ALX4基因与滩羊羊毛性状的关联及在皮肤组织的中表达

Association of ALX4 gene with wool traits in Tan sheep and its expression in skin tissue

摘要

目的 滩羊成无根状同源异型盒-4 （ALX4）基因组织表达和多态性及其与羊毛性状的关联性，为滩羊裘皮分子标记辅助选育提供依据。 方法 针对前期研究中筛选出的位点采用SNP分型技术和RT-PCR技术对107只滩羊进行ALX4基因多态性检测，并与初生期和二毛期羊毛性状进行关联分析。 结果 在滩羊ALX4基因上筛选出3个SNPs位点，分别为 g.72453265 T>C 、g.72455864 T>C和g.72476712 T>C，其中g.72453265 T>C位点产生 TT、TC和 CC 3种基因型，g.72455864 T>C位点产生 TT、TC 2种基因型，g.72476712 T>C位点产生 TT、TC 2种基因型；基因多态性分析表明，3个SNPs 位点属于低度多态，SNP1位点均处于非Hardy-Weinberg 平衡状态（P<0.05），SNP2和SNP3位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）；关联分析结果显示：SNP1 Chr15：72453265位点CC基因型出生侧部弯曲数显著大于其他基因型（P<0.05），SNP3 chr15：72476712位点TT基因型二毛侧部毛长显著大于其他基因型（P<0.05）；组织表达分析表明，出生时期滩羊皮肤组织中ALX4基因的表达量极显著高于二毛期滩羊的皮肤组织（P<0.01）。 结论 ALX4基因多态性与滩羊羊毛性状显著相关，可作为滩羊羊毛性状选育的候选基因，其中Chr15：72453265位点和chr15：72476712位点可能是影响滩羊羊毛弯曲和毛长的潜在候选SNP位点，可作为滩羊羊毛性状的遗传分子标记。

Abstract

Objective The study aimed to investigate the tissue expression and polymorphisms of the aristaless-like homeobox-4 (ALX4) gene in Tan sheep，as well as their association with wool traits，to provide a basis for molecular marker-assisted breeding of Tan sheep pelt quality. Method Based on previously screened loci，SNP genotyping and RT-PCR techniques were employed to detect the polymorphism of ALX4 gene in 107 Tan sheep，and the correlation were conducted between ALX4 gene polymorphism and wool traits at birth and second wool stage. Result Three SNPs were identified in the ALX4 gene of Tan sheep，which were g.72453265 T>C，g.72455864 T>C，and g.72476712 T>C.respectively.The g.72453265 T>C locus exhibited three genotypes (TT，TC，CC)，while the other two loci each had two (TT，TC).Polymorphism analysis showed that the three SNPs were low polymorphic，and the SNP1 locus was in non-Hardy-Weinberg equilibrium (P<0.05).The results of association analysis showed that the CC genotype of SNP1 Chr15 : 72453265 locus had a significantly greater number of lateral curvatures than other genotypes (P<0.05)，and the TT genotype of SNP3 chr15:72476712 locus had a significantly greater length of lateral hairs than other genotypes(P<0.05).Tissue expression analysis showed that the expression of ALX4 gene in the skin tissue of Tan sheep at birth was significantly higher than that in the skin tissue of Tan sheep at second wool stage (P<0.01). Conclusion The polymorphism of ALX4 gene is significantly correlated with the wool traits of Tan sheep，which can be used as a candidate gene for the breeding of wool traits in Tan sheep.Chr15:72453265 locus and chr15:72476712 locus may be potential candidate SNP loci affecting wool bending and wool length of Tan sheep，which can be used as genetic molecular markers for wool traits of Tan sheep.

Graphical abstract

关键词

滩羊 / ALX4基因 / 基因多态性 / 生长性状 / 关联分析 / 表达

Key words

Tan sheep / ALX4 gene / genetic polymorphism / growth traits / correlation analysis / express

滩羊是在独特自然条件下培育的优秀地方绵羊品种，属肉裘兼用型绵羊品种 ^［1］。滩羊养殖具有明显地域性，滩羊二毛裘皮性状（弯曲数、毛长、花穗类型等）表达，受多重因素控制，其中区域环境的变化对二毛裘皮性状的表达有较大影响^［2］。近年来，在滩羊裘皮研究方面开展了诸多研究，主要是开展了滩羊皮肤组织蛋白组学及与羊毛性状相关的基因的多态性研究，发现在二毛期滩羊KAP6⁃1基因中 E型条带与羊毛生长速度相关^［3］，在滩羊中分离鉴定到 KAP28-1^［4］和KAP20-1^［5］，利用蛋白组学方法，发现 KAP3、KAP6、VEGF 和膜联蛋白等差异蛋白与二毛期羊毛的花穗形成相关，发现差异蛋白与滩羊皮肤不同生长阶段的毛囊发育周期性变化有关，发现 KAP6、KAP11-1、K25、K83、K34、TCHH 与滩羊羊毛粗细及弯曲度形成有关^［6-12］。Ma等^［13］基于绵羊 600k 高密度芯片技术构建了滩羊基因组 CNV图谱，发现一个 CNVR 与绵羊卷发有关的转录因子 DLX3 重叠，被确定为滩羊特殊的卷毛表型的候选 CNV。滩羊卷曲羊毛磷酸化 K38、K72 和 KAP13-x 的相对丰度较高，而直羊毛磷酸化 KAP2-1、KAP6-1、KAP4-x、KAP10-x 和 KAP13-y 相对丰度较高，Ks 和 KAP 的差异磷酸化可能会影响滩羊羊毛纤维卷曲^［14］。无根状同源异型盒-4（aristaless-like homeobox 4，ALX4）基因属于Hox 基因中成对型同源异型盒 （paired （Prd）-type homeobox，PRD）家族ALX亚家族成员，其编码的蛋白是一种转录调节因子。国内研究发现ALX4基因与毛长和绒细性状显著相关，可作为绒山羊分子标记辅助选育的关键基因，在绒山羊育种工作中可以选择SNP6位点AG基因型个体进行超细绒山羊选育^［15］。雷志惠等^［16］利用Illumina Ovine SNP 50K和群体分化指数Fst对3种羊毛类型的21个品种共290只绵羊群体进行选择信号检测，筛选到ALX4基因与毛囊发育及脱毛性状相关。乔贤^［17］通过对内蒙古绒山羊羊绒细度性状进行全基因组关联分析研究，筛选到ALX4可作为绒毛细度性状的候选基因^］。由此可以推测ALX4可能是一个与羊毛品质相关的基因。基于前期大规模基因组序列分析（10X重测序）与比对，使用已有的绵羊基因组信息，对差异显著的所有变异位点进行注释，发现滩羊羊毛弯曲的ALX4基因3个特异的SNP位点（chr15_72453265、chr15_72455864、chr15_72476712）与滩羊羊毛弯曲显著相关，本研究将ALX4基因作为候选基因，研究其基因多态性检测并与不同生长时期羊毛性状进行关联和表达分析，初步评判该基因可否作为羊毛性状分子选育的关键基因，以期精准定位与滩羊羊毛性状相关的遗传标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

107只滩羊来自于宁夏滩羊选育场苏井站，试验羊健康且出生日期相近，体况相近。

1.2 主要试剂及仪器

Taq Plus DNA聚合酶（B600090），SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（B518131），2X SG Fast qPCR Master Mix （B639271，BBI，Roche 罗氏），UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321），琼脂糖B（A600014），4S Red Plus 核酸染色剂（10，000 X 水溶液，A606695），GeneRuler DNA Ladder Mix（B300721），Maxima Reverse Transcriptase（Thermo Scientific，EP0743），由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

PCR仪（型号为Verity 96well），测序仪（型号为3730XL），LightCycler480 II型荧光定量PCR仪 （Roche，Rotkreuz，Switzerland），购自于宁夏众意泰科技有限公司；凝胶成像仪（型号为FR-980A），上海复日科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 样本采集与表型数据测定

羊只颈静脉采血5 mL，ACD 抗凝，-20 ℃冷冻保存。用血液提取试剂盒提取 DNA，定期测定滩羊初生时期侧部毛长、弯曲数和二毛时期侧部毛长、弯曲数、弯曲比例。选取15只羔羊分别于初生和二毛期采集左侧肩胛骨后缘处皮肤组织，样品大小约1 cm²，液氮保存。

1.2.2 ALX4基因多态性检测

1.2.2.1 滩羊基因组 DNA 的提取和检测

采用 Ezup 柱式血液基因组 DNA 抽提试剂盒（生工生物B518253）提取试剂盒对滩羊血液基因组 DNA 进行提取，利用紫外分光度计检测DNA样本浓度，1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2.2 位点信息及引物合成

根据位点信息，采用Primer Premier 5软件设计合适的引物。引物信息见表1（由上海生工生物工程有限公司合成）。

1.2.2.3 PCR扩增

PCR反应体系 25.0 μL：上游、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，PCR Mix 3.7 μL，DNA （50 ng/μL） 1.0 μL，加ddH₂O 17.3 μL。PCR反应参数：95 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.2.4 测序

利用SanPrep 柱式DNA胶回收试剂盒（生工B518131）将目的PCR条带切胶回收，对扩增的PCR产物进行检测及纯化，PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3 ALX4基因Real-Time PCR检测

1.2.3.1 滩羊皮肤组织RNA提取与检测

利用总RNA提取试剂盒（批号：DP419，天根生化科技（北京）有限公司）进行滩羊皮肤组织RNA提取，操作方法参考试剂盒说明书。提取的总RNA通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行检测。

1.2.3.2 引物设计

根据GenBank公布的绵羊ALX4基因序列和18S rRNA基因序列，采用Primer5.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成引物序列见引物序列：Ov-18S rRNA-F：5'-ACGGCTACCACATCCAAGG-3' R：5'-GCACCAGACTTGCCCTCC-3' ALX4-F：5'-CTCACCCGAGCGGAGAACT3'，R：5'-GGTC ACAGGGCACCACACA-3'。

1.2.3.3 反转录

用反转录试剂盒TIANScript RT KIT（批号：KR107，天根生化科技（北京）有限公司）进行反转录，参照说明书对所提取的RNA进行反转录，合成cDNA第一链，进行10倍稀释，-20 ℃保存。

1.2.3.4 ALX4基因Real-Time PCR反应体系与程序

取2 µL稀释的样品cDNA作模板，分别用ALX4基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60~95 ℃温度条件下进行溶解曲线分析，每个样品cDNA重复检测３次。扩增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。反应体系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 5 µL、上游引物（10 µmol/L）0.2 µL、下游引物（10 µmol/L）0，2 µL、cDNA 1 µL，加入灭菌纯化水至10 µL。

1.3 数据统计与分析

1.3.1 ALX4基因与滩羊羊毛性状的关联分析

Excel 2016 统计并整理滩羊不同生长时期羊毛性状数据，运用遗传分析软件plink软件统计突变位点的基因频率、基因型频率和群体遗传参数，并进行Hardy-We-inberg 平衡检验^［18］，P>0.05为哈代温伯格平衡状态。应用GEMMA^［19］软件中的一般线性模型对不同基因型与各生长时期羊毛性状间的相关性进行最小二乘分析，所采用的分析模型为:

y=Z_{\mathrm{k}}{\gamma }_{\mathrm{k}}+e

式中：y为表型向量，Z_{\mathrm{k}}{\gamma }_{\mathrm{k}}为待检验标记效应，e为残差效应。

使用wald检验来检验标记基因型是否与表型显著关联，以P<0.05 为差异显著性评判标准。

1.3.2 ALX4基因在皮肤组织中表达分析

运用SYBR Green Ⅱ染料实时荧光定量PCR的方法进行验证。试验采用2^-△△Ct法计算出生、二毛时期滩羊的皮肤组织中ALX4基因mRNA的相对定量。试验数据采用Excel 2010软件进行整理，SAS 8.2软件进行统计分析。结果以\overline{x}±s表示，P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PCR结果

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，结果如图1所示。

2.2 ALX4基因Real-Time PCR检测结果

由图2~3可知，在内参基因18S rRNA扩增曲线中总荧光强度在19个循环左右开始趋于平缓，溶解曲线的峰值在84 ℃以上，有且只有1个峰，滩羊皮肤ALX4基因溶解曲线的峰值均在88 ℃以上，有且只有1个峰。

2.3 ALX4基因分型检测

通过对滩羊群体ALX4基因3个SNPs位点进行分型检测，SNP1位点突变在滩羊15号染色体UTR区域发生了T/C突变，存在T和C两个等位基因，TT、TC和CC 3种基因型。SNP2位点在15号染色体Intron区域发生T/C突变，在该位点检测出 T和C 2个等位基因，TT和TC 2种基因型；SNP3在15号染色体Intron区域发生T/C突变，存在T和C 2个等位基因，TT和TC 2种基因型。

2.6 多态位点的遗传多态性分析

由表2可知，ALX4基因SNP1 位点在滩羊群体中检测到TT、TC和CC 3种基因型，基因型频率分别为 0.82 、0.17和 0.01；在 SNP2 位点检测到TT、TC 2种基因型，基因型频率分别为 0.86、0.14；在 SNP3 位点检测到TT、TC 2种基因型，基因型频率分别为 0.86、0.14。3个SNP 位点在滩羊群体中多态信息含量呈低度多态（PIC<0.25），经卡方检验表明，SNP1位点均处于 非Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05），SNP2和SNP3位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。

2.7 不同位点与滩羊不同发育时期毛发性状的关联分析

由表3可知，ALX4基因SNP1 Chr15：724532 65位点CC基因型出生侧部弯曲数显著大于其他基因型（P<0.05），SNP3 chr15：72476712位点TT基因型二毛侧部毛长显著大于其他基因型（P<0.05）。

2.8 不同时期滩羊皮肤组织中ALX4基因的表达量

采用相对定量方法，18S rRNA为内参基因，以羔羊出生时期皮肤组织中样本1的ALX4基因mRNA 表达水平为基准（设为1），分析羔羊不同日龄皮肤组织中ALX4基因表达水平。由表4可知，出生时期滩羊皮肤组织中ALX4基因的表达量极显著高于二毛时期龄滩羊的皮肤组织（P<0.01）。

3 讨论

对宁夏地区滩羊ALX4基因 SNPs 位点进行遗传多态性分析，进行Hardy-Weinberg 平衡检验，SNP1位点均处于 非Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05），SNP2和SNP3位点均处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P<0.05），SNPs 位点在滩羊群体中遗传参数，多态信息含量均处于低度多态性（PIC<0.25），纯合度均较高，杂合基因型频率较低，在滩羊群体中ALX4基因SNPs位点的遗传变异较小，说明以上位点的纯合基因型积累较多，且遗传变异较小，用于优良性状选育的潜力较小，可能与该群体长期本品种选育及闭锁繁育有关。滩羊2000年被列入国家二级保护品种名录，并对其进行了核心群选育，人工选择使其群体结构有所改变，表现出部分群体多个位点不同程度地偏离Hardy-Weinberg平衡状态，但对不同畜种而言适度的人工选择干预有利于其生产性能的提高。无根状同源异型盒-4 （aristaless-like homeobox 4，ALX4）基因在医学上研究较多，人类和小鼠的ALX4突变与颅面缺陷和泌尿生殖系统异常（如隐睾和尿道上裂）有关^［20］。miR-1470通过靶向肝细胞癌中的ALX4来调节细胞增殖和凋亡^［21］。ALX4人类皮肤和毛囊发育中都起着至关重要的作用^［22］。ALX4基因敲除和突变动物的毛囊发育中发现的缺陷以及重叠的表达模式，ALX4会降低内源性N-CAM蛋白的表达^［23］。同时国内学者研究ALX4基因与毛长和绒细性状显著相关，与毛囊发育及脱毛性状相关，ALX4可作为绒毛细度性状的候选基因^［15-17］。惠太宇等^［24］ALX4基因在辽宁绒山羊细型皮肤中聚焦到3个靶标miR-m13，miR-433-5p和miR-671，且表达量都显著高于粗型皮肤中的表达量，ALX4基因可能对羊绒细度候选基因发挥重要的正调控作用。由此可以推测ALX4可能是一个与羊毛品质相关的基因。本研究发现ALX4基因SNP1 Chr15：72453265位点CC基因型出生侧部弯曲数显著大于其他基因型（P<0.05），SNP3 chr15：72476712位点TT基因型二毛侧部毛长显著大于其他基因型（P<0.05）。通过对ALX4基因在不同时期皮肤组织的定量表达发现，出生时期滩羊皮肤组织中ALX4基因的表达量极显著高于二毛时期龄滩羊的皮肤组织（P<0.01），推测ALX4基因可能在出生时期对弯曲有重要调控作用。

4 结论

ALX4基因多态性与滩羊羊毛性状显著相关，可作为滩羊羊毛性状选育的候选基因，其中Chr15：72453265位点和chr15：72476712位点可能是影响滩羊羊毛弯曲和毛长的潜在候选SNP位点，可作为滩羊羊毛性状的遗传分子标记。

参考文献

[1] 刘统高，李晓娜，王倩，等.宁夏滩羊遗传资源保护利用情况调研［J］.畜牧兽医杂志，2023，42（4）：61-62.

[2] 马青，岳彩娟，马丽娜.围绕品种、品质、品牌开展科技攻关助推滩羊产业高质量发展［J］.宁夏农林科技，2019，60（9）：4-5.

[3] Tao J Z， Zhou H T， Gong H，et al.Variation in the KAP6-1 gene in Chinese Tan sheep and associations with variation in wool traits［J］.Small Ruminant Research，2017，154：129-132.

[4] Bai L R， Gong H， Zhou H T，et al.A nucleotide substitution in the ovine KAP20 gene leads to a premature stop codon that affects wool fibre curvature［J］.Animal Genetics，2018，49（4）：357.

[5] Bai L R， Wang J， Zhou H T，et al.Identification of Ovine KRTAP28-1 and Its Association with Wool Fibre Diameter［J］.Animals：an Open Access Journal from MDPI，2019，9（4）.

[6] Bai L R， Zhou H T， Gong H，et al.Variation in the ovine KAP8-1 gene affects wool fibre uniformity in Chinese Tan sheep［J］.Small Ruminant Research，2019，178：18-21.

[7] Tao J Z， Zhou H T， Yang Z，et al.Variation in the KAP8-2 gene affects wool crimp and growth in Chinese Tan sheep［J］.Small Ruminant Research，2017，149：77-80.

[8] 郭妍，丁伟，陶金忠，等.不同日龄滩羊皮肤组织化学特征比较［J］.中国畜牧兽医，2021，48（8）：2762-2770.

[9] 李亚超，陶金忠，陈永宏，等.应用 iTRAQ 技术分析串子花型滩羊初生期与二毛期的差异蛋白［J］.基因组学与应用生物学，2021，40（2）：516-525.

[10] 王辉，袁莉刚，丁伟，等.ColⅣ、LN 及 HSPG 在滩羊皮肤组织的分布研究［J］.中国兽医科学，2021，51（2）：242-250.

[11] 陈永宏，杨佐青，陶金忠，等.应用 iTRAQ 技术分析滩羊二毛期不同花穗型裘皮差异蛋白［J］.基因组学与应用生物学，2020，39（1）：18-29.

[12] 李向龙，陶金忠，丁伟，等.滩羊二毛期羊毛性状分析及其相关性研究［J］.中国畜牧兽医，2019，46（2）：442-448.

[13] Ma Q， Liu X X， Pan J F，et al.Genome-wide detection of copy number variation in Chinese indigenous sheep using an ovine high-density 600 K SNP array［J］.Sci Rep Uk，2017，7（1）：912.

[14] AD H，AL C，AF L，et al.Differentially phosphorylated proteins in the crimped and straight wool of Chinese tan sheep［J］.Journal of Proteomics，2021，235：104115.

[15] 张治龙，吴铁成，李玉荣，等.绒山羊ALX4基因多态性与绒毛性状相关性分析［J］.农业生物技术学报，2020，28（8）：1431-1440.

[16] 雷志惠，张利平，赵洪昌，等.全基因组选择信号揭示绵羊毛囊发育及脱毛性状相关的候选基因［J］.畜牧兽医学报，2022，53（2）：381-390.

[17] 乔贤.绒山羊SNP芯片设计及重要经济性状全基因组关联分析研究［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2021.

[18] Wigginton J E， Cutler D J， Abecasis G R.A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium［J］.American Journal of Human Genetics，2005，76（5）：887-893.

[19] Zhou X， Stephens M.Genome-wide efficient mixed-model analysis for association studies［J］.Nat Genet.2012，44（7）：821-824.

[20] Lu Y， Liu Y， Qin A，et al.ALX4 regulates craniofacial and urogenital development through modulating Wnt/β-catenin signaling［J］.Biochemical and Biophysical Research Communication，2020，522（3）： 716-721.

[21] Kayserili Hulya， Uz Elif， Niessen Carien，et al.ALX4 dysfunction disrupts craniofacial and epidermal development［J］.Human Molecular Genetics，2009，18（22）：4357-4366.

[22] Kayserili H， Uz E， Niessen C，et al.ALX4 dysfunction disrupts craniofacial and epidermal development［J］.Human Molecular Genetics，2009，18（22）： 4357-4366.

[23] Boras K， Hamel PA.Alx4 Binding to LEF-1 regulates N-CAM promoter activity［J］.Molecular Basis of Cell and Developmental Biology，2002，277（2）：1120-1127.

[24] 惠太宇，郑圆媛，岳畅，等.羊绒细度候选基因靶标miRNAs筛选和鉴定［J］.沈阳农业大学学报，2019，50（1）：19-27.

基金资助

宁夏回族自治区重点研发项目(2023BCF01007)