猪脐带血外泌体通过传递ssc-miR-451-5p靶向CDKN2D调节成肌细胞的增殖和分化

Pig umbilical cord blood exosomes regulate myoblast proliferation and differentiation by delivering ssc-miR-451-5p targeting CDKN2D

摘要

目的 研究猪脐带血外泌体（umbilical cord blood exosomes，UCB-Exos）和ssc-miR-451-5p对C2C12成肌细胞的功能调控，探究UCB-Exos及ssc-miR-451-5p对宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）猪肌肉发育的调控作用。 方法 以正常仔猪和IUGR仔猪为试验材料，分离并探究了UCB-Exos对C2C12成肌细胞的增殖和分化的调控作用，构建UCB-Exos的miRNA表达谱，筛选表达量最高的miRNA，使用CCK8、EDU和qRT-PCR等技术探究UCB-Exos及其表达量最高的miRNA对C2C12成肌细胞的调控作用，并采用双荧光素酶基因报告试验确定表达量最高的miRNA的靶基因，采用siRNA探究靶基因功能。 结果 UCB-Exos能够在体外显著促进C2C12成肌细胞的增殖和分化（P<0.05），正常仔猪与IUGR仔猪UCB-Exos 中miRNA的表达存在显著差异，鉴定到ssc-miR-451-5p为UCB-Exos中的表达量最高的miRNA；且ssc-miR-451-5p在正常仔猪UCB-Exos中表达量高于IUGR仔猪，其可以促进成肌细胞增殖并抑制分化，且直接靶向CDKN2D（细胞周期调控基因）执行其功能。 结论 IUGR与正常仔猪UCB-Exos miRNAs表达存在差异，UCB-Exos能够促进C2C12成肌细胞增殖分化，且UCB-Exos中表达量最高的ssc-miR-451-5p可通过靶向CDKN2D促进C2C12成肌细胞增殖并抑制分化。

Abstract

Objective To study the functional regulation of umbilical cord blood exosomes (UCB-Exos) and ssc-miR-451-5p on C2C12 myoblasts，and to explore the regulatory effects of UCB-Exos and ssc-miR-451-5p on muscle development in pigs with intrauterine growth retardation (IUGR). Method Using normal piglets and IUGR piglets as experimental materials，the regulatory effect of UCB-Exos on the proliferation and differentiation of C2C12 myoblasts was isolated and explored，the miRNA expression profile of UCB-Exos was constructed，the miRNA with the highest expression was screened，and the regulatory effect of UCB-Exos and its highest expressed miRNAs on C2C12 myoblasts was explored by CCK8，EDU and qRT-PCR.The target gene with the highest miRNA expression was determined by diluciferase gene reporter experiment，and the target gene function was investigated by siRNA. Result UCB-Exos was able to significantly promote the proliferation and differentiation of C2C12 myoblasts in vitro (P<0.05)，and there was a significant difference in the expression of miRNA in normal piglets and IUGR piglets UCB-Exos，and ssc-miR-451-5p was identified as the highest expressed miRNA in UCB-Exos，and ssc-miR-451-5p was expressed in normal piglets UCB-Exos than IUGR piglets.It promotes myoblast proliferation and inhibits differentiation，and directly targets CDKN2D (cell cycle regulatory gene) to carry out its functions. Conclusion IUGR is different from the expression of normal piglet UCB-Exos miRNAs，UCB-Exos can promote the proliferation and differentiation of C2C12 myoblasts，and the highest expression of ssc-miR-451-5p in UCB-Exos can promote the proliferation and inhibit the differentiation of C2C12 myoblasts by targeting CDKN2D.

Graphical abstract

关键词

IUGR / 脐带血 / 外泌体 / miR-451-5p / C2C12

Key words

IUGR / cord blood / exosomes / miR-451-5p / C2C12

Author summay

刘长豹，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

哺乳动物的肌肉发育和积累从胚胎期开始，大部分肌纤维通过胚胎和胎儿的成肌作用形成，而产后的肌纤维数量不再增加^［1］。在猪生产中，宫内发育迟缓（intrauterine growth retardation，IUGR）仔猪与正常仔猪相比，胚胎期和胎儿期肌细胞增殖和肌管肥大减少并持续到成年^［2］，导致IUGR仔猪由于肌肉发育不良而无法发挥其生长潜力，严重影响经济效益^［3］。猪是最易发生IUGR的家畜^［4］，并成为当今养猪业的一个主要威胁。造成IUGR的主要原因之一就是胎盘功能不足^［5］。而脐带作为连接胎盘和胎儿的纽带和胎儿输送营养的唯一途径，包含大量维持胚胎生长发育的营养物质，多种营养物质和激素的含量与胎儿出生体重呈现相关性^［6］，此外，脐带血的独特之处在于富含干细胞，其比骨髓来源的干细胞更原始，更适合细胞治疗，再生医学和组织工程^［7］。

近年来，外泌体介导的细胞间通讯已被广泛研究。外泌体是存在于各种体液中的直径为40~150 nm的囊泡，通过将其包被的核酸和蛋白质等传递给受体细胞来介导细胞间的交流^［8］。与细胞分泌的其他各种独立转录因子相比，外泌体能更有效地影响受体细胞^［9］。脐带血中含有丰富的外泌体，在妊娠期间，胎盘和脐带中各种细胞释放的外泌体通过脐血循环发挥作用^［10-11］，此外，外泌体浓度也与新生儿的体重相关^［12］。研究发现，脐带血干细胞衍生的外泌体可用于治疗多种疾病，并可避免干细胞移植治疗的许多不利影响^［13］。然而，最近的研究大多集中于外泌体在皮肤损伤修复^［14］、血管生成^［15］和其他疾病的治疗中的作用 ^［16-17］。此外有研究发现来自间充质干细胞和人类骨骼肌细胞的外泌体都能够促进损伤后的肌肉再生^［18-20］。miRNA是外泌体的功能执行者之一^［21-23］，但很少有研究探究脐带血外泌体（umbilical cord blood exosomes，UCB-Exos）及其衍生的miRNAs对胚胎期肌肉发育的调节机制。

本研究中假设母体生理变化导致的脐带血外泌体组成差异可能会导致IUGR仔猪的产生。因此本实验分离并探究UCB-Exos对C2C12成肌细胞的调控作用，分析正常仔猪和IUGR仔猪UCB-Exos中的miRNAs表达谱差异，并研究表达量最高的miRNA的作用机制。该研究有助于更好地了解UCB-Exos及其来源miRNA对胚胎期肌肉发育的影响，并为减少IUGR仔猪产生和提高肌肉产量提供了研究基础。

1 材料与方法

1.1 猪脐带血的采集和外泌体的分离鉴定

收集自然出生（具有良好的遗传背景，没有任何遗传缺陷，所有仔猪都是足月出生，妊娠期（113±2） d，新生约克夏仔猪脐带血。按照IUGR出生体质量标准（即出生体质量低于该窝的平均出生体质量1.5SD）选择3窝新生仔猪，每窝选出6头（体质量最轻和最重），并用抗凝血剂采集脐带静脉血。

按照Lasser等^［24］的方法分离脐带血中的外泌体，血液在PBS中1∶1稀释后，通过两步离心（4 ℃，2 000 g，30 min；4 ℃，12 000 g，45 min）和0.22 μm过滤器去除细胞、细胞碎片和较大囊泡，之后通过超高速离心（4 ℃，160 000 g，2 h）沉淀外泌体，并重悬于PBS中得到UCB-Exos，然后用外泌体分离试剂（Ribobio，中国广州）对UCB-Exos进行纯化。UCB-Exos的粒径用Zetasizer nano（MALVERN，英国）分析，其形态则用透射电子显微镜（TEM）观察，此外，将没有染色的外泌体被用作阴性对照，标记为NC，外泌体用CD63和CD81^［25-26］抗体染色，分别标记为CD63和CD81，并使用BD accuri C6（BD Biosciences，美国）检测抗体表达。

1.2 细胞培养和转染

C2C12成肌细胞（Procell，中国武汉）在含有10% FBS的DMEM（Gibco，中国上海）中生长，细胞保持在37 ˚C，5% CO₂的环境中。当C2C12成肌细胞的密度达到80%时，将10%的FBS换成含有2%马血清（Gibco，中国上海）的分化培养基来诱导分化。通过在细胞孔中加入培养液总体积10%的外泌体（最终浓度为0.15 mg/mL）来验证外泌体的功能。ssc-miR-451-5p模拟物（mimics）、抑制剂（inhibitor）和相应的阴性对照（NC）购自Ribobio（中国广州），siRNA（序列见表1）由生工生物（中国上海）合成，按照RibobioFECT™ CP（Ribobio，中国广州）说明书进行转染，mimics、inhibitor、siRNA和相应的NC终浓度均为100 nmol/L。

1.3 UCB-Exos miRNA测序分析和qRT-PCR验证

各3头正常和IUGR仔猪的UCB-Exos样本被用来构建miRNA文库。用Trizol LS（Thermo Fisher Scientific，中国上海）提取UCB-Exos的总RNA，并由联川生物（中国杭州）进行miRNA测序。miRNA的测序数据被上传到NCBI的Gene Expression Omnibus，可以通过Accession Number GSE87111获取。C2C12成肌细胞的总RNA通过Trizol（Takara，中国北京）提取，PrimeScript ™ RT试剂盒与gDNA Eraser（Takara，中国北京）和Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara，中国北京）分别用于mRNA和miRNA的逆转录。qRT-PCR反应使用TB Green^® Premix Ex Taq™ II（Takara，中国北京）进行，U6和GAPDH分别作为miRNAs和mRNAs的内源对照。2^-ΔΔCq法用于量化miRNAs的表达水平。所有使用的引物都是由生工生物（中国上海）合成，其序列见表2。使用CFX-PCR系统（Bio-Rad，中国）进行qRT-PCR反应。

1.4 ssc-miR-451-5p靶基因分析

按照杨敏等人的方法^［27］，首先采用Targetscan^［28］、miRDB^［29］和miDIP^［30］结合分析ssc-miR-451-5p的潜在靶基因，分析结果中的重叠部分被认为是潜在的候选靶基因。之后使用双荧光素酶基因报告试验确定靶标关系，具体操作如下：当细胞密度约为50%~70%时，使用LipoFiter（HANBIO，中国上海）转染ssc-miR-451-5p mimics或NC（5 pmol）和CDKN2D野生型或突变型3′UTR荧光素酶基因报告载体（0.16 μL）。转染48 h后，用被动裂解缓冲液裂解细胞，取上清液（4 ℃，12 000 r/min，10 min），100 μL荧光素酶检测试剂II（Progema，中国北京）和20 μL 上清液加入96孔板中，测量萤火虫荧光素酶值（内部参考值），加入100 μL Stop & Glo^®试剂（Progema，中国北京），测量Renilla荧光素酶值（报告基因发光值）。

1.5 C2C12成肌细胞的增殖和分化试验

将C2C12成肌细胞铺至96孔板中，当密度达到30%左右时进行转染。用Cell Counting Kit-8（CCK8）试剂（Solarbio，中国北京）检测细胞增殖活性。在12、24、36、48 h向孔中加入10 μL CCK8试剂。在37 ℃孵育1 h后，用酶标仪（SpectraMax M5/M5e，美国）检测450 nm处吸光度。转染48 h后，用EDU试剂（Ribobio，中国广州）对细胞进行染色，并在荧光显微镜（Leica Microsystems GmbH Ernst-Leitz-Strasse 17-37 D-35578 Wetzlar，德国）下获得图像。使用Image J软件分析图像，计算EDU阳性细胞（橙色）的百分比。 450 nm处的吸光度值越高，EDU阳性细胞的百分比越高，说明细胞增殖活性越高。将C2C12成肌细胞铺至6孔板中，当细胞密度达到约80%时进行转染，转染后6 h更换分化培养基。分化4 d后，收集细胞并提取RNA。通过qRT-PCR检测成肌细胞分化标志基因MyoG、MyHC和MyoD的表达水平。

1.6 统计学分析

使用Graphpad prism 6.02 （GraphPad Software，美国）对数据进行独立t检验，数值表示为\overline{x}±s。每个试验组至少有3个重复，P<0.05被认为存在显著差异（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.000 1），NS表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 猪UCB-Exos的鉴定

分离提取的UCB-Exos在TEM下显示出清晰的囊泡结构（图1-A）。用纳米颗粒追踪分析法分析外泌体的粒径大小，其粒径大小在30~100 nm之间（图1-B），其表面标志物CD63和CD81呈阳性表达（图1-C~D）。这些结果表明，通过超速离心法提取的纳米级囊泡是外泌体。

2.2 猪UCB-Exos促进C2C12成肌细胞的增殖和分化

转染UCB-Exos后，CCK8检测到UCB-Exos处理组在450 nm吸光度在24 h后显著高于对照组（图2-A）。由图2-B可见，UCB-Exos处理组可以明显增加EDU阳性细胞数量，UCB-Exos处理组EDU阳性细胞比例显著高于对照组（P<0.01）。UCB-Exos处理的C2C12成肌细胞分化4 d后，成肌细胞分化的标志基因MyoD和MyoG的相对表达量显著增加（P<0.05），MyHC的相对表达量也呈现增加的趋势（图2-D）。这些结果表明，UCB-Exos能够促进C2C12成肌细胞的增殖和分化。

2.3 ssc-miR-451-5p在猪UCB-Exos中高表达

为了探索来自UCB-Exos的miRNAs在调节肌细胞增殖和分化方面的潜力，通过测序确定了正常和IUGR仔猪UCB-Exos中表达量前三名的miRNAs分别为ssc-miR-451-5p、ssc-miR-92a-3p、ssc-miR-486-5p。其中，ssc-miR-451-5p的表达量最高，且正常仔猪UCB-Exos中ssc-miR-451-5p的表达水平高于IUGR仔猪（图3-A）。qRT-PCR结果显示，ssc-miR-451-5p的表达在C2C12成肌细胞的增殖过程中逐渐增加（图3-B），且miR-451-5p在不同物种间广泛保守，人、小鼠和猪的miR-451-5p序列见图3-C。结果表明ssc-miR-451-5p可能影响C2C12成肌细胞增殖和分化功能。

2.4 ssc-miR-451-5p促进C2C12成肌细胞的增殖并抑制分化

转染ssc-miR-451-5p mimics 48 h后，ssc-miR-451-5p的相对表达水平显著（P<0.05）增加（图4-A）。CCK8法检测到转染ssc-miR-451-5p mimics后显著增加了C2C12成肌细胞的增殖活性（图4-B），而转染inhibitor的结果则相反。使用EDU检测的结果与CCK8检测的结果相似，转染ssc-miR-451-5p mimics后，EDU阳性细胞的比例显著增加（P<0.01），而转染inhibitor后的比例显著下降（P<0.01）（图4-C~D）。上述结果表明，ssc-miR-451-5p可以促进C2C12成肌细胞的增殖。然而，在转染ssc-miR-451-5p mimics 4 d后，qRT-PCR结果显示，分化标志基因MyHC（P<0.000 1）、MyoD（P<0.05）和MyoG（P<0.05）的表达水平显著降低（图4-E），说明ssc-miR-451-5p可以显著抑制C2C12成肌细胞的分化。

2.5 ssc-miR-451-5p靶基因的筛选和验证

经过TargetScan、miRDB和miDIP预测到CDKN2D为ssc-miR-451-5p的一个潜在靶基因（图5-A）。CDKN2D是细胞周期的调控基因之一，因此选择探究ssc-miR-451-5p是否通过靶向抑制CDKN2D来执行其功能。转染ssc-miR-451-5pmimics后，CDKN2D的表达水平显著下降（P<0.01），表明ssc-miR-451-5p可以抑制CDKN2D的表达水平（图5-B）。通过设计CDKN2D野生型或3′-UTR突变型的荧光素酶载体并转染，结果显示，只有同时转染ssc-miR-451-5pmimics和CDKN2D 3'UTR野生型质粒时，荧光素酶的相对活性显著（P<0.000 1）下降，表明ssc-miR-451-5p直接与CDKN2D 3'UTR结合（图5-C）。

2.6 干扰CDKN2D促进C2C12成肌细胞增殖并抑制分化

为了探讨ssc-miR-451-5p是否通过抑制CDKN2D基因来调节C2C12成肌细胞的增殖和分化，用siRNA转染干扰了CDKN2D的表达。如图6-A所示，转染siRNA显著（P<0.000 1）降低了CDKN2D的表达水平。CCK8结果显示，干扰CDKN2D表达后，C2C12成肌细胞在450 nm处的吸光度显著增加（图6-B），EDU结果显示，干扰CDKN2D表达后，EDU阳性细胞比例显著增加（P<0.01，图6-C）。如图6E所示，干扰CDKN2D表达分化4 d后，分化标志基因MyHC和MyoD相对表达量显著下降（P<0.05），而MyoG的相对表达量差异不显著。上述结果表明，抑制CDKN2D的表达水平促进了C2C12成肌细胞的增殖并抑制分化。

3 讨论

在哺乳动物的发育过程中，肌纤维在出生前大量积累^［31］，而胚胎肌纤维积累不良是导致IUGR的一个重要原因，并显著影响家畜的生理活动。本研究中假设UCB-Exos可以作为母体和胎儿之间的重要沟通媒介调节产前肌肉发育，因此探究了UCB-Exos对C2C12成肌细胞的调节功能，结果显示，UCB-Exos可以增强C2C12成肌细胞的增殖和分化，其中分化标志基因MyHC和MyoD的表达量显著提高，而MyHC的表达量表现出提高的趋势，这可能与MyHC在C2C12成肌细胞分化过程中的时序表达和外泌体中miRNA的选择性包被有关^［32-33］。这个结果与之前的研究类似，例如胎牛血清中的细胞外囊泡会通过影响增殖过程中的基因表达显著改变肌肉细胞的表型和促进细胞增殖^［34］。胎牛血清中的外泌体也能够通过对Tceal5和Tceal7基因的下调，在体外对C2C12成肌细胞的分化产生调控作用^［35］。此外，来自幼年小鼠血液中的细胞外囊泡也能够使线粒体活性和骨骼肌再生恢复活力^［36］。脐带血是一种很好的干细胞来源，这些干细胞衍生的外泌体对肌肉发育的调控作用逐渐成为研究热点，例如干细胞来源的外泌体通过circHIPK421下调miR-3，从而增加FOXO3a的表达，从而抑制细胞凋亡以及IL-1β和IL-18的释放，以防止缺血性骨骼肌损伤^［37］。其次，间充质基质细胞外泌体在杜氏肌营养不良症中能够发挥积极的治疗作用，具体表现为能显著促进成肌细胞的分化，并降低纤维化基因的表达^［38］；另一项研究也表明外泌体能够通过稳定营养不良小鼠受损的肌纤维膜诱导肌肉功能改善并缓解肌肉退化^［39］。这表明，除了能促进受损组织的修复和再生外，UCB-Exos还可能通过脐带血循环在促进肌肉发育方面发挥了重要作用。

猪UCB-Exos中富集的 ssc-miR-451-5p对肌肉表现出与各种干细胞外泌体相似的积极作^［40］，我们的结果发现ssc-miR-451-5p可以显著促进C2C12成肌细胞的增殖并抑制分化。据报道，通过靶向不同的mRNA来调控多种途径，miR-451-5p起到了肿瘤抑制者的作用^［41］。例如，miR-451-5p靶向ATF基因，从而抑制了人类乳头状甲状腺癌细胞的增殖^［42］。此外，有研究表明ssc-miR-451-5p可以通过靶向ACACA调控猪的原代脂肪细胞分化，影响猪肉的脂肪含量和脂肪酸组成^［43］。然而，很少有研究调查UCB-Exos及其来源的ssc-miR-451-5p对肌肉生长和发育的影响。ssc-miR-486-5p和ssc-miR-92a-3p，在正常与IUGR仔猪UCB-Exos中也差异表达，其中miR-486-5p在肌肉中富集表达且保守性良好^［44］，过表达可改善肌肉的生理功能及其强度^［45］；之前研究也发现miR-486-5p在衰老加速小鼠和晚期传代C2C12成肌细胞中均显着降低^［46］。此外miR-486-5p在孕妇血浆中的下调可能与复发性流产有关^［47］。而miR-92a-3p也是外泌体中所富集的miRNA之一，研究表明其通过靶向WNT5A调节软骨发育和体内平衡^［48］，增强软骨形成并抑制软骨降解^［49］。因此，作为外泌体中执行通讯功能的重要介质，miRNA的差异表达可能对胎儿生长发育产生发挥着不容小觑的影响。

作为细胞周期的调节器，CDKN2D在细胞增殖和分化过程中起着巨大的作用^［50］，该基因编码的蛋白质是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂INK4家族的成员，起到控制细胞周期G1进展的细胞生长调节剂的作用。此外许多研究表明CDKN2D还参与DNA损伤修复^［51］、细胞凋亡^［52］、细胞衰老^［53］、抑制神经元增殖^［54］以及精子发生^［55］等方面的调控。我们发现，上调ssc-miR-451-5p导致CDKN2D的表达下调，并促进了C2C12成肌细胞的增殖并抑制分化。当用siRNA干扰CDKN2D的表达时，也观察到相似的结果，这表明ssc-miR-451-5p能够通过降低CDKN2D的表达来促进成肌细胞增殖并抑制分化。我们的研究丰富了UCB-Exos的功能研究，揭示了UCB-Exos对C2C12成肌细胞的调节作用，并发现其促进成肌细胞增殖的作用可以通过ssc-miR-451-5p靶向CDKN2D来完成，但对出生前肌肉发育的调控作用，还需进一步研究。研究还发现，IUGR的产生可能与UCB-Exos中miRNA的表达有关，这为减少IUGR和提高肌肉产量提供了一些依据。

4 结论

综上，本研究结果表明 UCB-Exos可以促进C2C12成肌细胞增殖和分化。UCB-Exos来源的ssc-miR-451-5p可以通过靶向CDKN2D基因促进C2C12的细胞增殖并抑制分化。

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基金资助

重庆市自然科学基金项目(cstc2020jcyj-msxmX0961)

重庆市科研机构绩效激励引导专项项目(21530)