冷季不同饲养方式下牦牛皮下脂肪转录组分析

Transcriptome analysis of subcutaneous fat in yaks under different feeding regimes during the cold season

摘要

目的 旨在探究牦牛冬季自然放牧和舍饲条件下皮下脂肪转录表达差异。 方法 以9头18月龄体质量相近、背部皮下脂肪差异不显著的牦牛为试验对象，随机分为3组，于试验初期（10月）选取对照组（G18）牦牛进行屠宰，试验组1（G24）继续放牧6个月，试验组2（F24）舍饲6个月分别屠宰，采集3组背部皮下脂肪进行转录组测序、差异表达基因筛选以及富集分析。 结果 本研究获得了9个cDNA文库，差异表达分析结果显示，在G18vsF24中检测到上调基因160个，下调基因249个，其中有309个差异基因富集到262个通路中，主要有PPAR信号通路、甘油酯代谢、AMPK信号通路等；在G18vsG24中检测到上调基因615个，下调基因361个，其中有735个差异基因富集到317个通路中，细胞因子-细胞因子受体相互作用、不饱和脂肪酸生物合成等；在F24vsG24中检测到上调基因161个，下调基因91个，其中有188个差异基因富集到249个通路中，趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和甘氨酸、丝氨酸及苏氨酸代谢等。 结论 本研究结果揭示了不同饲养方式基因差异表达、富集通路信息的不同，为进一步深入探究牦牛皮下脂肪的分子调控以及对牦牛脂肪沉积的研究提供了参考。

Abstract

Objective The aim of this experiment was to investigate the differences in transcript expression in subcutaneous fat of yaks under natural grazing and winter housing conditions. Method Nine 18-month-old yaks with similar body weight and non-significant differences in back subcutaneous fat were randomly divided into three groups，and the control group (G18) was slaughtered at the beginning of the experiment (October)，the test group 1 (G24) continued to graze for 6 months，and the test group 2 (F24) was housed for 6 months，three groups of back subcutaneous fat were collected for transcriptome sequencing，differentially expressed gene screening and enrichment analysis. Result Nine cDNA libraries were obtained，and differential expression analysis showed that 160 up-regulated genes and 249 down-regulated genes were detected in G18vsF24，of which 309 differential genes were enriched in 262 pathways，mainly PPAR signaling pathway，glycerol ester metabolism，AMPK signaling pathway，etc.；615 up-regulated genes and 361 down-regulated genes were detected in G18vsG24 361 down-regulated genes were detected in G18 vs.G24，of which 735 differential genes were enriched into 317 pathways，cytokine-cytokine receptor interaction，unsaturated fatty acid biosynthesis，etc.；161 up-regulated genes and 91 down-regulated genes were detected in F24 vs.G24，of which 188 differential genes were enriched in 249 pathways，chemokine signaling pathway，cytokine-cytokine receptor interaction，and glycine，serine and threonine metabolism，among others. Conclusion The results reveal the differences in gene differential expression and enrichment pathway information in different feeding regimes，and the results provide a reference for further in-depth investigation into the molecular regulation of subcutaneous fat in yaks and the study of fat deposition in yaks.

Graphical abstract

关键词

牦牛 / 皮下脂肪 / 转录组测序 / 自然放牧 / 舍饲

Key words

yak / subcutaneous fat / transcriptome sequencing / natural grazing / housing

Author summay

丁维芹，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

牦牛（Bos grunniens）主要分布在青藏高原及其毗邻的高山和亚高山地区^［1］，为当地人民提供肉、奶、皮毛等畜产品。目前，全世界约有1 700余万头牦牛，我国牦牛数量占全世界95%以上。牦牛对青藏高原高寒极端环境和天然牧草季节性营养匮乏所形成的营养胁迫有较强的适应性，其采食行为及脂肪沉积与普通牛有较大差异。在暖季，由于牧草充足，牦牛采食大量营养价值高的牧草，其体质量及体脂在短时间内得到大量沉积；在冷季，由于牧草匮乏，需靠消耗前期体内蓄积的脂肪维持生命。通过摄取天然牧草的传统放牧的牦牛呈现春乏、夏饱、秋肥、冬瘦的循环生产模式；自然放牧条件下暖季结束期牦牛皮下及内脏脂肪均得到大量沉积，膘情良好；而在冷季结束后牦牛皮下及内脏脂肪几乎消耗殆尽，仅有零星小团脂肪分布^［2］。研究发现牦牛的生长与牧草之间有着密切的联系，牧场可食牧草种类数量越多、牧草的粗蛋白和粗脂肪含量越高，牦牛生长越好^［3］。

青藏高原牧场进入枯草期以后，牦牛皮下脂肪组织大量消耗，说明牦牛皮下脂肪组织分解是维持枯草期自身基础代谢的主要能量来源^［7］。皮下脂肪（subcutaneous fat，SF）约占动物总脂肪含量的70%左右，主要是白色脂肪组织，为机体提供隔热和保护作用。有报道发现，皮下脂肪组织的减少通过两个因素：一是抑制脂质物质积累和促进脂肪分解；二是抑制脂肪细胞的增殖和分化^［8］，牦牛的生活条件有着漫长冬季及枯草期长等特点，在寒冷的枯草季节，皮下脂肪对于牦牛的御寒和供能有着十分重要的作用。RNA-Seq 是基于深度测序（deep-sequencing）对特定组织及细胞所转录出来的总RNA进行研究。已有研究对牦牛的睾丸、卵巢、心脏、脂肪等多个组织器官及不同发育阶段的卵母细胞和胚胎细胞进行了转录组分析^{［1，4-6］}。因此，了解枯草期牦牛皮下脂肪组织差异基因及代谢通路的变化是牦牛养殖业在牧草匮乏时期的主要目标。已有研究发现牦牛皮下脂肪的沉积和消耗对其枯草期适应性尤为重要，但是对于牦牛皮下脂肪代谢研究甚少。本研究对放牧和舍饲条件下牦牛皮下脂肪进行转录组测序，并进行差异表达基因筛选和功能注释，寻找差异表达基因和信号通路，以期为牦牛脂肪代谢提供遗传参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取青海省海北藏族自治州祁连县梅龙掌畜牧业经营专业合作社9头18月龄自然放牧、体态健康、体质量相近的公牦牛，随机分为3组，每组3个重复。试验开始（10月份）屠宰3头（G18），剩余6头分两组，一组在原群体自然放牧6个月至24月龄（G24）；另一组异地（甘肃民乐，海拔2 200 m）全舍饲育肥6个月（F24）。试验结束后屠宰试验组牦牛后采集背部皮下脂肪，放入液氮罐后运回实验室，置于-80 ℃保存备用。

1.2 饲养管理

放牧组牦牛每天07∶00~18∶00 在同一草场放牧，放牧期间自由采食，自由饮水。放牧草场主要优势种牧草有针茅、早熟禾、矮嵩草及小嵩草等，自由放牧组饲草的营养水平见表1。舍饲组牦牛采用TMR全混合日粮模式饲喂，于07∶00和17∶00各饲喂一次，每天仔细观察试验牛的采食、饮水、反刍、粪便及精神状况，并做好相关记录。本试验所用精料（甘肃省民乐县某饲料厂）为颗粒状，基础饲粮组成及营养水平见表2。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA的提取、质检和定量

总RNA按照试剂盒（Invitrogen，USA）说明提取后，用NanoDrop 2 000分光光度计（ThermoFisher，USA）紫外分光光度计检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。质检合格后送上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序。

1.3.2 文库构建及质量测序

RNA-Seq测序需要构建的cDNA文库按照Illumina（Illumina，USA）试剂盒说明进行操作。文库检测合格后均采用Illumina测序仪进行双末端测序。

1.3.3 测序数据分析

使用fastp将原始序列rRaw reads）进行质控，获得高质量的质控数据（clean reads）后开展后续分析。将质控后的Clean reads，采用Hisat与参考基因组（LU_Bosgru_v3.0）进行比对。使用基于负二项分布的DESeq2 差异分析软件以P-value <0.01& |log₂FC| ≥1为条件分析数据之间的差异表达，鉴定出差异表达的基因（different expression genes，DEGs）。使用上海美吉生物医药科技有限公司在线云平台（https：//report.majorbio.com/wholerna/geneset_overview/task_id/3u9i_gd0m9b1vc1jkgt4jsbc2a9.html），对DEGs进行GO功能注释分析和KEGG通路富集分析。

2 结果与分析

2.1 测序数据质控

本研究共构建9个测序文库，通过Illumina测序平台对自然放牧18月龄牦牛（yak_18m_G_SF）、自然放牧24月龄牦牛（yak_24m_G_SF）和舍饲6个月至24月龄牦牛（yak_24m_F_SF）背部皮下脂肪的cDNA文库进行测序。测序数据总量为76.13 Gb，样品的原始数据（raw reads）在112682658~134611426范围内，进一步过滤得到高质量序列（clean reads）在111875262~133828336范围内。另外在9个测序文库中，错误率（Error rate）均控制在0.025%以下，GC含量在47.78%~51.36%，同时9个测序文库中Q20和Q30分别在 98.10%和94.50%以上。测序质量数据统计如表3所示。从以上结果可见，测序数据的质量较好，符合后续试验要求。

2.2 序列比对分析

质检合格的clean reads与牦牛参考基因组（LU_Bosgru_v3.0）比对结果如表4所示。每个样品的比对率均在92.0%以上，比对结果较好。其中有76.72%以上的clean reads在参考序列上有唯一比对位点，有10.42%~15.74%在参考序列上有多个比对位点，比对率和可靠程度高，可用于后续分析。

2.3 基因表达分析

如图1所示，根据RNA-Seq数据与牦牛基因组注释的结果，以TPM>1.0为标准，绘制G18_SF、G24_SF和F24_SF样本间韦恩图。分别在G18_SF、G24_SF和F24_SF检测到13 983、14 143和14 051个基因。G18_SF、G24_SF和F24_SF中，特有的表达基因分别有217、308和154个，3组样品中共表达的基因有13 460个。

2.4 差异表达基因的分析

本研究以P-value <0.01且 |log₂FC| ≥1为标准筛选DEGs，由图2-A可以看出，G18 vs F24组间共筛选到409个DEGs，其中上调基因160个，下调基因249个；对G18 vs G24组间共筛选976个DEGs，其中上调基因615个，下调基因361个；F24 vs G24组间共筛选252个DEGs，其中上调基因161个，下调基因91个。其中，G18 vs G24之间显著差异基因数目最多，表明自然放牧至24月龄的牦牛皮下脂肪调控机制更加复杂。对3组样本间的DEGs进行分析，Venn 图结果显示（图2-B），G18 vsG24和 G18vsF24有190个共表达基因；G18vsG24和F24vsG24有101个共表达基因；G18vsF24和F24vsG24有26个共表达基因；3组样本间有1个共表达基因；G18vsF24、G18vsG24、和F24vsG24分别有194、686和126个特有的DEGs。

2.5 差异表达基因的表达模式聚类分析

为了探究表达量高于50的差异表达基因在牦牛皮下脂肪中的表达变化规律，将筛选出的106个DEGs进行表达模式聚类分析（图3）。2个基因分支离得越近，说明其表达量越接近；各样本分支离的越近，表明样本所有基因的表达模式越接近，即yak_18m_G_SF1、yak_18m_G_SF2以及yak_18m_G_SF3基因表达变化趋势相近；yak_24m_F_SF1、 yak_24m_F_SF2以及 yak_24m_F_SF基因表达变化趋势相似；yak_24m_G_SF1、 yak_24m_G_SF2以及yak_24m_G_SF3基因表达变化趋势相似。ECHDC1、FASN、SCD、DGAT2和ACSL1在G18中高于其他2组（F24和G24）。不同饲养方式对牦牛皮下脂肪中的基因表达存在明显的差异，自然放牧24月龄的牦牛皮下脂肪组织各基因与自然放牧18月龄的牦牛皮下脂肪各基因相比差异表达明显，表明枯草期放牧草场由于牧草数量和质量的下降、天气寒冷等恶劣条件，需要大量与脂肪相关的基因表达来维持机体的基础活动；枯草期舍饲6个月的牦牛皮下脂肪组织各基因与自然放牧24月龄的牦牛皮下脂肪各基因相比存在表达差异，说明冬季舍饲喂养与自然放牧牦牛皮下脂肪差异表达基因的表达量不同。

2.6 GO功能注释分析

GO功能注释可分为三大类：细胞组分（celluar component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物学过程（biological process，BP）。G18vsF24、G18vsG24和F24vsG24的各差异表达基因分别注释到49、51和45个GO条目中。本研究选取每个对照组的前20个GO term进行展示（图4）。结果显示，各样本组差异基因显著注释到生物过程中的代谢过程（metabolic process）、生物调节（biological regulation）及细胞过程（cellular process）等；分子作用中的催化活性（catalytic activity）及构建（binding）等；细胞组分中的细胞器的部分（organelle part）、细胞器（organelle）及细胞部分（cell part）等，除上述条目以外，G18vsG24在细胞组分中的膜部分（membrane part）得到注释；F24vsG24在生物学进程中的对刺激的反应（response to stimulus）条目中得到注释。

2.7 KEGG富集通路分析

对3个对比组差异表达基因进行KEGG富集通路分析，确定其发挥的生物学功能，参与的代谢途径和信号转导途径。在G18vsF24中共有309个差异基因得到富集，涉及到262个通路信息，其中显著表达的通路有35条（图5-A），差异基因显著富集在乙醛酸酯和二羧酸酯代谢（glyoxylate and dicarboxylate metabolism）、丙酮酸代谢（pyruvate metabolism）、柠檬酸循环（TCA cycle）、PPAR信号通路（PPAR signaling pathway）、不饱和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）、丙酸代谢（propanoate metabolism）、甘油酯代谢（glycerolipid metabolism）、脂肪酸延长（fatty acid biosynthesis）、AMPK信号通路（AMPK signaling pathway）等与脂肪代谢相关的通路，其中TCA cycle富集程度最大；在G18vsG24中共有735个差异基因得到富集，涉及到317个通路信息，其中显著表达的通路有31条（图5-B），差异基因显著富集在酒精中毒（alcoholism）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、不饱和脂肪酸生物合成（biosynthesis of unsaturated fatty acids）等，其中biosynthesis of unsaturated fatty acids富集程度最大；在F24vsG24中共有188个差异基因得到富集，涉及到249个通路信息，其中显著表达的通路有44条（图5-C），差异基因显著富集在趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、原发性免疫缺陷（primary immunodeficiency）、造血细胞谱系（hematopoietic cell lineage）Fcγr介导的吞噬作用（Fc gamma R-mediated phagocytosis）、甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢（glycineserine and threonine metabolism）等，primary immunodeficiency富集程度最大。

总之，通过筛选DEGs发现，AMPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路在3个对比组中常见。这3条通路中富集的DEGs如表5所示。由表6可知，在PPAR信号通路中随机选取了3个DEGs，其中有2个DEGs在G18vsF24和G18vsG24中下调，在F24vsG24中上调（ACACA、SREBF1）；有1个DEG在G18vsF24中下调，在G18vsG24和F24vsG24中上调（PRKAG3）。在细胞因子-细胞因子受体相互作用中随机选取了2个DEGs，其中C1QTNF6在G18vsF24和G18vsG24中下调，在F24vsG24中上调；EPOR在3个对比组中均上调。在趋化因子信号通路中随机挑选了2个DEGs，其中PRKCD基因在3个对比组中上调；ADCY5基因在3个对比组中下调。

3 讨论

牦牛是生活在青藏高原极其毗邻地区的大型反刍动物，其皮下脂肪深受牧草季节变化的影响。牦牛自然放牧大都处在海拔高、气候条件恶劣的地区，适当对牦牛进行补饲，能够有效地降低牦牛自身的能量消耗，牧区对放牧牦牛在冷季补饲显得十分重要。高寒地区青草期时间短，牧草在5月底返青，10月左右进入枯草期^［9］。进入枯草期后，牦牛的采食量因牧草数量减少而下降，自身基础生命活动需要量不能通过自由采食获取，从而动员前期储存的大量脂肪为自身提供能量。研究发现，牦牛脂肪沉积能力存在一个增强到极值后逐渐减弱的趋势^［10］。从九月到次年四月份，牦牛体内的脂肪需要为机体自身提供能量故呈现一个逐渐递减的过程，脂肪不断消耗。在牧草匮乏的冷季，牦牛通过自由采食获得的能量不能满足自身正常的生理需求；同时，舍饲的牦牛皮下脂肪的含量变化不明显，这表明牦牛在枯草期通过补充饲草可以满足基础生命活动的需求，这与熊琳^［4］在放牧牦牛脂肪沉积上的研究一致。本研究以枯草期自由放牧和舍饲条件下牦牛皮下脂肪为研究对象，通过分析18月龄、24月龄牦牛皮下脂肪组织的转录组变化，筛选出不同饲养条件下参与牦牛皮下脂肪组织代谢的基因及相关通路。

本研究对高表达的基因进行聚类分析，我们发现了ECHDC1、FASN、SCD、DGAT2和ACSL1等5个与脂肪合成相关的基因在G18中的表达量高于其他2组（F24和G24），这与冷季脂肪参与能量代谢有关。ECHDC1（烯酰辅酶A水合酶）被认为是脂肪酸β氧化过程中的关键酶，主要参与催化脂肪酸氧化的水化过程^［11］。FASN（脂肪酸合酶）被认为是一种参与动物长链饱和脂肪酸合成的多功能蛋白质。有研究发现FASN基因参与猪的脂质代谢^［12］。在牛羊上，Dongyep等^［13］发现FASN基因表达量与不饱和脂肪酸含量显著正相关，该基因表达量对牛羊脂肪沉积作用明确。SCD（硬脂酰辅酶A去饱和酶）是定位在内质网的跨膜蛋白，在脂质代谢过程中起到重要的作用，它可以催化机体合成不饱和脂肪酸。有研究表明，有些变温动物在寒冷的环境中，机体中的SCD mRNA的表达量会明显增高^［14］。本研究结果显示SCD基因在冷季初期G18组中含量最高，与此研究结果相反，这可能是由于动物品种差异带来的SCD基因表达的不同。DGAT2（二脂酰甘油酰基转移酶2）是生物体内一种非常重要的内质网细胞微粒体酶，其参与三酰甘油合成反应的最后一步，并且是该过程中的唯一关键限速酶^［15］。ACSL1（长链酰基辅酶A合成酶1）被认为是线粒体内脂肪酸氧化代谢的关键酶，该酶不仅可以激活细胞内脂肪酸代谢，而且还参与外源脂肪酸摄取的调节^［16］。以上5个基因在G18、G24和F24均表达，均与脂肪酸代谢有关，表明这5个基因通过脂肪酸代谢调节脂肪的代谢导致了在G18中的表达量高于G24和F24.

脂肪代谢受到多个组织共同调控，脂肪组织、肝脏和肌肉组织是最重要的调控部位^［17］。脂肪的沉积能力与甘油三酯的生成、储存、运输及脂肪酸氧化和合成的程度相关^［18］ 。本研究对不同饲养方式下牦牛皮下脂肪相关基因表达进行差异表达分析，在3个对比组中共发现1 637个DEGs，其中上调基因936个，下调基因701个，对其进行富集通路分析发现，共有的AMPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路被认为是脂肪代谢相关的关键通路。

在本研究中，发现在不同饲养条件下牦牛皮下脂肪3个对比组均有AMPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路富集，并且每条通路上富集了多个基因（表3）。AMPK主要调控细胞内的代谢和维持能量平衡，调节哺乳动物全身新陈代谢^［19］。AMPK信号通路中的基因通过影响AMPK的活性来影响组织中脂代谢。ACACA（乙酰辅酶A羧化酶）是ACACA基因编码的脂肪酸从头合成的关键限速酶，在脂肪酸代谢过程中起到重要的调控作用，主要在脂肪生成活跃的组织表达^［20］。SREBF1 是脂质合成的主要调控因子，能通过调控脂肪酸的合成影响脂质聚集^［21］，进而促进脂肪生成。PPKAG3是编码一磷酸腺苷激活蛋白激酶AMPKγ亚基γ3基因具有组织表达特异性，主要在骨骼肌中表达^［22］。PPKAG3通过编码γ亚基来调节AMPK活性进而参与体内营养代谢过程。在本研究中，细胞因子-细胞因子受体相互作用通路主要在脂代谢过程中。C1QTNF6（肿瘤坏死因子相关蛋白6）被认为是脂联素副产物的一个新的高度同源家族成员，主要在脂肪组织中表达。有研究发现，该基因在肥胖患者的皮下脂肪中高表达^［23］。有研究结果表明，C1QTNF6不仅可以通过诱导成脂基因的表达，还可以通过降低脂质基因的表达来促进成脂^［24］。EPOR（促红细胞生成素受体）的主要作用是调节红细胞的产生，有研究发现，牦牛小脑蚓前叶的EPO和EPOR在低氧状态下表达量最高^［25］，而该基因在3个对比组中均表现上调，这可能与牦牛生活的高原低氧环境有关。趋化因子信号通路中的PRKCD可经调控死亡受体表达，来影响内质网应激介导的细胞凋亡^［26］。有研究发现，内质网应急会导致小鼠脂代谢紊乱^［27］，我们由此推断，该基因表达量的变化导致了牦牛皮下脂肪组织脂代谢的变化。 ADCY5（腺苷酸环化酶5）是膜结合型腺苷酸环化酶家族的成员之一，它能影响糖代谢^［28］，该基因可能通过对糖代谢的影响从而对脂代谢产生影响。目前对于细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和趋化因子信号通路在脂代谢中的作用的研究少，需要进一步研究其在脂肪组织中的作用。

综上所述，在冷季舍饲喂养有效减缓了牦牛皮下脂肪的分解，减少了能量的消耗，有利于脂肪的沉积。

4 结论

本试验共获得牦牛自由放牧和补饲两个条件下9个皮下脂肪的cDNA文库，筛选出1 673个差异表达基因，其中上调表达基因936个，下调表达基因701个，差异表达基因主要富集到AMPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体作用以及趋化因子信号通路等通路，为牦牛皮下脂肪代谢的深入研究提供了参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060750)

青海省科技项目(2019-SF-A3)