甜瓜果实糖分代谢及相关酶活性分析

Analysis of sugar metabolism and related enzyme activity in melon fruit

摘要

目的 研究不同糖分甜瓜果实糖分代谢与相关酶活性的关系，为甜瓜育种奠定基础。 方法 以高糖甜瓜日本甜宝和低糖甜瓜小翠瓜为试验材料，采用Elsa试剂盒测定甜瓜果实蔗糖、葡萄糖、果糖含量及代谢相关酶活性。 结果 不同发育时期甜瓜果实中葡萄糖和果糖含量变化不大，果糖含量略大于葡萄糖。日本甜宝果实中蔗糖含量整体呈上升趋势，小翠瓜果实在整个生长期基本无蔗糖积累。日本甜宝果实中蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）活性总体呈上升趋势，酸性转化酶（Acid invertase，AI）活性呈下降趋势；小翠瓜果实SPS与AI活性一直处于较低水平，变化幅度不大。日本甜宝果实蔗糖含量与SPS呈极显著正相关，相关系数达0.940，与AI呈负相关，相关系数为-0.31；小翠瓜果实蔗糖含量与SPS、AI均呈正相关且未达到显著水平，同时日本甜宝蔗糖含量与代谢相关酶均具有较高的正相关性，相关系数达到0.922，而小翠瓜果实蔗糖含量与代谢相关酶的相关性不显著，相关系数为0.683。 结论 通过对2个品种甜瓜果实蔗糖含量与相关酶活性相关性分析，果实糖分含量与蔗糖代谢酶净活性相关性分析，结果表明甜瓜果实中蔗糖含量与相关酶活性有着较高的相关性，且SPS在甜瓜蔗糖积累过程中发挥着重要作用，同时甜瓜果实中蔗糖的积累是受SPS、AI、中性转化酶（Neutral invertase，NI）、蔗糖合成酶（SS-S）以及蔗糖分解酶（SS-C）共同作用的结果。

Abstract

Objective To investigate the relationship between sugar metabolism and the activity of related enzymes in melon fruits with varying sugar contents，thereby providing a foundation for melon breeding. Method High-sugar melon cultivar Japanese sweet treasure and low-sugar cultivar small crisp melon were used as experimental materials.The contents of sucrose，glucose，and fructose，along with the activities of related metabolic enzymes，were determined using Elsa reagent kits. Result Throughout the growth stages，the glucose and fructose contents in melon fruits exhibited minimal variation，with fructose levels slightly higher than glucose.In Japanese sweet treasure fruits，sucrose content generally increased，whereas small crisp melon fruits showed negligible sucrose accumulation throughout the growth period.The activity of sucrose-phosphate synthase (SPS) in Japanese sweet treasure fruits exhibited an overall upward trend，while acid invertase (AI) activity declined.In contrast，both SPS and AI activities in small crisp melon fruits remained at low levels with minimal fluctuations.A highly significant positive correlation was observed between sucrose content and SPS activity in Japanese sweet treasure fruits (correlation coefficient of 0.940)，and a negative correlation with AI activity (correlation coefficient of -0.31).In small crisp melon fruits，sucrose content showed positive correlations with both SPS and AI activities，though not reaching significant levels.Additionally，sucrose content in Japanese sweet treasure fruits had a high positive correlation with all related metabolic enzymes (correlation coefficient of 0.922)，whereas in small crisp melon fruits，the correlation coefficient was not significant (0.683). Conclusion Analysis of the correlation between enzyme activities and sucrose content in the fruits of two melon cultivars，along with the changes in enzyme activities and sugar composition at different fruit development stages，indicates a high correlation between related enzyme activities and sucrose content in melon fruits.SPS plays a crucial role in sucrose accumulation during melon fruit development.The accumulation of sucrose in melon fruits results from the combined actions of SPS，AI，neutral invertase(NI)，sucrose synthase(SS-S)，and sucrose-degrading enzymes (SS-C).

Graphical abstract

关键词

甜瓜 / 糖分积累 / 蔗糖代谢相关酶 / 相关性分析

Key words

melon / sugar accumulation / sucrose metabolism-related enzymes / correlation analysis

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科一年生草本蔓生植物，果实香甜酥脆多汁，有较高的营养价值，广受消费者喜爱。目前我国甜瓜栽培近53多万hm²，产量面积位列世界第一^［1］。随着时代的发展，甜瓜育种逐渐从高产量转向高品质。果实含糖量是评价甜瓜品质的核心指标，是品种改良和栽培中最重要的目标性状。

果实糖分的积累是个复杂的过程，由多种酶调控。植物糖分积累前人已经进行了大量的研究^［2-5］。葫芦科作物可溶性糖以葡萄糖、果糖和蔗糖为主，不同作物不同品种间3种糖的含量及比例存在很大差异，高蔗糖积累型甜瓜果实前期以葡萄糖积累为主，且葡萄糖和蔗糖含量均大于低蔗糖积累型甜瓜^［6］。也有研究表明一部分甜瓜有蔗糖积累的转折点，而另一部分甜瓜则没有^［7-9］。Natalie等人对甜瓜果实糖分研究发现甜瓜中蔗糖的积累由蔗糖的合成酶活性（SPS活性+SS合成方向活性）和分解酶活性（AI活性+NI活性+SS分解方向活性）之间的平衡决定的 ^［10］。

不同甜瓜品种糖分含量有差异，而导致差异产生的原因是否与不同时期酶活性存在关系存在争议。本试验以不同糖分甜瓜为试验材料，测定不同时期糖分积累及相关酶活性变化差异，分析薄皮甜瓜品种间糖含量积累差异的酶学机制，探索影响不同蔗糖含量的甜瓜品种果实中糖积累的关键酶，为选育不同糖分积累的薄皮甜瓜品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取2个甜瓜品种日本甜宝（高糖）及小翠瓜（低糖）为试验材料，均由甘肃省农业科学院蔬菜研究所西甜瓜研究室提供，材料特性见表1。

1.2 试验设计

试验材料2020年8月在兰州市皋兰县九合镇甜瓜试验基地培育。温室吊蔓栽培，坐果及田间管理同常规，对授粉甜瓜进行标记，并在授粉0、5、10、15、20、25、30、35 d对果实进行取样。生理指标及酶活性的测定选择3个发育正常果实，采收后切取果实中间部位厚度约2 cm的果肉，将果肉样品混合，用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.3 方法

1.3.1 糖分含量的测定

利用科铭试剂盒测定蔗糖、葡萄糖和果糖含量。

糖分的测定方法及色谱条件：称取2.0 g的样品置于离心管，加入4 mL超纯水后在80 ℃恒温水浴锅中水浴15 min，然后在9 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，将离心好的上清液转移到10 mL容量瓶，使用0.45 μm微孔滤膜过滤后以备上机进样分析。糖检测使用的色谱柱为Thermo （4.6 mm×250 mm），0.5 μm的NH2柱，检测器：RID，流动相为乙腈：水（V∶V=75∶25），流速为1.0 mL/min，等度洗脱，柱温为40 ℃，进样量20 μL。

1.3.2 蔗糖代谢相关酶活性测定

蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS-S）、蔗糖分解酶（SS-C）、中性转化酶（NI）、酸性转化酶（AI）用Elisa试剂盒测定。

1.3.3 蔗糖代谢相关酶活性测定步骤

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板），每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的D值。

1.4 数据处理

用MicrosoftExcel2016进行数据整理和作图，用SPSS 16.0进行Duncan显著性分析（P<0.05）及相关性分析。不同时期甜瓜果实中蔗糖含量变化与相应酶活性变化进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 甜瓜果实糖组分含量差异分析

如图1所示，日本甜宝果实蔗糖含量在授粉后0~20 d缓慢增长，随着果实的发育呈现快速增加的趋势，葡萄糖和果糖含量分别在13.43~16.34 mg/g和12.49~15.35 mg/g范围内变动；而小翠瓜果实蔗糖含量在授粉后一直处于较低水平，葡萄糖和果糖的含量范围为7.05~10.32 mg/g和6.22~9.98 mg/g。果实发育30 d时，日本甜宝和小翠瓜的葡萄糖和果糖含量均较之前有所降低；在整个果实发育过程中，葡萄糖和果糖含量变化差异不大。甜瓜果实总糖含量在整个果实发育期呈上升趋势，日本甜宝总糖增加趋势明显高于小翠瓜。小翠瓜总糖含量显著低于日本甜宝。

2.2 甜瓜果实不同时期糖分合成方向酶活性变化分析

甜瓜果实发育过程中与蔗糖代谢相关合成方向酶SPS、SS-S具有一定的规律性。如图2所示，授粉后5 d后，日本甜宝果实中SPS酶活性迅速上升，到授粉后10~20 d时上升幅度减缓，在25~35 dSPS酶活性又迅速上升后趋于平稳。小翠瓜在不同时期SPS酶活性均处于较低水平起伏，在授粉后0~35 d果实SPS活性一直处于较低水平。与SPS酶活性相比，SS-S酶活性在两个品种甜瓜果实中均处于较低水平，在授粉后30~35 d，日本甜宝果实中SS-S活性略高于小翠瓜。

2.3 甜瓜果实不同时期蔗糖分解方向酶活性变化分析

如图3所示，在甜瓜果实发育期间，日本甜宝果实中AI活性的变化趋势与SPS活性相反。随着果实发育期的推进，在授粉后15 d，日本甜宝果实AI活性处于较高水平，随着授粉后时间的增加呈直线下降，直至授粉后25 d趋于稳定。小翠瓜果实发育期间AI活性变化较小，一直处于较低水平且变化不明显。日本甜宝果实NI活性的变化在授粉后处于起伏状态，且在15 d达到最高点后迅速下降趋于平稳状态。小翠瓜果实NI活性变化与AI活性相似，即在授粉后均在低水平起伏。在果实发育的0~10 d，两个品种甜瓜果实的SS-C活性趋势基本一致，在0~30 d均处于低水平起伏状态。

2.4 果实蔗糖代谢相关酶活性与糖分含量的相关性分析

如表2所示，日本甜宝果实SPS酶活性与蔗糖含量呈极显著正相关，相关系数为0.940，与果糖和葡萄糖均呈正相关且达到显著水平，相关系数分别为0.738和0.796。SS-S、AI、NI活性与蔗糖含量呈负相关，其中NI活性达极显著水平，相关系数为-0.908；SS-C、SS-S、AI和NI活性与果糖含量均呈负相关，其中NI活性相关性达到显著水平，相关系数为-0.79；SS-C、AI和NI与葡萄糖含量呈负相关，且NI活性与葡萄糖含量相关性显著，相关系数为-0.828；果实中SPS活性与总糖含量呈正相关，且达到了极显著水平，相关系数为0.949，SS、AI、NI活性与总糖含量均呈负相关，均未达到显著水平。

如表3所示，小翠瓜果实SPS、SS-S、SS-C、NI活性与蔗糖含量呈正相关，且未达到显著水平，而AI活性与蔗糖含量呈负相关。SPS、SS-S、SS-C活性与果糖、总糖含量均呈负相关且均不显著，NI、AI活性与果糖与总糖含量呈正相关，AI活性达到显著水平，相关系数为0.852；SPS、SS-S活性与葡萄糖含量呈负相关，SS-C、AI和NI与葡萄糖呈正相关，且AI与葡萄糖含量呈极显著正相关，相关系数为0.788。

2.5 甜瓜果实蔗糖代谢相关酶活性与糖分含量的相关系数分析

为进一步探究甜瓜果实发育过程中糖含量变化与蔗糖代谢相关酶活性的关系，对2个品种甜瓜果实中果糖、葡萄糖和蔗糖含量与蔗糖代谢相关酶净活性进行了相关性分析。如表4所示，日本甜宝果实中蔗糖代谢相关酶的净活性与蔗糖和葡萄糖含量均呈极显著正相关，且相关系数分别为0.922和0.852，与果糖含量达到显著正相关，相关系数达到了0.784。而小翠瓜果实中蔗糖代谢相关酶净活性与蔗糖含量呈正相关，相关系数为0.683，与果糖和葡萄糖呈负相关，相关系数分别为-0.678和-0.812。

3 讨论

3.1 甜瓜果实糖分积累差异

蔗糖是成熟果实中的主要糖分，蔗糖含量因品种而异^［11］。低糖品种小翠瓜不同时期糖分含量明显低于日本甜宝。日本甜宝果实蔗糖含量在生长发育过程中呈现快速增长的趋势，小翠瓜果实蔗糖含量在授粉后一直较低的水平，葡萄糖和果糖含量在授粉后变化不大，这与田红梅^［12］研究结果一致。2个品种甜瓜果实总糖在整个发育期均呈现上升的趋势，日本甜宝呈快速增加趋势，小翠瓜呈缓慢增长趋势，与马慧等^［13］人研究结果一致。由此可知日本甜宝和小翠瓜含糖量及其构成比例不同的主要原因就是蔗糖含量的差异。

3.2 甜瓜果实糖分代谢相关酶活性变化规律

甜瓜果实中SPS酶活性在蔗糖积累中起关键作用，它存在于细胞质中丰富度较低可溶性酶，其活性的最适 pH值为7.0左右，催化如下可逆反应：UDPG +6-磷酸果糖⇌6-磷酸蔗糖+ UDP，而SS酶多数为可溶性酶，一般被认为存在于细胞质中，部分不溶性的SS附着在细胞膜上。蔗糖合成酶催化可逆反应：果糖+ UDPG⇌蔗糖+ UDP，且SS酶活性几乎没有积累^［14］。本研究中甜瓜果实蔗糖含量与SPS活性变化趋势相一致，SS-C和SS-S均处于较低水平起伏。类似的结果前人也有报道^［15-16］。马春梅等^［17］人研究发现AI通过水解蔗糖为葡萄糖和果糖，以保持细胞的渗透，并为果实的快速生长提供作为碳源的己糖，在果实发育早期阶段AI活性较高。研究表明，AI活性的降低是蔗糖积累的必要条件^［13］。本试验中，日本甜宝AI活性在授粉前期含量较高，随着果实的发育呈快速下降趋势。而小翠瓜AI活性一直处于较低水平，表明SPS与AI活性变化是影响甜瓜果实蔗糖含量变化的主要原因，这与许让伟^［18］研究结果一致。

3.3 蔗糖代谢相关酶活性与糖分含量的相关性分析

在西瓜果实研究中发现蔗糖含量与AI和NI活性呈负相关关系，SS在果实发育早期，主要表现分解活性，随着果实发育后期逐渐为合成活性，蔗糖含量同相关酶的活性呈较高的正相关关系^{［14，16，19］}。本研究中日本甜宝果实SPS活性与蔗糖和总糖含量均呈极显著正相关，与葡萄糖和果糖呈显著正相关。NI活性与果糖、葡萄糖和总糖含量均呈负相关。小翠瓜果实的SPS活性与蔗糖含量呈正相关，但未达显著水平；SS、AI、NI活性与蔗糖含量呈负相关，这与Datir S等^［20］研究结果一致。说明SPS酶活性越高，AI活性越低，果实中蔗糖的含量越高。对2个甜瓜品种果实蔗糖含量与蔗糖代谢相关酶的净活性分析得出蔗糖合成方向酶（SPS+SS-S）活性-分解方向酶（AI+NI+SS-C）活性均具有较高的正相关性^［21-22］，其中与日本甜宝相关系数呈极显著水平，小翠瓜果实蔗糖含量的相关系数不显著。说明甜瓜果实中蔗糖的积累是受SPS、AI、NI、SS-S和SS-C共同作用的结果。

4 结论

日本甜宝果实SPS活性与蔗糖和总糖含量均呈极显著正相关，与AI酶活性呈负相关，说明甜瓜蔗糖含量的关键酶是SPS和AI酶活性。日本甜宝果实中较高的蔗糖含量与较高的SPS活性与较低的AI活性共同作用的结果；小翠瓜果实中较低的蔗糖含量是较低的SPS酶活性导致的。本研究结果进一步明确了高、低糖甜瓜蔗糖积累与相关酶活性代谢机理，为了更好地选育不同糖分的薄皮甜瓜品种，有必要从糖分的分子调控机制方面进行进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31960523)

甘肃省农业科学院生物育种专项(2022GAAS05)

甘肃省科技计划项目(22CX8NA030)