研究表明，低温光胁迫下菜豆叶片F_V/F_m、Φ_PSⅡ，和qP较对照均显著降低，PSⅡ的功能下降，发生光抑制。芸豆叶片在低温弱光处理下F_V/F_m、Φ_PSⅡ，和qP的降幅较低温高光下更显著，光抑制程度更严重。Φ_PSⅡ反映用于光和电子传递的量子产量，其大小与qP有关。由于低温光胁迫下qP不断下降，使得Φ_PSⅡ降低。NPQ可用来衡量植物对光系统损害的抵御程度，NPQ值越高，则对外界的不良光系统损害抵抗力越强^［22］。本试验得出，低温光胁迫下，NPQ随着胁迫时间的增长而逐渐升高，热耗散逐渐增强。

光合速率降低的影响因素有两种，分别是气孔限制因素和非气孔限制因素。若P_n和C_s以及C_i同时降低，则气孔因素是光合速率降低的主要影响因素^［23］。反之若C_i 升高，则是非气孔因素占主导地位。本研究结果表明，与正常温光相比较，低温光照胁迫显著降低了菜豆幼苗叶片G_s、P_n和T_r，而C_i显著升高，说明光合速率的降低是非气孔因素如低温和光照导致的。

逆境胁迫下活性氧不断积累，诱发植物抗氧化酶系活性改变、膜脂过氧化和MDA的积累^［24］，植物利用抗氧化系统将活性氧浓度控制在一定的功能范围内^［25］。本试验中，随胁迫时间延长，H₂O₂和MDA含量呈不断升高的趋势。抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循环是植物体内清除活性氧的重要途径，主要存在于细胞质和叶绿体中。GSH是循环中重要的抗氧化物质，既可以直接还原活性氧，又可以作为酶底物清除活性氧，APX和GR是循环中主要的抗氧化酶^［26］。本试验中，在低温光照胁迫处理下，菜豆幼苗的CAT活性呈先增后降趋势，APX活性和GSH含量呈下降趋势，GR活性呈上升趋势。说明CAT、APX和GR起协同抗氧化作用。

4 结论

低温光照胁迫抑制菜豆幼苗株高、茎粗、叶面积、总根长、总根表面积和平均根系直径，与低温高光相比，低温弱光胁迫对幼苗生长的抑制作用更严重。低温光照胁迫引起叶绿素降解，PSII发生光抑制，净光合速率降低。低温光照胁迫导致丙二醛和过氧化氢含量增加，AsA-GSH循环中的抗氧化酶起协同抗氧化作用。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31760351)

国家现代农业产业技术体系(CARS-08)