分散固相萃取净化与气相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中157种农药残留

Determination of 157 pesticide residues in vegetables by using dispersive solid phase extraction purification coupled with gas chromatography-tandem mass spectrometry

摘要

目的 建立一种分散固相萃取净化结合气相色谱-串联质谱法测定蔬菜中157种农药化合物的分析方法。 方法 样品经过乙腈和QuEChERS EN-提取包提取，用无水硫酸镁150 mg、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）75 mg、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）5 mg的填料管净化，在GC-MS/MS的动态多反应监测（dMRM）模式下检测，基质匹配标准曲线法定量分析。 结果 157种化合物在各自质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.992 1，检出限范围为0.032~6.198 μg/kg，定量限为0.107~19.496 μg/kg。在0.01、0.02、0.10 mg/kg加标水平下157种农药的平均回收率为74.5%~117.3%，RSD（n=6）为0.4%~10.5%。 结论 该方法前处理简单、快速、灵敏，能够满足多种农残的同时检测需求，可广泛应用于蔬菜等样品的筛查和定量检测。

Abstract

Objective The study aimed to develop a method of the determination of 157 pesticide compounds in vegetables by using the dispersive solid phase extraction purification combined with gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). Method The samples were extracted with acetonitrile and QuEChERS EN-extraction package，cleaned-up with purifying packing tubes including 150 mg MgSO₄，75 mg PSA and 5 mg GCB，and then was detected by GC-MS/MS in dynamic multi-reaction monitoring (dMRM) mode，followed by quantitative analysis with the matrix-matched standard curve. Result The results showed that 157 pesticides had good linear relationships in the range their concentrations，the correlation coefficients were all greater than 0.992 1，the limits of detection (LOD) were 0.032~6.198 μg/kg，and the limits of quantification (LOQ) were 0.107~19.496 μg/kg.The average rates of recovery for 157 pesticides were 74.5%~117.3% and RSDS (n=6) were 0.4%~10.5% at the markup levels of 0.01，0.02 and 0.10 mg/kg. Conclusion The method is simple，rapid and sensitive，and may meet the requirements for multiple pesticide residues detection，which can be widely used in the rapid screening and quantitative detection of vegetable samples.

Graphical abstract

关键词

蔬菜 / 分散固相萃取净化 / 气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS） / 多种农药残留

Key words

vegetable / dispersive solid phase extraction purification / Gas chromatography-tandem mass spectrometry （GC-MS/MS） / Multiple pesticide residues

Author summay

杨志敏，硕士，高级工程师，研究方向为外源性污染物质检测与质量分析。E-mail： [e-mail]

蔬菜中的农药残留问题是影响其质量安全的重要因素之一。目前关于蔬菜中农药残留的报道较多，李晓慧等^［1］在623份黄瓜中共检出农药55种，其中有19种在现有检测方法中未覆盖，5种农药超出其最大残留限值规定，还有禁限用农药隐性添加现象；梁启富等^［2］检测了88份普通白菜，共检出农药27种，检出率为77.27%，存在多种农药联合使用问题^［2］；梁晓涵等^［3］在115份海南市售芹菜中共检出农药39种，样品检出率为72.2%，超标率为3.5%；菠菜、生菜、甜椒、小青菜等均有农药残留检出的相关报道^［4］。可见，在不同种类的蔬菜中均有多种农药被不规范施用的现象。因此，建立快速、灵敏、可靠的高通量农药残留检测分析技术对于保障蔬菜的质量安全具有重要意义。

目前农药残留常用的检测方法有气相色谱法^［5-6］、液相色谱法^［7-8］、气相色谱-串联质谱法^［9-11］、高效液相色谱-串联质谱法^［12-13］等。其中气相色谱法和液相色谱法灵敏度低，检测农药种类有限，在定性确证方面易受干扰；色谱与三重四极杆质谱联用技术可将高效的色谱分离性能和高灵敏、高通量检测的质谱性能相结合，实现复杂基质背景下准确定性定量，目前已成为多种农药残留分析中最主要的检测技术^［14］。气相色谱-三重四极杆串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）具有低检测限、准确确证和定量目标化合物等优点，可提高实验室检测效率，被广泛应用于复杂基质中多种农药残留的筛查。

样品前处理技术是准确分析检测的前提，目前筛查多种农药残留前处理方法已趋于简单、快速和节约化方向发展。国内外学者建立了多种农药残留的前处理技术，如固相微萃取^［6，15］、分散液液萃取^［16］、基质固相分散萃取^［7］等，这些方法虽然高效快速，但依然无法满足多数农药低定量同时检测的技术要求。QuEChERS方法由于其简便快速的特点，在不同基质中通过优化改进已成为多农残分析采用的前处理方法，在不同基质中已有应用^［17-21］。蔬菜种类多、基质复杂，而农药多残留检测属于痕量分析，易受基质的干扰，检测结果准确性不仅受提取和净化效果的影响，还会被不同基质中的基质效应影响。本研究结合日常检验的经验和相关文献报道，以基质干扰影响中等强度的芹菜样品为空白基质样品，通过优化提取溶剂、净化填料及其配比提高提取净化效果，同时减少试剂用量和环境污染，结合改进的前处理方法和GC-MS/MS仪在动态多反应监测模式下建立一套适合蔬菜中多种农药残留同时检测的分析技术，以期满足蔬菜中农药残留的高通量筛查和定量需求，为食品安全风险监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜蔬菜（白菜、芹菜、茄子、辣椒、番茄、莜麦菜、生姜、黄瓜、韭菜、莲藕、甜椒、豆角、菠菜、油菜、蘑菇、豇豆、结球甘蓝）均为当地超市和农贸市场购买。

无水硫酸镁（国药集团化学试剂有限公司）；PSA、GCB、QuEChERS EN-提取包（内含4 g硫酸镁+1 g氯化钠+1 g柠檬酸钠+0.5 g柠檬酸氢二钠）（美国Agilent公司）；多壁碳纳米管（MWCNTs）和羟基多壁碳纳米管（MWCNTs-OH）（中国科学院成都有机化学有限公司）；冰乙酸（西陇化工股份有限公司），乙腈、乙酸乙酯（德国Merck公司）。157种农药标准品（纯度均≥ 95.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 仪器与设备

7890B-7000D气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent公司）；5810R高速低温离心机（德国Eppendor公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；VORTEX-2涡旋振荡器、KS40001控制型控温摇床、A11基本型分析研磨机（德国IKA公司）；AUTO-EVA-60全自动平行浓缩仪（睿科集团股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

称取10 mg（精确至0.01 mg）各农药标准品至10 mL容量瓶，用丙酮定容至刻度，配制成标准储备液。分别移取适量单标储备液，用乙酸乙酯定容配制成混合标准工作液。临用前用乙酸乙酯纯溶剂或者空白基质样品提取液将混合标准工作液配制成系列标准溶液，所有标准溶液均于-18 ℃避光保存。

1.3.2 样品处理

称取10 g（精确至0.001 g）匀浆后的蔬菜样品至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈和1颗陶瓷均质子，振荡10 min，加入QuEChERS EN-提取盐包，立即摇散，涡旋混匀1 min，以3 900 r/min离心5 min，上清液待净化。准确吸取3.0 mL上清液置预先装有净化材料的净化管（MgSO₄ 150 mg、PSA 75 mg、GCB 5 mg）中，涡旋混匀1 min，3 900 r/min离心5 min，吸取2.0 mL净化液在40 ℃水浴中氮吹至近干，精密加入1.0 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm有机滤膜，待GC-MS/MS分析。

1.3.3 色谱-质谱条件优化

色谱条件：HP-5 MS UI毛细色谱柱管（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min程序升温至170 ℃，再以10 ℃/min 升温至310 ℃，保持3 min；总运行时间：21 min；载气：高纯氮气（99.999%）；柱流速：0.87 mL/min；不分流进样；进样量：1.0 μL；进样口温度：280 ℃。

质谱条件： 离子源：EI源；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度：280 ℃。监测模式：动态多反应监测（dMRM）模式；溶剂延迟：2.5 min；碰撞气：氮气；淬灭气：氦气。通过查阅文献和标准，结合实验室自建农药质谱数据库建立目标化合物的特征离子碎片和碰撞能量，通过dMRM采集模式获得各个化合物的保留时间，针对个别化合物采用手动方式进一步优化质谱参数，建立了157种农药化合物的采集方法。该方法下空白芹菜基质中混合标准溶液（240 ng/mL）的提取离子流色谱见图1。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

本研究选择杀虫剂、杀菌剂、植物生长调节剂和除草剂等种类多、极性广的157种农药作为典型代表，通过优化提取和净化条件来改进前处理方法。乙腈是果蔬中农药残留检测的常用提取溶剂，由于其对农药的溶解性较好，对油脂和色素的提取率低，基质干扰少，使净化更简便。据报道乙腈中加酸可以有效保护一些不稳定农药，因此，本文比较了含0%、0.5%、1.0%、2.0%乙酸（HAC）的乙腈（ACN）溶剂对芹菜样品中目标化合物的提取效果（表1）。结果显示，随着乙腈中乙酸含量的增加，70%~120%农药的数量随之减少，回收率低于70%和高于120%的农药数量增多。因此，本文选取乙腈为提取溶剂。

2.2 净化条件的优化

净化填料包主要是吸附剂和吸水剂，目前常用的是PSA、GCB、MWCNTs、MWCNTs-OH吸附剂和MgSO₄吸水剂等，它们各自具有不同的净化效果。本文以150 mg MgSO₄和75 mg PSA为基础，分别考察了GCB（0、5、10、20、30 mg）、MWCNTs（3、5、10、20 mg）、MWCNTs-OH（3、5、10、20 mg）不同吸附剂种类及其用量净化后的回收率效果（图2）。^{通常蔬果中多种农残回收率在60%~120%范围，即满足农药多残留分析的要求［13］。本试验发现，3种吸附剂中MWCNTs-OH的整体净化效果最差，低于60%回收率的农药数较多；MWCNTs与GCB相比，MWCNTs高于120%回收率的农药数较多；以GCB为净化剂，当填料量从0 mg增加到20 mg时，处于60%~120%回收率的农药数量相当，其中填料量为5 mg时处于70%~120%的数量最多。因此，最终确定净化剂的填料及用量为150 mg MgSO₄、75 mg PSA和5 mg GCB。}

2.3 线性关系、检出限与定量限

采用系列基质混合标准工作液进样分析，以质量浓度（X，mg/L）为横坐标，其对应的峰面积（Y）为纵坐标绘制标准工作曲线。表2结果表明，157种农药在0.005~0.320 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.992 1。采用空白基质样品加标处理，分别以信噪比（S/N=3）和（S/N=10）表示方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），目标化合物的LOD为0.032~6.198 μg/kg，LOQ为0.107~19.496 μg/kg。可见，该方法下各个目标化合物均具有较好的线性关系，且灵敏度可满足方法学要求。

2.4 准确度和精密度

选取空白芹菜基质样品，添加0.01、0.02、0.10 mg/kg 3个水平的混合标准溶液进行加标回收试验，每个水平测定6次。表3结果显示，157种化合物在3个水平的下总体平均回收率为74.5%~117.3%，RSD为0.4%~10.5%。可见，本方法可快速高通量筛查衡量农药残留。

2.5 基质效应

GC-MS/MS检测农药残留时通常存在基质效应。蔬菜种类繁多，基质较为复杂，含有大量的天然色素和一些极性较大的杂质，产生的基质效应强度存在差异。基质效应（ME）是目标化合物在基质溶液中的信号强度（面积）与纯溶剂中的信号强度（面积）的比值。ME=1，为无基质效应，ME>1，为基质增强效应，ME<1，则为减弱效应。当ME介于0.8~1.2时为弱基质效应，可忽略不计；当介于0.5~0.8和1.2~1.5时为中等基质效应；当低于0.5或高于1.5时为强基质效应^［22-23］。将黄瓜、白菜、芹菜、韭菜、辣椒空白基质样品的提取液分别配制成与乙酸乙酯纯溶剂相同浓度的混合标准溶液，考察157种化合物在不同基质中的基质效应表现情况（图3），每个平行测定3次。结果表明，不同基质对目标化合物的基质效应不同，韭菜中的基质效应显著，芹菜和辣椒次之，黄瓜和白菜的基质效应较弱。目标农药在不同基质中的基质效应存在差异，除特丁硫磷亚砜、唑螨酯、异菌脲等农药为基质减弱效应，绝大多数农药呈增强效应；供试基质均以中弱基质效应为主，其中黄瓜和白菜为90%、94%，辣椒为88%，韭菜和芹菜为81%、82%。韭菜、芹菜的中等基质效应农药数量居多，黄瓜、辣椒和白菜以弱基质效应为主。因此，建议采用空白基质匹配法对样品进行定量分析，以减少基质效应对测定结果的影响。

2.6 实际样品测定

采用本文建立的方法对17种蔬菜共196份（白菜、芹菜、茄子、辣椒、番茄、莜麦菜和生姜各15份，黄瓜和韭菜各12份，莲藕和甜椒各10份，豆角和菠菜各9份，油菜和蘑菇各8份，豇豆11份，结球甘蓝2份）样品进行检测。结果显示，共检出农药42种，占总农药数的26.8%；检出的含量范围为0.111~1.736 mg/kg；按照GB 2763-2021限量判定，其中以芹菜中毒死蜱、二甲戊灵（图4），姜中的噻虫嗪和联苯菊酯，茄子中的毒死蜱和噻虫嗪，豇豆中的吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑超标的居多。根据《禁限用农药目录》（2022版）规定中禁止在蔬菜中使用的农药名单，本文检出的禁限用农药有毒死蜱、内吸磷、克百威、灭多威，其中未超标的农药为灭多威（1份芹菜）、毒死蜱（豆角2份）；超标的为克百威（辣椒1份、莜麦菜1份）、内吸磷（韭菜1份、芹菜1份）和毒死蜱（黄瓜、韭菜、辣椒和生姜各1份，芹菜3份，茄子2份），可见，市售蔬菜中存在禁限用农药隐性使用和超量使用情况。

3 结论

本研究将优化的分散固相萃取净化技术和GC-MS/MS相结合，建立了一套可同时测定蔬菜中157种农药残留的分析方法。样品经乙腈提取，分散固相净化剂（无水硫酸镁150 mg、PSA75 mg、GCB5 mg）净化后，气相色谱分离，用GC-MS/MS在dMRM模式下检测，基质匹配标准溶液外标法定量，通过方法学评价发现各组分的线性良好，检出限和定量限分别为0.032~6.198 μg/kg和0.107~19.496 μg/kg，样品平均回收率为74.5%~117.3%，RSD为0.4%~10.5%。该方法操作简便快速、定量准确灵敏，适用于不同基质样品中农药残留的高通量筛查，可为市场的有效监管提供技术支撑。

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基金资助

甘肃省科技计划重大项目(21ZD4NA016)

甘肃省市场监督管理局科技计划项目(SSCGJ-J202303)

甘肃省市场监督管理局科技计划项目(SSCJG-SP-A202308)

兰州市青年科技人才创新项目(2023-QN-180)