同源三倍体白榆生理特性及代谢组学分析

Physiological characteristics and metabolomics analysis of autotriploid Ulmus pumila

摘要

目的 探究同源三倍体白榆及亲本的生理特征与代谢产物的遗传特性，为选育出适应性强、抗性强榆树新种质提供理论依据。 方法 以同源三倍体白榆及其亲本为材料，采用非靶标液相色谱质谱法，对其生理指标进行测定以及代谢产物分析。 结果 同源三倍体白榆抗氧化酶活性以及光合速率显著高于母本二倍体白榆，低于父本四倍体白榆，与父本差异较小；丙二醛含量显著低于母本二倍体白榆，高于父本四倍体白榆，与父本差异较小。从白榆同源三倍体及亲本样品中共测到1 055个物质信号，共筛选出90个差异代谢物，其中代谢物相对含量较母本下调，较父本相对含量上调为7，8-二氢新蝶呤、剪秋罗糖、L-谷氨酸以及槲皮素等糖类、氨基酸类以及类黄酮类化合物；代谢物相对含量较父本下调，较母本相对含量上调，包括儿茶素、乔松素、橙皮素7-O-葡萄糖苷以及芥子酰苹果酸等萜类、酚类、黄酮类以及苯丙类化合物；芹菜素和木犀草素7-葡萄糖苷代谢物相对含量较亲本下调；泛酸和棉子糖代谢物相对含量较亲本上调。差异代谢物主要富集在类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成代谢途径。 结论 同源三倍体白榆与亲本差异代谢物存在显著差异，其代谢物的数量及含量可能与其抗氧化酶活性、光合速率以及非生物胁迫抗性密切相关。

Abstract

Objective The objective of this study was to investigate the genetic characteristics of physiological traits and metabolites in autotriploid Ulmus pumila and its parental species，laying a theoretical foundation for screening new germplasms of Ulmus pumila with enhanced adaptability and resistance. Method In this study，Autotriploid U.pumila and its parental species were used as the materials for assessing physiological parameters and conducting metabolite analysis using non-targeted liquid chromatography mass spectrometry. Result The results indicated that the antioxidant enzyme activity and photosynthetic rate of autotriploid Ulmus pumila were significantly higher than those of the maternal diploid Ulmus pumila and lower than those of the paternal tetraploid Ulmus pumila，with minor deviations from the parental traits.Additionally，the malondialdehyde content was notably lower than that of the maternal diploid Ulmus pumila and higher than that of the paternal tetraploid U.pumila，with minor differences from the parental characteristics.A total of 1 055 substance signals were detected from Autotriploid Ulmus pumila and its parental samples，leading to the identification of 90 differential metabolites.These metabolites included various compounds such as 7,8-dihydroneopterin，Lychnose，L-glutamic acid，Quercetin，as well as sugars，amino acids，and flavonoids.Some of these compounds were found to be down-regulated in relative content compared to the parental species，while others were up-regulated.Furthermore，metabolites like Catechin，(S)-Pinocembrin，Hesperidin 7-O-glucoside，Sinapoyl malate，along with terpenoids，phenols，flavonoids，and phenylpropanoids，were found to be down-regulated in relative content compared to the parental species.Conversely，Pantothenic acid and Raffinose exhibited up-regulation compared to the parental species.The differential metabolites were predominantly enriched in the Flavonoid biosynthesis and Flavone and flavonol biosynthesis metabolic pathways. Conclusion Autotriploid Ulmus pumila exhibited significant differences in its metabolite profiles compared to its parental species.These differences in quantity and content may be closely associated with its antioxidant enzyme activity，photosynthetic rate，and resistance to abiotic stresses.

Graphical abstract

关键词

白榆 / 同源三倍体 / 代谢组学 / 生理特征

Key words

Ulmus pumila / autotriploid / metabolomics / physiological characterization

Author summay

闫晓丽，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

基因组加倍形成多倍体是植物进化与多样化的主要机制之一^［1］，基因组加倍导致植物染色体倍数的变化，使得多倍体植物遗传多样性变得丰富，遗传变异的可能性增加。与二倍体相比，在形态特征、生理特征以及细胞学上存在显著差异，具体表现在器官的巨大性、速生性、生态适应性强、抗性强以及代谢水平高等特性^［2］。李秀宇等^［3］对刺槐形态研究表明相较于二倍体，四倍体叶片的变化幅度较大且叶片较厚。三倍体枇杷较二倍体树体高大、长势旺盛、花器官明显增大^［4］。非生物胁迫下，四倍体泡桐的抗旱能力显著高于二倍体^［5］。黎月娟等^［6］研究表明四倍体桑的可溶性糖含量高于其亲本二倍体。

非靶标代谢组学可以无偏向性地检测细胞内所有代谢物，更全面反映细胞整体代谢状态。植物代谢产物的合成与积累作为植物抵抗逆境胁迫的有效防御反应机制，其中包含有丰富的次生代谢物，其通过改变生理特性来提高自身的抗性，对植物的生理过程起着重要的作用^［7］。多倍体植物由于倍性增加，其抗性以及对逆境响应会发生变化，与其生理代谢密切相关。就此，了解植物代谢产物种类及含量变化是研究其抗性的关键基础。Singh等^［8］研究表明类黄酮在植物抵抗非生物胁迫中起着关键作用。郑嘉敏等^［9］研究证实酚类化合物是龙眼果皮酶变色的关键因素，其具有抗氧化能力。

白榆（Ulmus pumila L.）属于榆科（Ulmaceae）榆属（Ulmus L.）植物。广泛分布于我国华北、西北、东北等地区，是重要的乡土树种之一，具有耐盐碱、耐旱以及耐瘠薄等特性^［10］，目前白榆的研究热点主要集中于病虫害防治技术、耐盐生理机制研究等方面的研究^［11-12］。关于同源三倍体白榆的研究尚未见报道。本研究同源三倍体白榆为材料，对其及亲本生理特性与代谢组学进行分析，了解同源三倍体白榆代谢产物遗传特性，为选育出适应性强、抗性强榆树新种质提供理论依据。

１ 材料与方法

1.1 试验材料

选取白榆二倍体为母本，白榆同源四倍体为父本，及两者杂交获得的同源三倍体白榆为材料。供试材料均来自河北农业大学林学院苗圃并其倍性均经过流式细胞仪鉴定。

1.2 生理指标测定

选取同源三倍体白榆及亲本成熟健康叶片依照李合生的植物生理试验方法测定同源三倍体白榆及亲本叶片的抗氧化酶活性，其中包括，过氧化氢法测定化氢酶（CAT）活性、氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性、愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量、考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶性蛋白、蒽酮显色法测定可溶性糖^［13-14］。

1.3 光合指标测定

于6月中旬，在同源三倍体白榆以及亲本植株中，分别选择3株长势优良的植株，于晴天的上午10∶00~11∶00点，采用LI-6800便携式光合仪，测定每株植株从顶部往下第5~6片成熟且完全展开的叶片，每株选取3片叶作为重复，测量指标包括净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度以及蒸腾速率等指标^［15］。

1.4 代谢组学

于8月份上旬，采集同源三倍体白榆及亲本相同部位新鲜叶片，立即放入干冰中。送至苏州帕诺米克生物医药科技有限公司进行代谢物的提取以及样品的质量检验，基于超高效液相色谱-质谱的非靶标代谢组学的方法对同源三倍体白榆及亲本样本进行质谱检测以及生物信息学分析。

1.5 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 24.0软件对测定各指标进行整理分析，运用单因素方差分析和Duncan多重比较，代谢组数据及差异代谢物生物信息学分析在帕诺米克云平台进行。

2 结果与分析

2.1 同源三倍体白榆倍性鉴定

以母本二倍体白榆以及父本四倍体白榆为对照，流式细胞仪检测其杂交后代倍性。结果如图1所示，流式细胞仪测得其染色体荧光强度值母本DNA相对含量为200，父本为400，杂交后代为300，因此，杂交后代为同源三倍体植株。

2.2 不同倍性白榆生理指标测定

植物受到逆境胁迫时，其通过调控自身的代谢水平，来维持细胞正常生理功能^［16-17］。对不同物种生理指标进行测定，可以有效的了解植物本身对外界环境的代谢差异以及其抗性响应机制。由表1可知，杂交后代同源三倍体白榆的抗氧化酶、丙二醛等生理指标与亲本存在显著差异。过氧化物酶、过氧化氢酶以及超氧化物歧化酶的含量均较母本增加了26.30%、74.42%、43.31%，父本降低了34.42%、25.23%、39.62%，存在显著差异，可溶性糖与可溶性蛋白含量较母本增加了31.18%、50.29%，存在显著差异，较父本降低了17.24%、19.27%，不存在显著差异，而丙二醛含量较母本降低了24.97%，较父本增加了1.22%，差异不显著。说明同源三倍体白榆代谢能力较母本提高，对环境条件适应性强，抗性强，但相较于父本稍弱。

2.3 不同倍性白榆光合参数测定

光合作用是植物进行物质能量积累以及生理代谢的基本途径，叶片光合特性可有效揭示植物对外界生存环境的适应能力。由表2可知，同源三倍体白榆叶片光合特性与其亲本间存在显著差异，其中净光合速率、蒸腾速率、气孔导度较母本提高了66.88%、17.35%、35.01%，且较父本降低了32.24%、25.41%、25.93%，均较亲本存在显著差异。但胞间二氧化碳浓度却较母本降低了7.66%，较父本提高了37.68%，存在显著差异。说明由于倍性增加，同源三倍体白榆光合速率明显高于母本二倍体白榆，但较父本四倍体白榆稍弱。

2.4 代谢组学分析

2.4.1 正交偏最小二乘法判别分析

正交-偏最小二乘判别分析方法（OPLS-DA）可以在不降低模型预测能力的前提下，有效减少模型的复杂性和增强模型的解释能力，从而最大程度查看组间差异。由图2可知，白榆同源三倍体与亲本三者组内样本间相对聚集，差异较小；组间样本相对分散，差异较大，表明白榆同源三倍体与亲本代谢产物存在明显差异。

2.4.2 不同倍性白榆差异代谢物筛选

基于OPLS-DA模型结果寻找差异代谢物，从白榆同源三倍体及亲本样品中共测到1 055个物质信号，以统计检验中预设的P<0.05以及VIP>1阈值进行筛选，共筛选出90个差异代谢物，由表3可见，存在显著差异的主要代谢物30个。其中，10种代谢物相对含量较母本下调，较父本相对含量上调多为糖类、氨基酸类以及类黄酮类化合物，包括7，8-二氢新蝶呤、槲皮素3-（6'-丙二酰基葡糖苷）、剪秋罗糖、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、槲皮素、胡椒酚等化合物；16种代谢物相对含量较父本下调，较母本相对含量上调，多为黄酮类、萜类、酚类、生物碱以及苯丙类化合物，包括根皮苷、儿茶素、乔松素、橙皮素7-O-葡萄糖苷、N-乙酰噻吩、芥子酰苹果酸、七叶苷、紫苏醇、滨蒿内酯、间苯三酚以及开环异落叶松树脂酚等，而芹菜素和木犀草素7-葡萄糖苷代谢物相对含量较亲本下调；泛酸和棉子糖代谢物相对含量较亲本上调。

2.4.3 不同倍性白榆差异代谢物聚类热图

对筛选出的代谢物进行进一步的聚类分析，将每个代谢物最终归为一类。如图3所示，白榆同源三倍体与亲本差异代谢物聚类热图，图中相对含量的大小通过颜色的不同来显示，颜色越红表达量越高，越蓝表达量越低。由图显示白榆同源三倍体与亲本代谢物水平存在显著差异。可以看出：划分成6个区域，色块颜色区分明显，其中白榆同源三倍体有24种代谢产物相对定量值较父本表达量高，母本表达量低；56种代谢产物相对定量值较母本表达量高，父本表达量低；6种代谢产物相对定量值表达量高于亲本；5种代谢产物相对定量值表达量低于亲本。

2.4.4 不同倍性白榆差异代谢物通路分析

白榆同源三倍体及亲本差异代谢物进行代谢通路分析，通过KEGG数据库检索到差异代谢物参与的代谢通路共114个，筛选出20个差异代谢物参与的主要代谢途径。如图4所示，纵坐标代表代谢通路，横坐标代表富集到不同代谢通路中的贡献值，颜色代表P值。同源三倍体与亲本差异代谢物主要富集在类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、FoxO信号通路、谷氨酸能突触、GABA能突触、碳青霉烯类生物合成、类固醇激素生物合成、d-谷氨酰胺和D谷氨酸代谢、苯丙烷类生物合成等代谢途径，其中类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成代谢途径颜色最红P值最小，表明该通路下槲皮素、芹菜素、根皮苷、儿茶素、木犀草素7-葡萄糖苷以及槲皮素3-（6'-丙二酰基葡糖苷）等代谢产物对该通路具有显著影响；FoxO信号通路以及谷氨酸能突触代谢途径最长，表明该通路下二磷酸腺苷、L-谷氨酸以及L-谷氨酰胺代谢产物对该通路贡献度最高。

2.4.5 白榆与不同倍性差异相关且被富集到的代谢物分析

对被富集到类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成代谢通路中的9种与不同倍性榆树差异相关代谢物进一步分析，由图5可知，该代谢通路下９种代谢产物在白榆同源三倍体以及亲本中均存在显著差异。其中，木犀草素7-葡萄糖苷与芹菜素代谢物相对定量值较亲本下调；槲皮素3-（6'-丙二酰基葡糖苷）、槲皮素 3-O-［β-D-木糖基-（1->2）-β-D-葡萄糖苷］以及槲皮素代谢物相对定量值较母本表达量下调，父本表达量上调；根皮苷、儿茶素、乔松素、以及橙皮素7-O-葡萄糖苷代谢物相对定量值较父本表达量下调，母本表达量上调。

3 讨论

3.1 不同倍性白榆生理差异

多倍体植物由于染色体加倍其倍性发生改变，对抗性以及逆境响应会发生变化，与其生理代谢密切相关。研究表明在胁迫环境中，多倍体比二倍体更能占据生存优势，抵抗逆境胁迫，如低温、盐碱以及干旱等^［18-19］。植物中含有一些抗氧化酶、丙二醛以及可溶性糖等物质，其含量的高低在一定程度上反应植物逆境响应能力^［20-21］。

多倍体植物会使植物体内这些初生代谢产物、内源激素以及次生代谢产物含量增加，就此本研究对同源三倍体白榆及亲本生理指标及代谢产物进行研究，用于评价其抗逆性。研究发现随着倍性增加同源三倍体白榆可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性以及光合速率显著高于母本二倍体白榆，丙二醛含量显著低于母本二倍体白榆，这与同源三倍体桑树^［22］和三倍体枇杷^［23］表现一致，但黄瓜不同倍性多倍体的POD活性随倍性增加而降低^［24］，与本研究结果相反。但唐宁等^［25］研究发现同源四倍体白术的SOD与POD活性显著高于二倍体。三倍体苹果^［26］与四倍体黑菜^［27］叶片可溶性糖、可溶性蛋白含量显著高于二倍体叶片，该结果与本研究一致。

植物的光合速率与植物的代谢产物的合成与积累密切相关，同源三倍体白榆光合速率随倍性增加而增强以及抗氧化酶活性提高及丙二醛含量降低，表明同源三倍体白榆抗氧化能力及生理代谢水平较二倍体白榆母本显著增强，抗逆性更强。

3.2 不同倍性白榆差异代谢物

非靶标代谢组学可以有效的揭示不同物种间代谢产物的积累模式，发现植物间存在的差异代谢物以及与逆境胁迫有关的标志代谢物，就此来判断植物抗逆性的强弱^［28］。初生代谢产物如糖类、氨基酸类以及脂肪类等产物，主要维持植物的正常的生长发育活动，是次生代谢的基础，而次生代谢产物是植物在环境胁迫下产生的，是对逆境的一种适应性，其参与着植物的生长、发育以及逆境胁迫下植物的生理防御响应^［29-30］。

类黄酮及黄酮类化合物是植物重要的次生代谢产物，其可调节生长素运输、植物对营养元素的吸收以及光合色素合成等，同时也参与植物对逆境胁迫的响应，当植物受到逆境胁迫后会积累大量的黄酮类物质来提高自身的抵御能力，其在植物生长发育过程中起着重要的作用^［31-32］。黄酮类具有较强抗氧化作用，对膜质过氧化产物丙二醛的生成具体显著抑制作用，木犀草素、橙皮素以及槲皮素类黄酮类代谢物都具有较强的都有较强的抑菌以及抗氧化特性^［33-34］。同时有研究表明山奈酚、儿茶素以及矢车菊素等化合物，也可增强植物的抗氧化能力以及提高干旱胁迫抗性响应^［35］。本研究通过对白榆同源三倍体、二倍体白榆以及四倍体白榆差异代谢物对比发现，差异代谢物多数为黄酮类以及酚类物质，其中，木犀草素7-葡萄糖苷、槲皮素、儿茶素以及橙皮素7-O-葡萄糖苷等代谢产物主要富集在类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成代谢途径，且该通路富集程度最高。就此，说明黄酮类次生代谢物质通过调节类黄酮生物合成以及黄酮和黄酮醇生物合成代谢可能是造成同源三倍体白榆、二倍体白榆以及四倍体白榆生理特性差异的原因之一。此外，糖类、萜类以及苯丙素类等代谢产物相对含量在同源三倍体白榆、二倍体白榆以及四倍体白榆中也存在显著差异。

综上所述，木犀草素7-葡萄糖苷、橙皮素7-O-葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素、根皮苷以及儿茶素等黄酮类化合物是造成同源三倍体白榆与亲本二倍体白榆及四倍体白榆生理特性差异的主要调节物质。

4 结论

本研究以同源三倍体白榆及亲本生理特征与代谢组学相结合对差异代谢物进行分析，发现染色体加倍后，同源三倍体白榆生理特性以及代谢产物发生变化，表现出随倍性增加，抗氧化酶活性提高，净光合速率增加，代谢水平提高，抗逆性能力增强等特性，以上结果可为选育出适应性强、抗性强榆树新种质提供理论依据。

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基金资助

榆树属品种选育项目(1513007)