植物乳杆菌TY-Y10的特性研究

Study on the characteristics of Lactobacillus plantarum TY-Y10

摘要

目的 评价植物乳杆菌TY-Y10（TY-Y10）的生长曲线、产酸能力、耐酸耐胆盐性能，研究其活菌及热灭活状态下的抗氧化能力。 方法 试验采用分光光度法测定菌株生长曲线，pH值变化曲线评估其产酸能力，平板计数法测定该菌株在酸性及高胆盐环境的活菌数及存活率。DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和还原能力评价TY-Y10在活菌和不同温度下灭活菌的体外抗氧化能力。 结果 TY-Y10在MRS培养基中生长4 h后进入对数期，14 h后达到稳定期；pH在12 h后降至4.0以下；菌株在pH=2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的环境下培养3 h，其存活率分别为69.62%、76.44%、102.68%、236.00%、570.80%。在胆盐浓度为0.1%、0.2%和0.3%的MRS培养基中培养8 h后，其存活率分别为109.94%、101.95%、100.23%。TY-Y10活菌菌体、80 ℃热灭活菌体、100 ℃热灭活菌体的DPPH清除率为38.38%、41.37%、32.41%，羟自由基清除率为80.55%、90.53%、76.80%，还原能力为169、231、93 μmol/L 的L-半胱氨酸盐酸盐当量；TY-Y10活菌上清液、80 ℃热灭活上清液、100 ℃热灭活上清液的DPPH清除率为29.97%、15.85%、14.22%，羟自由基清除率为32.64%、48.00%、67.83%，还原能力为72、128、66 μmol/L 的L-半胱氨酸盐酸盐当量。 结论 TY-Y10繁殖能力强，具有较强的产酸、耐酸、耐胆盐能力，活菌和热灭活TY-Y10具有显著的体外抗氧化活性，且80 ℃热灭活菌体抗氧化能力最强。

Abstract

Objective The objective of the study was to assess the growth curve，acid production capacity，acid tolerance，and bile salt tolerance of Lactobacillus plantarum TY-Y10 (TY-Y10) and to investigate its viability and antioxidant properties under heat inactivation. Method The growth curve of the strain was determined using spectrophotometry，acid production capacity was evaluated through pH change curves，and the survival rate of viable bacteria in acidic and high-bile salt environments was determined through plate counting.The antioxidant capacity of TY-Y10 was assessed using DPPH and hydroxyl free radical scavenging rates as well as reducing ability under live and heat-inactivated conditions at various temperatures. Result Our results showed that TY-Y10 entered the logarithmic phase after 4 hours of growth in MRS medium and reached a stable phase after 14 hours.The pH dropped below 4.0 after 12 hours.The survival rates of the strain were 69.62%，76.44%，102.68%，236.00% and 570.80% when cultured in environments with pH values of 2.5，3.0，3.5，4.0 and 4.5 for 3 hours.In the presence of bile salt concentrations of 0.1%，0.2%，and 0.3% in MRS medium，the survival rates were 109.94%，101.95%，and 100.23% after 8 hours，respectively.The DPPH clearance rates for TY-Y10 live bacteria，80 °C heat-inactivated bacteria，and 100 ℃ heat-inactivated bacteria were 38.38%，41.37% and 32.41%，respectively.The hydroxyl free radical clearance rates were 80.55%，90.53% and 76.80%，and the reducing ability was 169，231 and 93 μmol/L of L-cysteine hydrochloride equivalent.Moreover，the DPPH clearance rates for TY-Y10 live bacteria supernatant，80 ℃ heat-inactivated supernatant，and 100 ℃ heat-inactivated supernatant were 29.97%，15.85% and 14.22%，respectively.The hydroxyl radical clearance rates were 32.64%，48.00%，and 67.83%，and the reducing ability was 72，128 and 66 μmol/L of L-cysteine hydrochloride equivalent. Conclusion In conclusion，TY-Y10 demonstrated robust reproductive ability，strong acid production，acid resistance，and bile salt resistance.Both live and heat-inactivated TY-Y10 exhibited significant in vitro antioxidant activity，with the 80°C heat-inactivated bacteria showing the highest antioxidant activity.

Graphical abstract

关键词

植物乳杆菌 / 抗氧化 / 生长能力 / 热灭活

Key words

Lactobacillus plantarum / antioxidation / growth ability / heated-killed

Author summay

石韶琦，硕士研究生。E-mail：[e-mail]

细胞代谢过程中产生超氧阴离子和羟基自由基等活性氧，它们在细胞信号传递、细胞凋亡、基因表达中发挥着重要作用^［1］。当活性氧分子产生过多时，蛋白质、脂肪和核酸生物分子会受到氧化应激的破坏。这种损伤会导致多种疾病，如癌症、阿尔茨海默病和帕金森氏病^［2-4］。大多数生物体都拥有酶和非酶的抗氧化防御和修复系统，以保护机体免受氧化损伤。但这些系统不足以完全防止损伤，因此人们提出并使用了各种合成抗氧化剂，如丁基羟基苯甲醚和丁基羟基甲苯。然而，研究发现合成抗氧化剂可造成肝脏损伤并有致癌作用^［5-6］。因此，需寻找天然的抗氧化剂，以保护人体免受自由基的伤害，延缓慢性疾病的发生。从生物资源中开发更安全、天然的抗氧化剂来替代合成抗氧化剂受到了极大的关注。益生菌是一类通过定殖在人体内，改变宿主肠道菌群组成，进而发挥有益作用的活性微生物^［7］。益生菌可为宿主提供多种健康益处，如免疫系统调节、抗菌活性、降低血清胆固醇活性、抗氧化活性等^［8-10］。因此，研究益生菌抗氧化活性对预防和治疗氧化应激导致的相关疾病具有重要意义。

目前研究证实，许多乳酸菌及其组分都具有抗氧化的功能。鼠李糖乳杆菌GG由于铁的螯合和清除超氧阴离子的能力，在体外可抑制脂质过氧化^［11］。发酵乳杆菌ME-3具有锰超氧化物歧化酶活性，能够增加血清中谷胱甘肽水平，并调节低密度脂蛋白含量^［12］。短链乳杆菌BJ20发酵的海藻糖液在体外表现出很强的DPPH清除、超氧阴离子自由基清除和黄嘌呤氧化酶抑制能力^［13］。干酪乳杆菌可通过减少血液和肝脏中脂质过氧化，改善脂质代谢来缓解氧化应激^［14］。植物乳杆菌7FM10具有清除DPPH和超氧阴离子自由基的能力^［15］。此外，大量研究发现，非活性的微生物细胞、微生物组分或细胞裂解物也能发挥生物活性为宿主提供生理功能。Lee等^［16］的研究报道了双歧杆菌BGN4的全细胞、无细胞提取物、纯化细胞壁和发酵上清液均具有抗氧化能力，且每个组分表现出不同的免疫反应模式。双歧杆菌和乳酸杆菌的无细胞提取物显示出显著的体外肿瘤抑制活性^［17］。热灭活植物乳杆菌L-137对代谢综合征大鼠心脏和脂肪组织具有抗炎作用^［18］，可以上调小鼠表皮细胞和成纤维细胞的透明质酸的产生^［19］，在发挥免疫活性方面，热灭活的植物乳杆菌L-137优于其活性状态。

但由于菌株差异性，不同菌株在不同灭活温度下抗氧化能力之间存在差异，因此研究具有高抗氧化功能的乳酸菌和后生元是目前食品微生物、医学、食品科学、保健等领域的一项重要研究内容。实验室前期在47株植物乳杆菌中体外筛选得到一株具有优良抗氧化性能的植物乳杆菌TY-Y10，但其益生特性以及热灭活状态是否存在抗氧活性尚不清楚。本研究以植物乳杆菌TY-Y10为对象，旨在评价其作为益生菌的潜在抗氧化功能，研究其生长曲线、产酸速率、耐酸、耐胆盐能力及其体外抗氧化活性，进一步探究其不同灭活温度下的抗氧化活性，为后续试验提供数据支持和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌TY-Y10保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.24756；牛胆盐，上海蓝季科技发展有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，Sigma公司；1，10-菲啰啉，Sigma公司。

XH-C旋涡混合器，江苏金怡仪器科技有限公司；LDZF-50KB-II 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；PHS-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司；Lambda Bio35 紫外－可见分光光度计，美国Perkin Elme公司；SYNERGYH1酶标仪，基因生物技术公司；HWS-26恒温水浴锅，上海一恒科学仪器；VD-1320型洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；低速离心机，赛默飞世尔有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制

MRS培养基 蛋白胨10.0 g、牛肉粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、酵母粉4.0 g、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、柠檬酸三胺2.0 g、硫酸锰0.05 g、吐温-80 1 mL，加入1 000 mL蒸馏水中，调节pH至6.2±0.2，121 ℃高压灭菌15 min备用。

1.2.2 乳酸菌的培养

按照2%（v/v）接种到10 mL MRS 液体培养基中活化。在MRS 固体培养基上划线，37 ℃下培养36~48 h后，选取单菌落接入MRS液体培养基并传代3次。

1.2.3 生长曲线测定

参考Yi等^［20］的方法略作修改。TY-Y10以2% （v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃下培养至18 h，间隔2 h，采用分光光度法测定活菌数，绘制菌株的生长曲线。

1.2.4 产酸性试验

参考田辉等^［21］的方法略作修改。TY-Y10以2% （v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃下培养至18 h，间隔2 h，采用pH计测定其pH值，评估菌株的产酸能力。

1.2.5 耐酸性试验

参考孙杰等^［22］的方法略作修改。TY-Y10以2%（v/v）的接种量分别接种到pH为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养，分别于0、1、2、3 h取样，采用平板计数法测定活菌数，以lgCFU/mL表示。

1.2.6 耐胆盐试验

参考孙杰等^［22］的方法略作修改。TY-Y10以2% （v/v）的接种量接种到含有0.03%、0.1%、0.2%和0.3%胆盐浓度的MRS培养基中，37 ℃恒温培养，分别于0、2、4、6、8 h 取样，采用平板计数法测定活菌数，以不添加胆盐的MRS液体培养基作为对照。

1.2.7 样本制备

TY-Y10以2% （v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃下培养8 h，取发酵液在80 °C、100 °C水浴20 min，即得该条件下乳酸菌灭活发酵液。取灭活乳酸菌发酵液，4 500 r/min离心10 min，收集上清液，经微孔滤膜过滤器过滤得到灭活乳酸菌上清液；收集离心后的菌体，无菌超纯水洗涤两次后重悬、离心，用无菌超纯水调整菌悬液浓度至D₆₀₀=0.85 ± 0.05，即得到灭活乳酸菌菌体样本。取培养8 h的发酵液，4 500 r/min离心10 min，收集上清液，经微孔滤膜过滤器过滤得到活性乳酸菌上清液；收集离心后的菌体，用无菌超纯水洗涤两次后重悬、离心，用无菌超纯水调整菌悬液浓度至D₆₀₀=0.85±0.05，即得到活性乳酸菌菌悬液；所有样本于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.8 体外抗氧化试验

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力

将1 mL样品与1 mL新鲜配制的DPPH无水乙醇溶液充分混匀后，37 ℃条件下避光反应30 min，待反应结束后4 500 r/min离心10 min，取上清液，在517 nm测定吸光度，记为As₅₁₇。将1 mL PBS磷酸盐缓冲液或1 mL MRS液体培养基与1 mL DPPH无水乙醇溶液混合作为对照，与样品置于同样条件下培养。反应结束后4 500 r/min离心10 min，取上清液，在517 nm测定吸光度，记为Ac₅₁₇，按照以下公式计算：

DPPH自由基清除率（%）=（1-As₅₁₇/Ac₅₁₇）×100%

式中：As₅₁₇为样品组吸光值；Ac₅₁₇为对照组吸光值^［23］。

1.2.8.2 羟自由基清除能力

参考Wang等^［24］的方法进行测定。将1 mL 1，10-菲啰啉、1 mL PBS磷酸盐缓冲液、1 mL 样品以及1 mL新鲜配置的FeSO₂溶液混合均匀（“混合体系a”）。向“混合体系a”中加入1 mL 20 mmol/L的H₂O₂，37 ℃条件下水浴90 min后于536 nm 波长测定吸光度，表示为 As₅₃₆。将“混合体系a”中的样品换成同体积的纯水或MRS液体培养基，同样在37 ℃条件下水浴90 min，在536 nm处检测，记为Ab₅₃₆。将“混合体系a”中的20 mmol/L的H₂O₂换成同体积的纯水，同样在37 ℃条件下水浴90 min后于536 nm处检测，表示为Ac₅₃₆，按照以下公式计算：

\mathrm{羟自}\mathrm{由基}\mathrm{清除}\mathrm{率}(\mathrm{\%})=\frac{A{s}_{\mathrm{536}}-A{b}_{\mathrm{536}}}{A{c}_{\mathrm{536}}-A{b}_{\mathrm{536}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：As₅₃₆为样品组吸光值；Ac₅₃₆为对照组吸光值；Ab₅₃₆为空白组吸光值。

1.2.8.3 还原能力

参照Lin等^［25］的方法进行测定。将0.5 mL 样品与0.5 mL 1%的铁氰化钾及0.5 mL PBS磷酸缓冲液混合，用旋涡振荡器振荡使体系均匀。将样品替换为同体积纯水或MRS液体培养基与铁氰化钾及PBS磷酸缓冲液混合作为空白对照。此混合体系在50 ℃条件下水浴反应20 min后用冰水混合物快速冷却后，加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，4 500 r/min离心10 min，取1 mL上清液与1 mL 0.1%的氯化铁溶液混合并静置10 min。随后在700 nm波长下测定吸光度，并使用L-半胱氨酸盐酸盐（无水物）作为表征还原力的标准。为了更直观地反映受试菌株的还原力，配置20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 μmol/L的不同梯度浓度的L-半胱氨酸盐酸盐溶液，以L-半胱氨酸盐酸盐浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制作标准曲线。

1.3 数据处理

以上试验均进行3次重复，使用SPSS 19.0统计软件，单因素方差分析、Duncan多重比较法对不同组DPPH清除率、羟自由基清除率、还原能力数据进行差异性分析，差异显著水平α为0.05。使用Prism GraphPad 8.0进行绘图。结果表示为\overline{x}±s。

2 结果与分析

2.1 TY-Y10的生长曲线

乳酸菌的生长曲线反映了其在一定环境条件下培养时所表现出的群体生长规律，对于科研和生产具有重要的指导意义^［26］。TY-Y10在MRS培养基中的生长曲线呈S型，可以观察到明显的延滞期、对数生长期和稳定期。由图1可知，TY-Y10在4 h进入对数期，10 h达到稳定期，具有较强生长能力。这与Liu等^［27］的研究结果相似，他们对从粪便中分离得到7株乳杆菌以及两株对照菌株植物乳杆菌P8和干酪乳杆菌张氏乳杆菌的生长曲线进行了研究。结果显示9株乳杆菌在MRS液体培养基中的生长曲线基本相似，在0~4 h生长缓慢，14 h后进入稳定生长期。

2.2 TY-Y10的产酸能力

乳酸菌的产酸能力是衡量菌株具备潜在益生功能和工业应用的重要指标。TY-Y10在MRS培养基中的产酸能力如图2所示，菌株发酵液的pH值变化呈下降趋势。在4~10 h之间pH值下降速度最快，此时TY-Y10在对数生长期代谢旺盛，产酸速率最快，12~18 h之间pH值下降速度减缓，此时TY-Y10进入稳定期，繁殖速度减弱，酸类等代谢产物大量累积，在一定程度上又抑制了菌株的生长速率。蒙月月等^［28］研究发现植物乳杆菌KLDS 1.0318能够在较短时间内足量的产酸，使pH迅速降低，由最初的7.22逐渐下降至12 h后的4.16。TY-Y10在12 h后pH降至3.92。

2.3 耐酸性试验

益生菌在酸性环境中的生存能力是其发挥益生功能的最重要的参数之一。胃的pH一般为2.5~4.5^［29］，是一个防止细菌进入肠道的屏障。胃部消化时间一般为1~3 h^［30］。本试验用盐酸对TY-Y10的生长环境进行调节，观察其在pH=2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的环境下的存活情况，结果如图3所示，TY-Y10在pH=2.5条件下活菌数快速降低，在pH=3.0、3.5、4.0和4.5的条件下，菌体产生应激反应消除了酸胁迫带来的不利影响，保持了菌体细胞生长的稳定性。1 h后其存活率分别达到了81.25%、96.00%、96.88%、128.89%、129.65%，2 h后活菌数继续升高，其活菌数lgCFU/mL均在6.0以上。培养至3 h时，其存活率分别为69.62%、76.44%、102.68%、236.00%、570.80%。甘祥武等^［31］研究发现植物乳杆菌LPL04、LPL05、LPL14在pH=3.0条件下培养2 h存活率分别为21.9%、86.4%、131%。Liu等^［27］发现L.acidophilus IMAUFB058、L.brevis IMAUFB036、L.casei IMAUFB059、L.casei IMAUFB013、L.casei Zhang、L.helveticus IMAUFB001、L.plantarum IMAUFB042、L.plantarum IMAUFB063、L.plantarum P8、L.reuteri IMAUFB060、L.fermentum IMAUFB055在pH=3.0条件下培养2 h存活率分别为60%、71.1%、58.1%、73.9%、65.3%、87.4%、100%、100%、97.1%、7.5%、94.4%。以上结果说明了TY-Y10具有较好的耐酸能力。

2.4 耐胆盐试验

在体内，胆盐可以乳化和溶解脂质，从而导致细胞死亡，因此乳酸菌对人体胃肠道中高浓度胆盐的耐受能力是衡量其潜在益生特性的重要指标^［32］。研究表明，小肠中胆盐的质量浓度在0.03%~0.3%范围内波动^［33］。本试验选择0.03%、0.1%、0.2%和0.3%胆盐浓度，检测TY-Y10在胆盐作用0~8 h后活菌数的变化情况，结果如图4所示。在胆盐质量浓度为0.3%时，随作用时间的延长，TY-Y10的活菌数呈增长趋势，培养8 h后，其活菌数较0 h处显著增加 （P<0.05）。在0.1%、0.2%和0.3%胆盐浓度的MRS液体培养基中作用2 h后，活菌数均出现显著下降（P<0.05）。活菌数在短时间内显著下降可能是由于胆盐使细胞膜质迅速溶解、膜内蛋白质解离，瞬间的溶解导致细胞内物质流出，部分细胞迅速死亡。而当作用时间超过2 h时，菌株适应高浓度胆盐的环境，菌体细胞能保持较好的稳定性且出现生长趋势。TY-Y10在0.1%、0.2%和0.3%胆盐浓度的MRS液体培养基中作用4 h后，存活率分别为100.13%、100.20%、83.54%，而在作用8 h后，存活率达到了109.94%、101.95%、100.23%，活菌数大于10⁶CFU/mL。类似的研究甘祥武等^［31］发现植物乳杆菌LPL04、LPL05、LPL14在0.3%胆盐浓度下培养2 h的存活率分别为36.6%、18.1%、14.9%。以上这些结果表明，该菌株在一定程度上可有效消除胆盐胁迫所带来的不利影响，在人体胆盐生理浓度范围内可保持较高的活性，具有较好的胆盐耐受性。

2.5 体外抗氧化试验

2.5.1 TY-Y10的DPPH清除能力

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）是一种稳定的自由基，其无水乙醇溶液为深紫色，在517 nm波长有最大吸收峰，吸光度与浓度呈正相关线性关系，加入对其有清除作用的物质后，其提供的氢离子会与DPPH中的单电子配对，从而导致溶液褪色，吸光度下降，以此来评价菌株抗氧化活性^［34］。结果如图5所示，TY-Y10经80 ℃热灭活菌体DPPH自由基清除能力显著升高，为41.36%，极显著高于对照菌株LGG 31.87%（P<0.01）。类似的研究李瑞盈等^［35］发现鼠李糖乳杆菌B6、鼠李糖乳杆菌KF7、副干酪乳杆菌BD5115、干酪乳杆菌LC2W 4株乳杆菌的活性菌体和灭活菌体对DPPH自由基的清除能力与LGG相比均未见优势。

2.5.2 TY-Y10的羟自由基清除能力

在环境中稳定存在的三线态氧可经电子转移及能量转移两种途径活化成反应性较强的活性氧，羟自由基是活性氧的一种，氧化性极强，能造成机体内生物大分子损伤，降解DNA，损伤细胞膜和多糖化合物。H₂O₂与起到催化剂作用的Fe²⁺构成一种氧化体系，这种体系通常被称为Fenton反应，在Fe²⁺的作用下，H₂O₂能产生两种活泼的氢氧自由基，从而引发自由基链式反应，导致还原物质氧化^［24］。1，10-菲啰啉-Fe²⁺体系被氧化为1，10-菲啰啉-Fe³⁺后，其在536 nm处的最大吸收峰消失，测定536 nm处的吸光度值可以比较菌株之间的清除羟自由基的能力差别。本试验选择TY-Y10制备的各组分的羟自由基清除能力。结果如图6所示，TY-Y10热灭活后羟自由基清除能力升高，其中80 °C热灭活菌体羟自由基清除能力极显著高于对照菌株鼠李糖乳杆菌GG（P<0.01）。叶望娟等^［36］研究发现干酪乳杆菌83、短乳杆菌24E羟自由基清除率显著低于对照菌株LGG，鼠李糖乳杆菌260、植物乳杆菌12E、植物乳杆菌15E羟自由基清除率与对照菌株LGG差异不显著。

2.5.3 还原能力

还原能力主要是指NADH氧化酶、NADH过氧化酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶和还原性谷胱甘肽、维生素C、维生素E等非酶复合物具有螯合金属离子和清除活性氧自由基的能力，这些抗氧化剂通过给出电子来清除自由基，从而使氧化过程变得缓慢，达到抗氧化应激的目的。试验中，试验菌株产生的抗氧化物质能使铁氰化钾中的Fe³⁺被还原成亚铁氰化钾中的Fe²⁺，还原后的亚铁氰化钾进一步与三氯化铁反应生成普鲁士蓝沉淀，普鲁士蓝在700 nm波长处有最大吸收峰，测定反应后的溶液在700 nm波长处的吸光值，可以反映菌株的抗氧化活性大小^［25］，结果如图7所示。TY-Y10活菌菌体总还原能力与对照菌株鼠李糖乳杆菌GG持平，经80 °C热灭活菌体还原能力显著升高。类似的研究显示8株清酒乳杆菌的还原活性在（2.7±1.4）到（77.9±5.2） μmol/LL-半胱氨酸当量之间^［37］。

3 结论

植物乳杆菌TY-Y10生长迅速，具有较强产酸能力和耐酸、耐胆盐能力，具有潜在发酵性能和在人体胃肠道中定殖的潜力。此外，体外抗氧化试验表明，TY-Y10活菌和热灭活菌都具有抗氧化活性，且80 °C灭活菌抗氧化活性最强，可作为潜在益生菌和后生元进行应用。

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基金资助

甘肃省自然科学基金项目(20JR10RA523)