女黄扶正提取液体外抗羊痘病毒活性及对小鼠免疫功能的影响

In vitro anti-GTP virus activity of the Nyuhuang Fuzheng extraction solution and its effect on the immune function of mice

摘要

目的 研究女黄扶正提取液体外对羊痘病毒（ goat pox virus，GTPV）的抑制作用及其机制，以及调节小鼠免疫功能的作用。 方法 测定女黄扶正提取液对羊肾细胞的毒性、确定最佳的用药浓度，分别测定病毒感染12、24、36、48 h后病毒拷贝数和TCID₅₀。通过qPCR分析药物处理组、对照组、空白组的细胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IFN-β表达量。检测给药后免疫抑制小鼠血清中免疫指标及脾T淋巴细胞转化能力。 结果 女黄扶正提取液对羊肾细胞存在一定细胞毒性，在添加量为1 mg/mL时对细胞毒性最小，感染羊痘病毒12、24、36、48 h后，病毒拷贝数低于对照组，在48 h呈现显著性差异（P<0.05）；病毒TCID₅₀低于对照组，在24、48 h呈现显著性差异（P<0.05、P<0.01）。感染病毒后的药物处理组与对照组的细胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IFN-β的表达量无显著性差异。给药后，女黄扶正提取液中剂量组小鼠脾T淋巴细胞转化能力明显升高，与模型组相比，差异极显著（P<0.01）；免疫抑制小鼠血清中IFN-γ、IL-2升高，与模型组相比，差异极显著（P<0.01）。 结论 女黄扶正提取液可以体外抑制羊肾细胞中GTPV的增殖，提高小鼠IFN-γ、IL-2水平，调节机体免疫功能，为提高机体免疫及未来抗病毒药物的研发提供参考。

Abstract

Objective The study aimed to explore the inhibitory effect of Nyuhuang Fuzheng extract on goat pox virus (GTPV) in vitro and the mechanism，and its immunomodulatory effect on mice. Method To determine the toxicity of the extract to sheep kidney cells and the optimal drug concentration，and the virus copy number and TCID50 were determined 12，24，36，48 h after virus infection.The expression levels of inflammatory factors IL-1β，TNF-α and IFN-β were analyzed in the drug treatment，the control and the blank group by qPCR.The serum immune indexes and splenic T lymphocyte transformation ability of immunosuppressed mice were detected after administration. Result Nyuhuang Fuzheng extract had a certain cytotoxicity to sheep kidney cells，and the cytotoxicity was the least when the added amount was 1 mg/mL.At 12，24，36，48 h after infection，the virus copy number was lower than that of the control group，and the difference was significant at 48 h (P<0.05).TCID50 of the virus was also lower than the control group，and the difference showed the significance at 24 h and 48 h (P<0.05，P<0.01).There was no significant difference in the expression of IL-1β，TNF-α and IFN-β after infection between the drug treatment and the control group.Compared with the model group，the transformation ability of spleen T lymphocytes in the middle-dose group was significantly increased (P<0.01).The levels of IFN-γ and IL-2 in the serum of immunosuppressed mice were significantly higher than those in the model group (P<0.01). Conclusion The Nyuhuang Fuzheng extract could inhibit the proliferation of GTPV in sheep kidney cells in vitro，increase the levels of IFN-γ and IL-2 in mice，and regulate the immune function of the organism，which provided a reference for improving immunity and the development of future antiviral drugs.

Graphical abstract

关键词

女黄扶正提取液 / GTPV / 抗病毒活性 / 免疫调节

Key words

Nyuhuang Fuzheng extraction solution / GTPV / antiviral activity / immunomodulation

山羊痘是由GTPV感染引起，具有全身临床症状的一类传染性疾病，如发热、抑郁、腹泻、消瘦和咳嗽，且有较高的传染性和病死率^［1］。患病羊的皮肤出现特征性病变、丘疹和结节，导致采食、哺乳受到影响，造成羔羊的死亡增加及皮毛质量下降，给养殖业带来严重经济损失^［2］。目前，该病尚无特效治疗药物，主要以接种疫苗预防为主，生物安全防控辅助，因此提高羊群自身的抵抗力至关重要。在临床实践中，常常使用中兽药来提高羊群免疫力，主要通过增加免疫细胞数量和活性，促进抗体的产生以提高免疫功能。这些中兽药在保障羊群健康和预防疾病方面发挥着关键作用。首先，这将有助于降低羊痘病毒的发生率和传播速度，有效控制病毒的扩散；其次，提高羊群免疫力还可以减少其他兽药的使用量，降低兽药残留和环境污染的风险。因此，研发预防性治疗的中兽药有利于提升养殖经济效益，意义重大。

女黄扶正提取液是依据中兽医理论和临床辨证原则所组成的纯中药复方，由中药女贞子、黄芪、枸杞子和菟丝子组成，其主要功能为增强机体的免疫功能。女黄提取液中女贞子滋补肝肾，属于补阴要药，现在药理学研究也证实了女贞子具有增强机体免疫的功能，其中活性成分主要有女贞子多糖、熊果酸、齐墩果酸和红景天苷等。欧阳勇等^［3］证实，女贞子提取物可增强小鼠碳廓清作用，增加小鼠血清溶血素量，促进二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应的发生。此外，黄芪也具有抗炎活性、调节免疫力的功效，Kim等^［4］发现，荚膜黄芪提取物不仅能改善1-氯-2，4-二硝基苯诱导的特应性皮炎小鼠的皮损，显著恢复核因子κB的表达，还能抑制Th2细胞因子的表达，显著降低TNF-α水平，显示出抗炎活性。在免疫调节方面，Qin等^［5］研究了黄芪提取物对晚期糖基化终末产物诱导的α-1巨噬细胞炎症反应的影响，它还可以诱导的炎症细胞因子产生，从而下调巨噬细胞介导的炎症。另外，也有报道黄芩黄酮具有较显著的体外抗病毒效果，对新城疫病毒最高病毒抑制率达到158.82%^［6］。课题组前期研究也证实女黄扶正颗粒及其发酵物增强免疫抑制小鼠的免疫功能、调节大鼠体液免疫的作用^［7-9］，但在抗病毒方面的研究还不充分。因此，基于相关的研究报道文献报道以及前期研究结果，本研究以羊肾细胞为模型，用GTPV感染细胞，药物作用后通过测定病毒核酸拷贝数和病毒的增殖能力以评估女黄扶正提取液抗病毒效果；以小鼠为模型，通过检测给药后小鼠血清中免疫指标及脾T淋巴细胞转化能力评估药物对小鼠免疫功能调节作用，以阐明女黄扶正颗粒抗GTPV效果和对小鼠机体免疫力的影响，也为探索其作用机制提供理论依据和基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

女黄扶正提取液由女贞子，黄芪，枸杞子，菟丝子（4∶4∶1∶1）中药组成，按照比例称取适量药材进行煎煮，煎煮3次，每次1 h，合并3次水煎液，浓缩至1 g 生药 /mL，备用。羊痘病毒疫苗弱毒株（GTPV AV41株）由重庆澳龙生物制品有限公司惠赠、羊肾细胞由实验室保存提供。CCK-8试剂盒、MTT细胞增殖检测试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司、RNA小量提取试剂盒、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒、TB Green^®Premix Ex Taq™试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司； High Capacity RNA-to-cDNA™试剂盒、Gibco胎牛血清、DMEM购买自赛默飞世尔科技公司，IFN-γ、IL-2 ELIS_∶A检测试剂盒购于海联生物。

1.2 引物设计与合成

本研究中利用qPCR法在核酸水平检测病毒载量的引物参考文献^［10］设计 ，F：TGTTATTATGT TTGATCCCGTTC，R：GTAAAATCATATAA GGTGCGACAA。根据NCBI Genebank和参考文献，设计山羊炎性因子相关基因引物（表1），上述引物均由北京擎科生物科技有限公司重庆合成部合成。

1.3 羊肾细胞药物毒性的测定

羊肾细胞培养及病毒接种参考本课题组前期方法^［11］，使用含10% FBS的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO₂条件下在培养箱培养，试验测定前细胞以一定比例连续传代。试验前1 d将细胞消化后，均匀接种到96孔细胞板上，放置培养箱培养，待细胞密度达到80%左右，弃去培养基，加入用DMEM稀释好的女黄扶正提取液（1 g/mL、0.1 g/mL、0.01 g/mL、0.001 g/mL，含2%FBS）至细胞孔中，每个浓度3个重复，设置对照组（未加提取物）及空白组（不含细胞和提取物），37 ℃，5% CO₂培养24 h。试验组和对照组每孔加入10 μL的CCK-8试剂，培养2 h，酶标仪在450 nm波长测定吸光度，根据公式计算，细胞存活率 = ［（试验孔-空白孔）/（对照孔-空白孔）］ × 100%，以此判断药物对细胞活性的影响。

1.4 女黄提取液抗病毒活性测定

羊肾细胞连续传代消化后接种至12孔细胞板中，37 ℃、5% CO₂培养箱培养至细胞融合度70%~80%左右，每孔以感染复数为0.1 MOI的GTPV接种细胞，孵育2 h，孵育期间每30 min轻柔晃动细胞板，孵育结束后弃去细胞病毒液，用DMEM培养基洗2次，试验组加入1 mg/mL的女黄提取液，对照组加入细胞维持液。在病毒感染12、24、36、48 h后收集细胞及上清，每个时间点设置3个重复，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min，取上清于-80 ℃保存。

1.4.1 核酸水平测定病毒的增殖能力

利用试剂盒提取12 、24 、36 、48 h所收集样品的DNA，采用qPCR方法检测病毒载量。反应体系如下：上游引物-F 0.5 µL，下游引物-R 0.5 µL，TB Green Premix Ex Taq 10.0 µL，模板2.0 µL，dd H₂O 7.0 µL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环，每个样3个复孔，根据前期研究建立的绝对定量方法进行分析^［12］。

1.4.2 病毒在羊肾细胞TICD₅₀的测定

羊肾细胞连续传代，试验前一天将细胞消化吹散后均匀铺于96孔细胞培养板，37 ℃、5% CO₂培养箱培养至细胞融合度70%~80%左右。-80 ℃保存的病毒液样品按照10倍倍比稀释，稀释液为含2% FBS的DMEM培养基，每个稀释度做8个重复孔。弃去细胞培养基，用PBS洗2遍，将稀释好的病毒液加入96孔细胞板中，于37 ℃、5% CO₂培养箱培养72 h后，倒置显微镜观察并记录细胞病变情况，不同时间点病毒TICD₅₀值。

1.5 女黄提取液对细胞炎性因子表达的影响

羊肾细胞传代后铺12孔细胞板，37 ℃、5% CO₂培养箱培养至细胞融合度70%~80%左右，以1 MOI的GTPV感染细胞，孵育2 h，期间每隔30 min轻柔晃动1次。用PBS洗板2次，加入细胞维持液，实验组含女黄提取液，对照组为正常细胞维持液，同时设置细胞空白对照。24 h后，根据试剂盒说明书方法，提取细胞总RNA，然后反转录为cDNA，以GAPDH作为内参基因，用qPCR方法进行炎性因子IL-1β、TNF-α、IFN-β表达量分析。反应体系如下：TB Green^®Premix Ex Taq（2×）10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL、灭菌水8 μL。反应条件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、（40个循环），得到的CT值按照ΔΔCt进行计算得出相对表达量。

1.6 女黄提取液对小鼠免疫功能调节作用

1.6.1 动物分组

将试验小鼠随机分为空白对照组、免疫抑制模型组、女黄扶正提取液高、中、低剂量组5组，每组6只。模型组和药物组试验小鼠均按照80 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺，空白对照组腹腔注射等剂量的生理盐水，连续5 d，一天一次。于试验第8天女黄扶正提取液高、中、低剂量组分别按照按1.5、1.0、0.5 g/kg剂量灌胃给药，空白对照组和模型组灌胃等剂量的生理盐水，一天一次，连续7 d。试验结束时，各试验组随机采集4只试验小鼠血液，分离血清，并无菌采集脾脏组织，进行各项指标检测^［13］。

1.6.2 刀豆蛋白A诱导的小鼠脾T淋巴细胞转化试验

颈椎脱臼处死，采用MTT法测定小鼠T淋巴细胞增殖能力^［14］。具体方法如下：无菌分离小鼠脾脏，置于RPMI 1640 培养基液内轻轻冲洗，然后在180目的无菌钢筛上轻轻研磨。将获得的细胞悬液转移至 15 mL 无菌Ep管，20 ℃、1 500 r/min离心2 min后弃上清。加入2 mL红细胞裂解液，裂解时间为2 min。加2 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，20 ℃、1 500 r/min离心2 min后弃上清。加入3 mL含 10%胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，重悬细胞通过三层纱布过滤至另一个15 mL Ep管。调整细胞浓度至1.0×10⁶ 个/mL。将制备好的细胞悬液加入96孔板培养，每孔100 μL，每组细胞设置6个重复。加入RPMI 1640配制的刀豆蛋白A 100 μL（终浓度为5 μg/mL），37 ℃、5% CO₂培养箱培养24 h。加入10 μL MTT（终浓度5 mg/mL），在细胞培养箱内继续孵育4 h，每孔加入100 μL Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育，期间振摇数次，直至紫色结晶全部溶解。在570 nm测定吸光度。

1.6.3 小鼠血清IFN-γ、IL-2含量测定

取1.6.1所述分离血清，采用酶联免疫吸附法测定血清 IL-2、IFN-γ含量，测定步骤严格按照相应试剂盒的说明进行，通过标准品的吸光度值绘制标准曲线，按照标准曲线计算血清中相应细胞因子的浓度。

2 结果与分析

2.1 女黄扶正提取液对羊肾细胞的细胞毒性

由表2可知，女黄扶正提取液对细胞具有不同程度的细胞毒性，当添加量为1 g/mL时，对细胞的活性影响最大，其次是浓度稀释10倍，当浓度稀释100倍时与对照组比较，对细胞活性影响减小，稀释1 000倍时，即添加量为1 mg/mL时，对细胞无毒（图1）。因此，在后续试验中以该浓度来探索其在山羊肾细胞上对羊痘病毒的作用。

2.2 女黄扶正提取液对病毒增殖的影响

由图2可知，从病毒增殖情况来看，添加女黄扶正提取液的试验组与未添加的对照组相比，试验组在试验结束时，与试验开始的病毒拷贝比较，增加的病毒拷贝数远小于对照组。试验组GTPV在12、24、36、48 h的拷贝数也均低于对照组，在48 h时呈现显著性差异（P<0.05）。说明添加女黄扶正提取液可以抑制病毒的增殖。

2.3 女黄扶正提取液对病毒活性的影响

由图3可知，随着GTPV在羊肾细胞中培养时间的延长，添加女黄扶正提取液的试验组和未添加的对照组的TCID₅₀均增大，但试验组的TCID₅₀低于对照组，在24h、48 h呈现出显著性差异（P<0.05、P<0.01），说明女黄扶正提取液对GTPV复制具有的抑制作用。

2.4 女黄扶正提取液对感染病毒细胞炎性因子表达的影响

由图4可知，在羊肾细胞感染GTPV后，试验组和对照组IL-1β、TNF-α、IFN-β表达水平出现增加，说明GTPV感染可以增强细胞炎症反应和免疫细胞的活化。但本试验中，添加了女黄提取液的试验组和对照组在三者表达量上未出现显著性差异。

2.5 女黄扶正提取液对小鼠脾T淋巴细胞转化能力的影响

由表3可知，模型组T淋巴细胞转化值显著低于空白组（P<0.01），给药7 d后，与模型组相比女黄扶正提取液中剂量组小鼠脾T淋巴细胞转化能力明显升高（P<0.01），高、中、低剂量组T淋巴细胞转化能力显著低于空白组。

2.6 女黄扶正提取液对小鼠血清因子的影响

由表4可知，模型组小鼠血清IFN-γ含量降低，与空白组相比，差异极显著（P<0.01）；给药7 d后，女黄扶正提取液高、中、低剂量组小鼠血清IFN-γ升高，与模型组相比，差异极显著（P<0.01）。模型组小鼠血清IL-2含量降低，与空白组相比，差异极显著（P<0.01）；给药7 d后，女黄扶正提取液高、中、低剂量组血清含量IL-2升高，其中高、中剂量组与模型组相比，差异极显著（P<0.01）。

3 讨论

羊痘病毒是一种人畜共患的病毒，主要通过直接接触感染的方式传播，临床上主要通过疫苗预防为主。通过中兽药治疗病毒性疾病和提高机体免疫力是降低羊痘病毒危害的一种新思路。女黄扶正提取液是纯中药复方，由中药女贞子、黄芪、枸杞子和菟丝子组成。有大量研究表明女贞子、黄芪、枸杞子等天然成分具有具有抗炎活性、调节免疫力、抗病毒等功效^［15-17］。值得注意的是，在抗病毒方面，中药黄芪能抑制水泡性口炎病毒（VSV）和单纯疱疹Ｉ型病毒（HSV-1）^［18］。此外，黄芪、野菊花、马鞭草和细辛提取液对鸡新城疫病毒有显著的直接灭活作用^［19］。菟丝子的提取物能够在病毒感染过程中抑制病毒增殖，并且在病毒感染细胞早期具有良好的治疗作用^［20］。Pang等^［21］发现从女贞子果实中提取裂环烯醚萜类似物对甲型流感病毒有抑制作用且具有低水平的细胞毒性。Hu等^［22］研究了从紫茎女贞中分离的苯乙醇苷类化合物（LPG）对流感病毒的抗病毒作用及其机制，结果表明，LPG在体内和体外均有明显的抗流感病毒作用，减轻了流感引起的死亡率和临床症状，从而提高小鼠存活率。此外，LPG能够通过调控内源性干扰素γ（IFN-γ）增强非特异性免疫和特异性免疫。本试验证实女黄扶正提取液可以体外抑制GTPV的增殖、提高小鼠体内IFN-γ水平，这与前述研究相一致，进一步支持了女黄扶正提取液在抗病毒方面的潜力。T细胞在调节机体免疫方面起着关键作用，通过识别特定抗原并进行活化、增殖和分化，不同的T细胞亚群产生不同的免疫效应。这对于清除胞内病原体感染和抗肿瘤免疫反应至关重要。中药中的有效成分，如生物碱、苷类和多糖类，对T细胞免疫功能具有重要的调节作用^［23］。本试验结果表明，适当剂量的女黄扶正提取液能增强小鼠T淋巴细胞的增殖和转化，提高机体的细胞免疫水平。

此外，女贞子的提取物具有一定的抗炎、抗菌作用。Huang G J ^［24］研究发现，女贞子的水提液可有效抑制自由基和脂质过氧化物的产生，具有一定的消炎作用。另外，女贞子中所含有的齐墩果酸为广谱抗生素，对临床上常见的致病菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶血性链球菌、伤寒杆菌等，均具有较好的抑菌作用^［25］。上述研究表明，女黄扶正提取液或将在抗炎、抗菌方面有较好的功效，还需进一步的实验验证。

综上所述，女黄扶正提取液具有多种抗病毒活性成分，在体外具有抗GTPV活性及增强机体的免疫功能。说明女黄扶正提取液在抗病毒领域展现了一定的抑制病毒增殖的能力。进一步的研究有望揭示该复方的具体作用机制和潜在的临床应用前景。

4 结论

研究结果表明，女黄扶正提取液可以体外抑制羊肾细胞中GTPV的增殖，提高小鼠IFN-γ、IL-2水平，调节机体免疫功能，为女黄扶正提取液等天然产物用作提高山羊免疫力和病毒性疾病的治疗提供了新的思路。

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基金资助

重庆市自然科学基金（面上项目）(cstc2020jcyj-msxmX0604)

重庆市科研机构激励绩效引导专项(cstc2021jxj180010)