促卵泡激素受体在双峰驼附睾的定位及分布特点

Location and distribution of follicle-stimulating hormone receptor in the epididymis of bactrian camel

摘要

目的 研究促卵泡激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）对双峰驼附睾发育及生殖机能调节的影响。 方法 应用H.E染色、糖原PAS和免疫组织化学SP法结合Image J统计方法，分析促卵泡激素受体在双峰驼附睾的组织学特性。 结果 H.E染色结果显示，双峰驼附睾各部分管腔为柱状纤毛上皮，成年双峰驼附睾管壁上皮细胞主要由主细胞、基细胞等组成。附睾管头部和附睾管尾部PAS阳性反应强于附睾管体部；免疫组化及免疫荧光结果表明，FSHR在双峰驼附睾头体尾均有表达，FSHR在成年双峰驼附睾管中头部和尾部的表达强度显著高于体部；在附睾头以纤毛上皮细胞游离缘及间质血管内皮细胞为主，FSHR在附睾体及附睾尾以基细胞表达为主。 结论 FSHR在双峰驼附睾中与精子的成熟以及基细胞介导细胞的吞噬及保护机制有关。

Abstract

Objective The aim of the study was to investigate the effects of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) on the regulation of epididymal development and reproductive function in bactrian camel. Method The histological characteristics of FSH receptor in the epididymis of bactrian camel were analyzed by using the H.E staining, glycogen PAS and immunohistochemical SP methods combined with Image J statistical analysis. Result The H.E staining showed that the lumen of each part of the epididymis of bactrian camel was columnar ciliated epithelium, and the epithelial cells of the epididymal wall of adult bactrian camel were mainly composed of main cells and basal cells.The PAS positive reactions both in the head and tail of the epididymal duct were stronger than those in the body of the epididymal duct. The results of immunohistochemistry and immunofluorescence showed that FSHR was expressed in the head, body and tail of camel epididymis.The expression levels of FSHR in the epididymal duct of adult camel were significantly higher in the head and tail than in the body. The free margin of ciliated epithelial cells and interstitial vascular endothelial cells were dominant in the caput epididymis, and FSHR was mainly expressed in basal cells in the epididymal body and cauda epididymis. Conclusion FSHR are associated with sperm maturation and involved in the mechanism of basecell-mediated cell phagocytosis and protection in the epididymis of bactrian camel.

Graphical abstract

关键词

双峰驼 / 附睾 / 促卵泡激素受体 / 免疫组织化学

Key words

bactrian camel / epididymis / follicle stimulating hormone receptor / immunohistochemistry

Author summay

张芳，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

促卵泡激素受体（follicle-stimulating hormone receptor，FSHR）是颗粒细胞表面的G蛋白偶联受体，Means和Vaitukaitis等^［1］首先证实大鼠睾丸的曲细精管具有FSH的特异结合位点，与细胞膜相关联。FSH能够特异性地与睾丸Sertoli细胞膜上的FSHR结合产生A结合蛋白（ABP），也可结合睾酮将其转运至生精小管内，维持管腔内的睾酮浓度，促进各级生精上皮细胞的生长发育^［2］。雌激素在睾丸和附睾的发育中起着重要作用，是睾丸和附睾发育的主要系统调节因子之一^［3］。附睾是一个高度复杂的管道，位于睾丸输出管和输精管之间，附睾从近端到远端分别为附睾头部、体部和尾部。附睾管上皮的成熟发生在出生后，在雄性生殖细胞发育成熟中承担着重要的角色。王俊杰等^［4］检测到FSHR在野生达乌尔黄鼠附睾中的表达，表明FSHR对附睾发挥着重要作用。有研究发现小鼠FSHR基因的缺失导致附睾重量显著降低，FSHR敲除后附睾头部管腔直径小于对照组，且头部管腔内几乎不存在精子，而附睾管中精子出现脂滴滞留的情况，运动能力低下，致生育能力降低^［5］。研究发现对大鼠使用具有高度特异性的抗FSH血清，造成了附睾组织形态的改变。与对照组相比，实验组随着抗血清浓度升高附睾重量减少了50%至60%，附睾管腔直径减少^［6］。有研究发现^［6］，大鼠和猴附睾也是FSH的靶器官，而且检测到附睾中有FSHR的表达，Northern杂交发现FSHR主要表达在性成熟的大鼠和猴的附睾头、尾部附睾管的上皮细胞中，由此说明FSHR与附睾管腔的发育有密切关系。FSHR敲除的小鼠附睾头部和体部的上皮区域明显小于野生型小鼠，且小鼠附睾尾部精子数比野生型小鼠少，静态精子百分比与对照组相比升高了20%，且精子头和尾的结构发生了改变^［7］。附睾精子成熟是一个复杂的生理过程，附睾精子成熟主要受到来自附睾微环境的影响。而附睾中存在FSHR 的表达，提示FSHR可能与附睾内精子受精能力的获得和发育有关，抑或与参与附睾基因表达的调控等有关。

双峰驼为我国遗传资源保护品种，主要分布在内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、青海省和甘肃省等地区的干旱荒漠和草原地带，能在生态环境恶劣的地区生存繁衍。目前有关双峰驼的研究多在DNA遗传多样性、促性腺激素对其生殖细胞影响机理和超数排卵在繁殖方面^［9］。国际动物保护同盟（IUCN）于2002年将野生双峰驼从濒危物种提升为极濒危物种。双峰驼附睾不同阶段在形态、上皮细胞组成、细胞内的分泌颗粒与吞噬物方面存在差异，表明附睾的不同阶段参与行使不同的生理功能，其中附睾头主要参与重吸收睾丸分泌物，附睾体主要行使分泌功能，附睾尾主要行使分泌和吞噬凋亡细胞的功能。双峰驼附睾和输精管上皮表面有微绒毛，上皮细胞之间存在紧密连接形成的血-附睾和血-输精管屏障^［10］。目前对于FSHR在双峰驼附睾中的表达定位尚不明确，本研究通过组织化学染色和免疫组织化学SP法及免疫荧光染色法，对FSHR在双峰驼附睾中的定位及其分布进行研究，分析FSHR的分布变化和双峰驼附睾管功能的生理意义，并进一步认识成熟双峰驼的附睾发育微环境，以期为双峰驼生殖生理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

宁夏吴忠双峰驼养殖户场地采集双峰驼附睾样本，制作附睾实质组织切片，切片大小为10.00 mm×10.00 mm×6.00 mm，采用Bouin氏液及10%Formalin固定。

1.1.2 主要药品试剂及仪器

苏木精、醇溶伊红染液，过碘酸Schiff，FSHR抗体、免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均由Affinity BioReagents公司提供，荧光素Alexa Fluor 488标记链霉亲和素DAPI染色液（D-9106）；抗荧光淬灭封片液（C02-04003）。

Epon812包埋机，NIKON ECLIPSE 80i显微摄像系统，LKB8800型超薄切片机，激光扫描共聚焦显微镜（LSM800 ）。

1.2 试验方法

1.2.1 组织学样本制备和观察

将组织样品切成1 cm×1 cm×0.6 cm大小，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定，自动脱水机脱水，Epon 812包埋机进行包埋，LKB 8800型超薄切片机切片（片厚4 μm）。H.E染色：石蜡切片脱蜡，苏木精染色返蓝后，梯度酒精脱水，醇溶伊红染色10 s，二甲苯放置20 min，中性树胶封片。PAS染色：切片脱蜡，高碘酸氧化10 min，随后加schiff液，37 ℃温箱25 min，流水冲洗10 min，苏木精染色25 s，蒸馏水抽提3次，分色液分色1 s，梯度酒精脱水，封片。PAS显示糖原，红色为阳性分布。

1.2.2 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学SP法进行染色，石蜡切片常规脱蜡；高压法对抗原进行修复，冷却至室温；加入3% H₂O₂去离子水50 μL，37 ℃孵育15 min；然后加正常羊血清白蛋白，每片100 μL，孵育15 min后，倾去；再加50 μL兔抗鼠FSHR抗体（稀释度1∶300），放在冰箱4 ℃过夜，然后用PBS清洗3次；随后，加50 μL试剂B，PBS再洗；再加50 μL试剂C，37 ℃孵育15 min。每片滴加新配制的DAB显色液80 μL显色，蒸馏水阻断，苏木素（Mayer）复染3 min后自来水返蓝10 min，镜检，常规脱水透明、封片。阴性对照以PBS替代一抗进行染色。

1.2.3 免疫荧光染色

石蜡切片常规脱蜡至水，操作步骤均与免疫组织化学相同，用荧光素Alexa Fluor 488标记链霉亲和素（稀释度1∶400）替代试剂B孵育6 h；之后用PBS振洗3次，加入DAPI染色液孵育20 min，再用PBS振洗3次。最后，用抗荧光淬灭封片剂封片，使用激光扫描共聚焦显微镜观察并拍照。

1.3 数据统计

用NIKON ECLPISE 80i显微摄像系统进行拍照。每张切片随机选取6个不重复视野（1 000×），用Image J软件统计免疫组织化学染色结果中每个视野下阳性信号表达平均光密度，进行数据分析，结果以\overline{x}±s表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 双峰驼附睾组织化学染色分析

光镜下，H.E的染色显示，成年双峰驼附睾管壁上皮细胞主要由主细胞、基细胞以及管周肌样细胞组成；附睾管头部以睾丸输出管为主，管腔面内有大量的精子，有伸向管腔内的纤毛（图1-A、1-B、1-C），主细胞呈高柱状（图1-A），且基细胞分布于各个附睾管固有层底部（图1-A），呈长梭形的管周肌样细胞围绕在固有膜外周（图1-A）。附睾体以附睾管为主，附睾体间质内有小血管，腔面内有大量的精子，管腔上皮主要由基细胞和主细胞构成，以主细胞为主，细胞核呈蓝紫色，胞浆呈红色（图1-B）。附睾尾部向后延伸链接输精管，附睾尾部的管腔变小，管腔面内精子的数量较少，上皮细胞主要由基细胞、管周肌样细胞和主细胞组成，主细胞的形状没有附睾头体部清晰（图1-C）。

PAS染色结果显示，附睾管基细胞的阳性着色较深（图1-D、1-E、1-F），表达较强，腔面精子也有阳性表达，附睾管头部和尾部的表达较体部强，基底管周肌样细胞和毛细血管内皮细胞均有紫红色阳性表达，间质血管壁有中性糖原呈阳性表达。

2.2 免疫组织化学染色分析

FSHR免疫反应阳性产物呈黄褐色，定位于血管壁与附睾基底膜上的基细胞，细胞核经苏木素复染呈淡蓝色。附睾头部和体部管腔内见明显的精子分布，1 000倍显微镜下附睾管头部基底膜上的基细胞及管周肌样细胞呈强明显阳性表达（图2-A），FSHR在附睾体部阳性表达定位于纤毛柱状细胞和管周肌样细胞（图2-B），附睾管尾部间质的血管内皮细胞呈强阳性表达（图2-C）。附睾管头、体、尾3部分基细胞、纤毛柱状细胞和管周肌样细胞皆有明显的阳性表达。

免疫组织化学光密度统计分析结果表明（图3），FSHR在成年双峰驼附睾管中头部和尾部的表达强度显著高于体部（P<0.05）。

2.3 免疫荧光染色分析

FSHR荧光染色结果显示，FSHR的阳性表达主要定位在附睾管腔内的精子、血管壁、基细胞和管周肌细胞中。附睾管头部中腔面内的精子、基细胞、附睾间质中的小血管都呈强阳性表达（图4-A、4-B、4-C）；附睾管体部管腔内的大量精子、基细胞和管周肌样细胞呈强阳性表达（图4-E、4-F、4-G），但附睾体基细胞的表达较附睾头部弱；附睾管尾部管周肌样细胞和附睾间质中的小血管呈强阳性表达，基细胞几乎无表达（图4-I、4-J、4-K）。

3 讨论

哺乳动物附睾位于睾丸的后外侧，是储存、转运和精子成熟的器官，主要由睾丸输出管、附睾管、输精管组成，具有分泌和吸收等功能^［11］。Tingari^［12］研究发现骆驼附睾可分为5部分，上皮主要由主细胞、基细胞、顶细胞、晕细胞和暗细胞组成。李琳等^［13］研究发现达乌尔黄鼠附睾主细胞呈长方形，富含细胞器，是附睾上皮组织的主要细胞类型，占附睾上皮细胞的65%~80%。基底细胞呈扁平伸展，半球形，位于附睾上皮的基底膜，介导细胞的吞噬作用。主细胞是维持附睾生理功能的物质基础，在附睾头体尾3部分的形态结构差别很大，与本试验结果一致，H.E染色可见附睾头部的主细胞呈长柱形，核卵圆形位细胞基部，排列整齐；体部主细胞呈矮柱状，细胞核更大，形态多样，排列无头部整齐；尾部的主细胞的结构呈立方形或矮柱状，表面有短小而整齐的静纤毛，核变小，卵圆形，附睾管头体部分主要分泌营养物质，促进精子的成熟，附睾管尾部以储存精子为主，主细胞形状的不同这与附睾管头体尾的生理功能有关。基细胞介于主细胞和基底部之间，基细胞的胞膜有微吞饮内褶，表明基细胞可以从这两方间隙中摄取物质。

研究结果显示，在附睾的PAS染色中，上皮固有层、间质毛细血管壁、基底细胞、管周粘膜细胞和精子的管腔表面均呈现紫红色的糖原阳性带，其中附睾头和附睾尾PAS阳性反应强于附睾体，附睾上皮PAS的反应强弱与附睾上皮分泌功能的变化密切相关^［14］。本研究也采用PAS染色，发现成年双峰驼各附睾管的基底膜、管周肌样细胞、间质毛细血管壁和精子呈阳性反应，且附睾管头部和附睾管尾部PAS阳性反应强于附睾管体部，表明附睾头和附睾尾管腔中性粘多糖含量较附睾体多。本试验中成年双峰驼附睾管的基底膜和管周肌细胞上存在PAS阳性带，表明中性粘多糖的合成与基底膜和管周肌细胞有关。根据Wassarman等^［15］的研究结果，精子和卵子的特异性识别是通过精子表面的糖蛋白和透明带糖蛋白相互作用实现的。此外，精子表面的中性和酸性粘多糖还参与了细胞间的识别和信息交流。对于小尾寒羊的研究发现，各附睾管腔面精子呈深紫红色，表明精子表面的中性粘多糖已经出现，为进一步促进精子和卵子的特异性识别奠定了物质基础^{［14，16］}；在双峰驼的研究中，我们的发现也与此一致，即附睾管头部、体部和尾部腔面精子呈深紫红色，表明精子表面已经具备中性粘多糖，这为精子和卵子的特异性识别提供了物质基础。

王俊杰^［4］研究表明FSHR的表达位置主要定位在附睾头部、体部和尾部上皮细胞层的细胞质中。附睾管头部作为睾丸输出部，其管腔上皮为假复层柱状纤毛上皮，管腔呈规则的椭圆形且有游离的精子分布，有伸向管腔内的纤毛。本研究中FSHR在附睾头部的表达主要定位于睾丸输出管管腔上皮细胞，其基细胞和管周肌样细胞呈强阳性表达，纤毛柱状细胞亦有阳性表达，应与其介导的分泌吸收作用有关，吸收睾丸液，分泌营养物质。FSH是一种垂体的糖蛋白激素，FSH通过结合FSHR后激活G蛋白偶联机制而对睾丸的功能进行调节^［20］。本研究中附睾管头部的间质细胞和血管壁也呈强阳性表达，可能与FSH由脑垂体产生通过血液运输到双峰驼附睾中有关，与雄激素发挥协同作用促使精子发育成熟，维持附睾管中精子的正常数量。

研究表明，附睾体作为未成熟精子到成熟精子的过渡部位，在精子获得运动能力过程中起关键作用^［21］。研究中FSHR在双峰驼附睾管体部的表达主要定位于附睾管的纤毛柱状细胞和管周肌样细胞，其中附睾管间质的毛细血管的管壁呈强阳性表达。血管壁阳性表达说明FSH由脑垂体产生通过血液运输到双峰驼附睾中，通过主细胞和其表面成束的静纤毛作用于管腔内的精子中，在精子活化成熟方面起关键作用。

附睾管尾部作为输精管前段，以储存精子为主^［22］，其分泌吸收功能主要由主细胞和亮细胞承担完成，其中主细胞是维持附睾生理功能的基础，亮细胞具有吞噬精子碎片、清洁附睾腔内环境的功能^［23］。在本试验中，FSHR在附睾管尾部的表达定位于纤毛柱状细胞、基细胞、管周肌样细胞，且在附睾管间质毛细血管壁呈强阳性表达；在附睾尾部上皮细胞变矮，主细胞的形态差别较头体部大，主细胞由高柱状变成立方形，主细胞游离缘的静纤毛由长而弯渐变成短而直的刷状缘，由于亮细胞的存在，其分泌功能较附睾管体部强。

4 结论

双峰驼附睾上皮为假复层纤毛柱状上皮，由头、体、尾3部分组成，其中附睾管头部和附睾管尾部PAS阳性反应强于附睾管体部，提示附睾头和附睾尾管腔中性粘多糖含量较附睾体多，为精子和卵子的特异性识别提供物质基础。FSHR在双峰驼附睾头体尾均有表达，在附睾头以纤毛上皮细胞游离缘及间质血管内皮细胞为主，提示在附睾头与精子的成熟密切相关；FSHR在附睾体及附睾尾以基细胞表达为主，提示其或与基细胞介导细胞的吞噬及保护机制有关。

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基金资助

甘肃农业大学学科建设项目(GAU-XKTD-2023)

甘肃农业大学大学生创新创业训练计划项目(201903017)