B和Si对紫花苜蓿铝毒的缓解作用

Detoxification of boron and silicon on aluminum toxicity of Medicago sativa

摘要

目的 研究硼（B）和硅（Si）对紫花苜蓿（Medicago sativa L.）铝毒害的解毒作用。 方法 采取温室水培试验，筛选硼和硅最佳缓解浓度，以最佳浓度设置7个处理（CK、Al、B、Si、Al+B、Al+Si、Al+B+Si），测定紫花苜蓿生长指标、根尖柠檬酸代谢和抗氧化指标。 结果 无铝条件下，硼和硅促进紫花苜蓿生长；在铝胁迫下，紫花苜蓿根中铝含量显著增加，根长、根生物量、茎叶簇高、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量显著降低（P<0.05 ），幼苗的生长明显受到铝抑制；添加硼和硅后，根中铝积累显著降低（P<0.05），且硼和硅共同作用显示出更好的效果。此外，硼和硅虽然提高了根尖柠檬酸合酶活性，但根尖柠檬酸含量和分泌量降低，因此B和Si缓解铝毒并不是通过柠檬酸分泌的途径来实现。硼和硅还能增加抗氧化酶活性，减少MDA和H₂O₂的含量，从而缓解铝毒。 结论 B和Si对紫花苜蓿生长有促进作用，对铝毒有缓解作用，且两者协同效果更佳。

Abstract

Objective To study the detoxifying effects of boron (B) and silicon (Si) on aluminum poisoning in alfalfa (Medicago sativa L.). Method The greenhouse hydroponics trial was carried out.Firstly，the optimal concentrations of B and Si were screened，and 7 treatments (CK，Al，B，Si，Al+B，Al+Si，Al+B+Si) were set at the optimal concentrations to determine the growth indicators,root tip citric acid metabolism,and antioxidant indicators of alfalfa. Result The addition of boron and silicon could promote the growth of alfalfa without aluminum stress.Under aluminum treatment，the aluminum content in alfalfa root was significantly increased，while root length，root biomass，stem and leaf cluster height，stem and leaf biomass (clusters) and chlorophyll content were significantly decreased，indicating that the growth of alfalfa seedlings was significantly inhibited by aluminum.After the addition of boron and silicon，the accumulation of aluminum in the root was significantly reduced，and the combined effect of boron and silicon showed a better effect.In addition，although boron and silicon increased the activity of apical citric acid synthase，the content and secretion of citric acid in the apical tip decreased，so that the alleviation of aluminum toxicity by boron and silicon was not achieved by citric acid secretion.Boron and silicon can also increase the activity of antioxidant enzymes and reduce the content of MDA and H₂O₂，thus alleviating aluminum toxicity. Conclusion Boron and silicon can promote alfalfa growth and alleviate the aluminum toxicity，and the synergistic effect of the two is better.

Graphical abstract

关键词

硅 / 铝毒害 / 解毒作用 / 硼 / 紫花苜蓿

Key words

silicon / aluminum toxicity / detoxification / boron / Medicago sativa L.

Author summay

李冰洋，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

近年来，土壤酸化引起的植物铝毒已成为人们关注的热点。在酸性条件下，土壤铝矿物溶解释放出可溶性的Al³⁺，破坏了植物正常的生理、生化过程，降低植物对养分的吸收和代谢机能，抑制植物生长，最终导致减产^［1］。酸性土壤占全世界潜在耕地的40%，在我国主要分布于南方地区。紫花苜蓿是一种蛋白质丰富的优质牧草，近几年随着我国南方畜牧业的发展对紫花苜蓿草的需求不断扩大，但由于南方酸性土壤产生铝毒导致紫花苜蓿产量严重下降而影响了种植推广。因此，探索缓解紫花苜蓿铝毒的方法和机理，对南方地区大规模推广种植紫花苜蓿具有重要意义。

Si是地壳表面和土壤中含量丰富的元素，对许多植物的生长发育均具有促进作用，特别是在植物防御生物和非生物胁迫方面^［2］。近年来，Si被发现能缓解铝对玉米（Zea mays）^［3］和高粱（Sorghum bicolor）^［4］的毒害，促进铝胁迫下旱稻地上部的生长^［5］。在高粱中，Si能通过在粘液和外层细胞组织中形成铝-硅复合物，减少铝与细胞壁的结合，降低铝毒性^［4］。这些结果表明，施用Si是一种提高酸性土壤中植物耐铝性的策略。

B是植物生长所必需的微量元素，B能与细胞壁中的果胶分子结合，屏蔽Al³⁺的结合位点，从而减少Al³⁺进入细胞^［6］。报道称，B预处理能促进生长素转运体PIN2驱动生长素的极性运输，促进质膜H⁺-ATP酶的下游表达，导致根系表面pH升高，这对减少根尖区域的铝积累至关重要^［7］。此外，B能提高水稻（Oryza sativa）根系中抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，从而提高了H₂O₂的清除速率^［8］。这些结果表明，施用B也是一种可行的缓解铝毒的办法。

迄今为止，有关B和Si缓解紫花苜蓿铝毒的研究在国内外都鲜有报道。以往，人们普遍采用添加石灰的方法降低土壤铝毒害，但该方法由于成本较大而且会造成土壤板结，所以不是明智之举，寻求新的方法成为当务之急。本研究通过紫花苜蓿水培盆栽试验，设置7个处理组（CK、Al、B、Si、B+Al、Si+Al、B+Si+Al）来研究B和Si对铝毒下的紫花苜蓿的缓解作用。希望通过B和Si的施用，证明其缓解机理，从而为南方地区大规模种植紫花苜蓿提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿品种为渝苜1号，种子来自西南大学重庆高校草食动物工程研究中心，于2020年秋收获并放于4 ℃冰箱保存。试验所用的Si（纯度九水硅酸钠Na₂SiO₃·9H₂O）、B（硼酸H₃BO₃）、铝（三氯化铝AlCl₃）、钙（氯化钙CaCl₂）等试剂均采购于成都市科龙化工试剂厂，均使用分析级。柠檬酸合酶（CS）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、H₂O₂的测定试剂盒购自上海优选生物科技有限公司。叶绿素和根尖柠檬酸含量测定的试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验设计和方法

1.2.1 育苗与预处理

采用水培育苗，容器为不透明塑料桶 （D 20 cm，h 30 cm），试验桶以完全随机方式放置于室内温室灯光下进行培养，恒温25 ℃，每日植物灯管光照14 h。在泡沫板中均匀开16个孔，孔中塞入适量的医用脱脂棉，将泡沫板置于盛滿水的桶中。在每个孔播6~8粒种子，种子发芽3 d后定苗5株即成一簇苗，然后对其进行幼苗适应酸性环境（pH4.3）预处理1 d。

1.2.2 试验设计与幼苗培养

硼和硅最佳浓度筛选试验　根据文献查知，B缓解柑橘枳砧的铝毒的最佳缓解浓度为10 μmol/L^［9］；B缓解豌豆铝毒的缓解浓度为25~80 μmol/L^［10］，因此，本试验设置了五个浓度梯度进行B最佳缓解浓度的筛选，分别为0、20、40、60、80 μmol/L。同样，查阅文献发现Si缓解大麦金属毒害的浓度为300~900 μmol/L^［11］，Si缓解柱花草铝毒的最佳缓解浓度为1 400 μmol/L^［12］。本试验设置5个浓度梯度进行Si最佳缓解浓度的筛选试验，分别为0，500，1 000，1 500，2 000 μmol/L。所有处理均含500 μmol/L CaCl₂，pH4.3。

试验开始后每天均进行2次（间隔12 h）pH的校正。处理7 d后结束试验，用直尺测量根长，以根长最长的处理浓度作为最佳缓解浓度。

1.2.3 处理组比较试验

试验设7个处理，即CK、Al、B、Si、Al+B、Al+Si和Al+Si+B，每个处理3次重复，每个重复一个试验桶，约80株幼苗。根据本研究室前期研究结果，采用的浓度为铝（Al）20 μmol/L，B、Si的浓度均为浓度筛选实验得到的最佳浓度。试验按上述浓度筛选试验相同的方法进行。

1.3 测定指标和方法

处理7 d后，进行相应生长指标测定，并采样进行生理指标的测定，并进行根尖伊文思蓝、苏木精、番红固绿染色处理和拍照。植物根长（同簇5株平均值）和茎叶簇高宽用直尺测量。根部和茎叶部鲜重用精度为0.01 g，最大量程200 g的电子秤测定。根尖（3~4 cm）每处理采样2 g左右，用液氮冷冻后保存于超低温冰箱备用。根尖Al含量测定采用石墨烯原子吸收光谱法^［13］。根尖柠檬酸含量是通过还原 Cr⁶⁺生成 Cr³⁺再利用 Cr³⁺ 545 nm 特征吸收峰来测定^［14］。柠檬酸合酶活性^［15］、叶绿素含量^［16］、丙二醛含量^［17］、H₂O₂含量^［18］、超氧化物歧化酶活性^［18］、过氧化物酶活性^［19］和过氧化氢酶活性^［18］按照试剂盒的操作方法进行测定。根尖柠檬酸分泌量按照Delhaize的方法进行测定^［20］。

1.4 数据处理

采用Prism统计分析软件分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 硼和硅缓解紫花苜蓿铝毒害的最佳浓度筛选

从图1-A可以看出，硼在20 μmol/L时苜蓿的根长最长，显著大于其他处理（P<0.05），说明硼最佳的缓解浓度为20 μmol/L。从图1-B可以看出，硅在1 500 μmol/L时苜蓿的根长最长，显著大于其他处理（P<0.05），表明硅最佳的缓解浓度为1 500 μmol/L。

2.2 铝胁迫下B和Si对紫花苜蓿生长的影响

2.2.1 对紫花苜蓿根生长的影响

从图2和图3可以看出，在铝处理下，供试苜蓿根长和根生物量分别为对照（CK）的14%和61%，表明铝对紫花苜蓿根生长有明显抑制作用。

在B处理下，根长和根生物量分别是CK的1.12倍和1.01倍，表明B对紫花苜蓿根生长有一些效果；而在Si处理下，根长和根生物量分别是CK的2.25倍和1.35倍，表明Si对紫花苜蓿根生长有显著促进作用，Si的效果明显好于B。

在Al+B处理下，根长和根生物量分别是Al的6.42倍和1.51倍；在Al+Si处理下，根长和根生物量分别是Al的14.01倍和2.21倍；在Al+B+Si处理下，根长和根生物量分别是Al的16.03倍和2.29倍，表明B、Si以及B+Si均能缓解Al对紫花苜蓿根生长的抑制作用，而且Si的效果明显优于B，B+Si的效果又更佳。

2.2.2 对紫花苜蓿茎叶生长的影响

从图4可以看出，在铝处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是CK的66%、65%、85.1%和81%，表明铝对紫花苜蓿茎叶生长也有明显抑制作用。

在B处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是CK的1.12倍、1.13倍、1.08倍和0.91倍，表明B对紫花苜蓿茎叶生长有一定的效果；在Si处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是CK的1.25倍、1.49倍、1.36倍和1.31倍，表明Si对紫花苜蓿茎叶生长有明显促进作用。

在Al+B处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是Al的1.14倍、1.38倍、1.11倍和1.15倍；在Al+Si处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是Al的1.66倍、1.74倍、1.36倍和1.23倍；在Al+B+Si处理下，茎叶簇高、宽、茎叶生物量（簇）和叶绿素含量分别是Al的2.26倍、2.59倍、1.68倍和1.28倍，表明B、Si以及B+Si均能缓解Al对紫花苜蓿茎叶生长的抑制作用，而且Si的效果优于B，B+Si的效果明显又更佳。

2.3 铝胁迫下B和Si对根尖柠檬酸合成与分泌的影响

从图5可以看出，在铝处理下，根尖柠檬酸合酶活性相比于CK显著降低（P<0.05），表明长达7 d的铝处理降低了柠檬酸合酶的活性，从而抑制了紫花苜蓿的新陈代谢过程；根尖柠檬酸含量、根系柠檬酸分泌量相比于CK均显著上升，但均因幅度太小无法抵抗铝胁迫而使根部受害。

在B或Si处理下，根尖柠檬酸合酶活性、根尖柠檬酸含量以及Si处理下的根柠檬酸分泌量均显著高于对照CK（P<0.05），表明B和Si可以增强柠檬酸合酶活性，促进三羧酸循环等代谢而有利于紫花苜蓿的生长。

在Al+B、Al+Si或Al+B+Si处理下，根尖柠檬酸合酶活性相比于铝处理均显著上升，表明B和Si或B+Si均能缓解铝对柠檬酸合酶的抑制作用。而根尖柠檬酸含量、柠檬酸分泌量相比于铝处理均显著降低，表明B和Si或B+Si对铝毒的缓解作用不是通过根分泌柠檬酸的方式。

2.4 铝胁迫下B和Si对紫花苜蓿根尖铝毒害及铝积累的影响

在铝胁迫下，Al³⁺可与细胞壁中果胶等分子结合，且可在细胞膜已被破坏的细胞中积累^［21］。苏木精染色法是一种用于鉴定植物含Al³⁺量及Al³⁺伤害的简单、易行的方法^［22］；伊文思蓝染色法的原理是其能够与蛋白结合形成伊文思蓝蛋白复合物，而使受损细胞染成蓝色^［23］。在铝毒下，相比于对照CK紫花苜蓿的根尖经苏木精和伊文思蓝染色后明显变成紫黑色和深蓝色，说明其受到了铝毒害。

从图6和图7可以看出，在B或Si处理下，根尖铝含量很低而且与CK之间的差异不显著（P>0.05），根尖的伊文思蓝和苏木精染色均很浅，表明根尖没有受到伤害。而在铝处理下，根尖铝含量大幅增加，是CK的4.59倍，根尖的伊文思蓝和苏木精染色均很深，表明根尖受害严重。在Al+B、Al+Si或Al+B+Si处理下，根尖Al含量分别比Al处理下降12.9%、17.3%和24.1%，根尖的伊文思蓝和苏木精染色比Al处理均变浅，表明根尖受害得到缓解。

2.5 铝胁迫下B和Si对根尖抗氧化系统的影响

从图8和图9可以看出，在Al处理下，根尖SOD、POD和CAT的活性分别比CK的降低37.1%、31.6%和31.5%，从而使根尖MDA和H₂O₂含量显著增加（P<0.05），分别比CK增加18%和20%，说明Al长期胁迫会降低紫花苜蓿根尖抗氧化酶活性，而累积MDA和H₂O₂，使植株生长受到抑制。

在B或Si处理下，根尖SOD、POD和CAT的活性均比CK有所增强，其中POD达到显著水平（P<0.05），表明B、Si能提高根尖抗氧化酶活性。

在Al+B、Al+Si和Al+B+Si处理，根尖SOD、POD和CAT的活性均比Al处理的有显著增加（P<0.05），SOD分别增加了27.9%，28.4 %和48.9 %；POD分别增加了20.7%，20.8 %和30.0%；CAT分别增加了15.7%，18.8%和41.2%，而MDA和H₂O₂积累明显减少（P<0.05），表明B、Si或B+Si能使抗氧化酶受Al的抑制得到缓解，从而使植株生长得到恢复，而且B+Si共同作用的效果更显著。

3 讨论

3.1 铝对紫花苜蓿生长的抑制作用

植物的生长生理变化是反映植物是否受到铝毒迫害作用的重要特征。本研究中，铝胁迫的紫花苜蓿的根生物量、根长、茎叶生物量（簇）、茎叶簇高与宽、叶绿素含量均显著低于对照组，其中根生物量、根长、茎叶生物量，茎叶簇高分别是对照（CK）的14%、61%、85.1%、66%，表明紫花苜蓿受到了铝的毒害作用。铝胁迫下，闫世才等^［24］发现高浓度铝处理豌豆，豌豆地上、地下生长量会显著下降；铝胁迫下水稻幼苗叶绿素含量明显下降^［25］。这些结果与本研究一致，这说明铝可抑制紫花苜蓿生长。叶绿素是植物体内进行光合作用所必需的色素，而其的合成是需要氮元素参与的，本研究中铝胁迫下叶绿素的含量显著下降，这是可能是由于铝离子的毒害降低了紫花苜蓿对氮元素的吸收，从而导致叶绿素的合成不足。铝离子被植物吸收后，大部分积累在根部，部分运输到地上，因此，铝毒害最严重的部位便是根系，而根系被破坏后会造成地上部分相应营养物质吸收的减弱，最后导致植物地上部分生长受到抑制。对比试验中铝毒对地上部分和地下部分的抑制作用发现，铝的胁迫对紫花苜蓿地上部分和地下部分均有伤害，但是对地下部的毒害要大于地上部，这是由于铝毒对根尖直接的毒害作用，而对茎叶则只是通过降低营养物质吸收的间接毒害作用。抗氧化系统的变化可以表示植物受到铝毒迫害的程度^［26］。本研究中，水培紫花苜蓿在铝胁迫下使得SOD，CAT和POD活性显著下降，而MDA和H₂O₂的含量显著增加，这说明铝毒对抗氧化系统产生了破坏作用，从而影响了紫花苜蓿的正常生长。

3.2 B和Si对紫花苜蓿生长的促进作用

B是作物正常生长和发育所必需的营养素之一^［27］。本研究中，B处理下紫花苜蓿的根长、茎叶簇宽、根尖柠檬酸含量、根尖柠檬酸合酶活性和过氧化物酶活性均显著高于对照组，说明B对紫花苜蓿的生长有促进作用。研究发现，12.5~50 μmol/L硼酸可以有效促进番茄的生长^［28］；B还可以促进西瓜产量的增加^［29］。这些结果与本研究一致，B对紫花苜蓿生长有促进效果。

Si为一种有益元素，不仅能够抵御外界生物及非生物对植物的伤害，还可以促进植物的生长发育。本研究中，Si处理下紫花苜蓿的根生物量、根长、茎叶生物量（簇）、茎叶簇宽、根尖柠檬酸合酶活性、根尖柠檬酸含量、根系柠檬酸分泌量及抗氧化酶均显著高于对照组，表明Si能改善紫花苜蓿新陈代谢，从而促进生长。已有研究表明，适当浓度的Si处理能提高根系的活力^［30］。Si的处理也可以提高杨树的株高、叶面积、叶绿素含量、超氧化物歧化酶活性以及过氧化物酶活性^［31］。上述表明Si对紫花苜蓿的生长有促进作用。

3.3 B和Si对紫花苜蓿铝毒害的解毒作用

本研究在Al处理下添加B、Si或B+Si，水培紫花苜蓿的根生物量、根长、茎叶生物量（簇）、茎叶簇高宽相比于Al处理均显著上升，已有研究证明，B和Si的处理还可以显著增加铝胁迫下鼠李科枣树的根长和茎长^［32］，这些与本研究结果一致，说明B、Si起到了缓解紫花苜蓿铝毒的作用。本研究中B和Si共同施用对铝毒的缓解作用比单一施用更明显，其使得根长、根生物量分别达到了铝处理（Al）的15倍和2.29倍，且是CK的2.26倍和1.40倍；茎叶簇高、茎叶生物量达到了铝处理的2.25倍和1.68倍，且是CK的1.48倍和1.43倍，表明B和Si的添加处理能使铝抑制的幼苗生长得到完全的恢复，缓解了紫花苜蓿的铝毒，且其对根尖的解毒作用要大于茎叶。叶绿素含量的变化是可以间接反应光合作用的强度，在Al处理下添加B、Si或B+Si后，叶绿素的含量相比于Al处理也显著提高；镉胁迫下玉米幼苗的叶绿素含量随着镉浓度的增加呈现下降趋势，通过施加Si以后，叶绿素的含量得到明显提升，这与本试验结果一致，本试验中，通过B和Si对铝毒的缓解，叶绿素含量基本与对照（CK）相同甚至超过了对照，这说明其的添加缓解了铝的毒害，促进了苜蓿对营养物质氮的吸收和新陈代谢，恢复了植物的光合作用，从而促进了紫花苜蓿的生长。本研究中从叶绿素方面证明了B和Si对紫花苜蓿铝毒的解毒作用，且其共同作用效果优于单独作用。

铝胁迫下会显著增加根尖的铝含量，达到对照（CK）的4.59倍，当施加B和Si后，根尖内部铝含量显著下降，B、Si和B+Si分别下降了80.5%、80.6%和83.0%，这说明了B和Si的添加显著减少了根尖内部铝的含量，通过伊文思蓝与苏木精的染色也验证了根尖结合铝离子减少的结论，这也说明了B和Si使根尖铝积累下降是其具有缓解铝毒作用的关键。

豆科植物根尖分泌柠檬酸被证明是其耐铝的一种机制^［26］。本研究中，铝的毒害降低了柠檬酸合酶的活性，抑制了紫花苜蓿的新陈代谢过程，根尖柠檬酸含量与柠檬酸分泌量上升，表明紫花苜蓿内部通过增加分泌柠檬酸的方式抵抗铝毒；胡俊^［33］等对丹波黑大豆3天时的柠檬酸分泌量进行测定，发现其含量已有4.7 μmol/g左右；携带耐铝基因拟南芥的柠檬酸分泌量可达1.5 μmol/g左右^［34］，而本研究的铝胁迫下柠檬酸分泌量只有0.46 μmol/g，这说明虽然紫花苜蓿通过了分泌柠檬酸来抵抗铝毒害，但其没能分泌出足够的柠檬酸抵抗铝胁迫。在Al+B、Al+Si和Al+B+Si处理下根尖柠檬酸含量和柠檬酸分泌量均下降，这说明了B和Si缓解铝毒并不是通过柠檬酸分泌的途径来实现。

植物受到铝毒迫害后，会造成抗氧化酶活性的下降和活性氧（ROS）的上升，而ROS会对细胞质膜产生强烈的氧化作用，导致膜系统损伤，进而造成代谢功能不可修复的损害和细胞死亡，最终影响紫花苜蓿的生长。为了维持代谢机能，植物自身具有相应的适应和抵抗活性氧氧化损伤的能力，这表现为体内存在着一套精细而又复杂的抗氧化系统，即SOD、POD、CAT等，它对清除体内活性氧起到重要作用。本研究在Al处理下添加B、Si或B+Si，紫花苜蓿根尖SOD、POD和CAT活性相比于Al处理显著增加，MDA和H₂O₂的含量显著下降，这说明B、Si或B+Si缓解了铝的毒害，对紫花苜蓿的生长由积极作用^［35］。已有研究证明，较高浓度的镉处理白菜会导致SOD、CAT和APX活性降低，但MDA和H₂O₂浓度增加，而Si的添加则导致相反的方向变化^［36］。适当浓度的Si还可以缓解镉对水稻的毒害，升高在铝胁迫下的SOD、CAT、POD酶活性和降低MDA、H₂O₂、O^2-的含量^［26］。这些结果与本研究的相一致，都是提高了抗氧化物酶的活性，降低了氧化应激，从而缓解了铝的毒害。

4 结论

1） 铝毒处理下根生物量、根长、茎叶生物量，茎叶簇高都比对照（CK）低，说明铝毒抑制紫花苜蓿的生长，且对地下部分的抑制作用大于地上部分。

2） 一定浓度的B和Si处理可以改善紫花苜蓿新陈代谢，从而促进生长，且Si的效果更好一些。

3） 外源添加20 μmol/L B和1 500 μmol/L Si可缓解铝对紫花苜蓿的毒害。且B和Si共同施用的铝毒的缓解作用优于单一施用，且缓解铝毒的地下效果要好与地上效果，缓解以后均高于CK水平。

4） B和Si缓解紫花苜蓿铝毒通过了降低根尖铝积累、增加叶绿素含量和增强抗氧化物酶活性等方式。

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基金资助

重庆市技术创新与应用发展专项(cstc2021jscx-msxmX0009)