黄芪多糖对鸡巨噬细胞免疫应答的转录-代谢组学研究

Transcriptional metabolomics study of the immune response induced by Astragalus polysaccharides in chicken macrophages

摘要

目的 利用转录组学和代谢组学联合分析200 μg/mL黄芪多糖（APS）对鸡巨噬细胞HD11免疫作用，探讨200 μg/mLAPS对鸡巨噬细胞HD11免疫应答的作用机制。 方法 设置空白对照组（CON组）和200 μg/mL APS处理组（A₂₀₀组），其中A₂₀₀组和CON组分别用含200 μg/mL APS的完全培养液培养和完全培养液培养HD11细胞12 h。通过转录组和代谢组分析筛选差异表达基因和差异代谢物，之后联合KEGG富集分析，构建相关网络互作图并进行转录组与代谢组联合分析。 结果 转录组结果表明，在A₂₀₀组与CON组中共检测到差异基因1 196个，其中上调基因862个，下调基因334个；KEGG分析表明，差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、ECM受体相互作用、吞噬体等多种途径；代谢组结果表明，在A₂₀₀组与CON组中共筛选出差异代谢物138个，其中下调差异代谢物84个，上调的差异代谢物54个。KEGG通路分析表明，差异物主要富集到氨基酸代谢、类脂物代谢、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢以及信号传导等多个途径；转录组与代谢组联合分析表明，差异基因与差异代谢物显著富集于组氨酸代谢、嘌呤代谢、碳代谢、二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢、神经活性配体-受体相互作用、β-丙氨酸代谢、嘧啶代谢、磷脂酰肌醇信号系统等。 结论 200 μg/mLAPS处理HD11细胞可能是通过糖酵解和磷酸戊糖途径以及Toll样受体信号通路对HD11细胞发挥免疫增强作用。

Abstract

Objective Transcriptomics and metabolomics were used to analyze the immune effect of 200 μg/mL Astragalus polysaccharide (APS) on chicken macrophage HD11，and to explore the mechanism of immune response of 200 μg/mLAPS on chicken macrophage HD11. Method Blank control group (CON group) and 200 μg/mL APS treatment group (A₂₀₀ group) were set up，in which HD11 cells in A₂₀₀ group and CON group were cultured with complete culture medium containing 200 μg/mL APS for 12 h.Differentially expressed genes and differentially expressed metabolites were screened by transcriptome and metabolome analysis，and then combined with KEGG enrichment analysis，correlation network interaction map was constructed and combined transcriptome and metabolome analysis was performed. Result The transcriptome results showed that 1196 differential genes were detected in the A₂₀₀ and CON groups，including 862 up-regulated genes and 334 down-regulated genes.KEGG analysis showed that the differentially expressed genes were mainly concentrated in cytokine-cytokine receptor interaction，toll-like receptor signaling pathway，ECM receptor interaction，phagosome and other pathways.Metabolomic results showed that a total of 138 differential metabolites were screened in the A₂₀₀ and CON groups，of which 84 were downregulated and 54 were upregulated.KEGG pathway analysis showed that the differential metabolites were mainly enriched in amino acid metabolism，lipid metabolism，cofactor and vitamin metabolism，nucleotide metabolism and signal transduction.Combined transcriptome and metabolome analysis showed that differential genes and differential metabolites were significantly enriched in histidine metabolism，purine metabolism，carbon metabolism，dicarboxylic acid metabolism，glutathione metabolism，neuroactive ligand-receptor interaction，β-alanine metabolism，pyrimidine metabolism，phosphatidylate inositol signaling system，etc. Conclusion Treatment of HD11 cells with 200 μg/mLAPS may enhance the immune function of HD11 cells through glycolysis，pentose phosphate pathway and toll-like receptor signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

黄芪多糖 / 巨噬细胞 / 转录 / 代谢

Key words

Astragalus polysaccharide / macrophage / transcription / metabolism

黄芪多糖是中药黄芪的主要天然生物活性成分^［1］，为水溶性、淡黄色粉末，由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、葡萄糖醛酸等组成^［2-3］。其具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖、抗衰老和抗炎等药理作用^［4-6］。近年来研究发现，将APS作为添加剂用于养鸡业，能够调整鸡群整体的抗应激性，减少鸡群出现疾病，还可降低抗生素的使用量^［7］。巨噬细胞在机体免疫平衡、组织修复和抗感染中发挥着重要作用，因此该细胞常被作为模式细胞来研究药物的固有免疫调控机制^［8-11］。APS作为公认的免疫增强剂，是先天免疫细胞的优良调节剂，已在人和小鼠免疫系统中得到证实^［12-14］。我们在前期研究中发现，50~200 μg/mL剂量APS对HD11细胞有不同的干预作用，其中200 μg/mL APS的调节作用更为显著。具体表现为APS能显著提高细胞中NO含量，显著提高炎性因子IL-1β和IL-6转录水平，但对TNF-α无显著影响。此外，APS对TLR2、TLR4的基因表达有显著抑制作用，但能提高NF-κB p65的转录水平。这些结果表明APS作为一种免疫调节剂对鸡巨噬细胞有免疫增强的作用，但作用机制未见文献报道。

随着生命科学的飞速发展和大数据时代的到来，基于转录组学和代谢组学技术，分别从转录体以及代谢物层面为中药作用机制的深度研究提供了有力手段^［15］。转录组学与代谢组学是一门新兴技术，转录组学是从基因水平研究基因表达的情况^［16］；代谢组学呈现了生物体内小分子代谢物系统而又全面的特征^［17］。该技术的应用可为疾病发生、药理学作用等领域的深入研究提供重要依据^［18］。因此，本试验拟通过转录组与代谢组分析200 μg/mL APS是否通过调控相关信号通路和代谢途径，对HD11细胞发挥免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用APS由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽医实验室制备，经过相关测定发现其总糖含量为（95.31±3.55）%，由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成；HD11细胞由西北农林科技大学动物医学院王晶钰老师课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 HD11细胞复苏

将冻存的HD11细胞在37.5 ℃下水浴解冻，1 000 r/min离心5 min弃上清取沉淀，接于1640培养基（含10%胎牛血清、2.5%鸡血清和1%青链霉素）重悬并移入细胞培养瓶中，标记为第1代，置于41 ℃、体积分数为５%的CO₂培养箱中进行培养，每隔48 h更换1次培养基，在显微镜下观察细胞的形态及生长状况。

1.2.2 HD11细胞传代

当细胞融合度达80%~90%以上时弃上清，用预热的PBS洗一遍，使用胰蛋白酶-EDTA消化3 min，直至在镜下细胞基本呈圆形回缩、轻拍细胞瓶可见细胞滑动时，弃去胰蛋白酶-EDTA，加1640培养基（含10%胎牛血清、2.5%鸡血清和1%青链霉素）1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1640培养基轻轻吹打混悬细胞，使用细胞计数器计数并调整浓度后分装到新的细胞培养瓶中，标记为第2代，贴壁培养24 h。传至3~5代可进行后续试验。

1.2.3 HD11细胞的处理与分组

将消化后的HD11细胞1 000 r/min离心5 min弃上清取沉淀，接于1640培养基（含10%胎牛血清、2.5%鸡血清和1%青链霉素）中，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，按5 mL/瓶接于T25细胞培养瓶中，置于41 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养36 h，弃上清。将细胞分为空白对照组（CON组）和200 μg/mL APS处理组（A₂₀₀组）。（1） 空白对照组细胞中加入1640培养基（含10%胎牛血清、2.5%鸡血清和1%青链霉素）培养12 h；（2） 200 μg/mL APS试验组中用1640培养基（含10%胎牛血清、2.5%鸡血清和1%青链霉素）将APS质量浓度调整为200 μg/mL 后加入细胞中培养12 h；收集各组上清和细胞并进行后续试验。

1.2.4 转录组学、代谢组学及二者关联分析

将培养的细胞去除培养基，用预冷的PBS清洗2~3次，弃去上清，最后加入1 mL预冷的80%的甲醇水溶液，使用细胞刮将培养容器中所有细胞都刮干净，转入2 mL离心管（冻存管）中，液氮速冻15 min，-80 ℃保存，足量干冰运输。

1.3 数据分析

转录组学差异基因的筛选标准是|log₂（Fold change）|≥1且P_adj≤0.05。代谢组学差异代谢物的筛选主要参考VIP、FC和P-value 3个参数，VIP是指PLS-DA模型第一主成分的变量投影重要度，VIP值表示代谢物对分组的贡献；FC指差异倍数（Fold change），为每个代谢物在比较组中所有生物重复定量值的均值的比值；P-value是通过T-test计算得到，表示差异显著性水平。采用一维方差分析，设定阈值为VIP>1.0，FC>1.5或FC<0.667的方法筛选差异代谢物。并计算出差异代谢物在两组间的差异变化倍数 FC（fold change），通过差异变化倍数判断差异代谢物的上调或者下调。

2 结果与分析

2.1 APS处理组与空白对照组的转录组分析

2.1.1 差异表达基因分析

转录组测序结果中的共表达维恩图展示了每个组中唯一表达的基因数量，重叠区域展示了两个组中共表达的基因数量。200 μg/mL APS处理组（A₂₀₀）与空白对照组（Control）的唯一表达基因数量与共表达基因数如图1所示，空白对照组总共鉴定出11 116个表达基因，而APS处理组共鉴定出11 205个表达基因，其中二者共同表达的基因数为10 663个。

由图2可以看出，以|log₂Fold change|≥1.01且P_adj≤0.05为标准，APS处理组与空白对照组相比较，共筛选到差异基因1 196个，其中上调基因862个，下调基因334个。

2.1.2 差异表达基因KEGG富集分析

KEGG通路数据库包括了各种生物通路中分子相互作用网络和生物体所特有的变化形式，从而确定蛋白质参与的最重要的信号转导通路和生物代谢通路。将APS处理组与空白对照组的差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现，APS处理组与空白对照组的320个差异基因富集于128条KEGG通路，差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、ECM受体相互作用、吞噬体等信号通路，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号2条通路最为显著（图3）。

2.1.3 关键信号通路中差异基因的表达情况

细胞因子-细胞因子受体信号通路与Toll样受体信号通路是两条对HD11细胞免疫调节作用影响的重要途径，与细胞的免疫调节等密切相关。对APS处理组与空白对照组的差异基因表达进行分析，发现在细胞因子-细胞因子受体信号通路中富集了34个差异基因，其中上调基因30个包括IL8、IL8L1、IL13RA2、CXCL13L3、CCL4和CSF1等，下调基因4个包括IL12B、CCR5、GDF11和TNFRSF8（表1）；在Toll样受体信号通路中主要富集了16个差异基因，其中上调基因10个包括IL8、IL8L1、CCL4、IL1B和SPP1等，下调基因6个包括TLR2A、TLR2B、TLR7、IL12B、MAP2K6和TLR5（表2）。

2.2 APS处理组与空白对照组代谢组分析

2.2.1 代谢组学多元统计分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是将一组可能存在相关性的变量，通过正交变换转换为一组线性不相关变量的统计方法，转换后的这组变量即称为主成分。依据PCA模型显示，第一主成分可显示40.02%的代谢物信息，第二主成分可显示23.98%的代谢物信息，A₂₀₀处理组与CON组代谢物的第一主成分和第二主成分在空间中的分布相对独立，存在显著差异（图4）。

2.2.2 差异代谢物分析

利用液相色谱－质谱技术，参比空白对照组，APS处理组共筛选出623个差异代谢物，其中差异显著的代谢物总数为138个。在差异显著的代谢物中，下调的差异代谢物为84个，上调的差异代谢物为54个。根据组间差异比较组合得到的差异代谢物绘制火柴杆图，能够较为清晰地表示代谢物的上、下调以及差异倍数变化较大的物质。以log₂（Fold Change）进行排序，分别取前20的上调/下调代谢物进行火柴杆图的展示。其中6-唾液乳糖、生物素、阿糖尿苷等显著性上调；谷胱甘肽、甲基丁二酸、柠檬酸等显著性下调（图5）。

2.2.3 差异代谢物KEGG通路富集分析

对APS处理组和空白对照组的差异表达代谢进行KEGG通路富集分析，主要涉及的通路包括细胞转化、环境信息过程、遗传信息过程、代谢和有机系统5类，包括氨基酸代谢、类脂物代谢、辅助因子和维生素的代谢、核苷酸代谢等20条通路发生变化（图6）。

2.3 APS处理组与空白对照组的转录组和代谢组联合分析

2.3.1 基因分析差异结果

转录组与代谢组是检测特定状态下生物个体、组织或细胞的基因和代谢物的表达水平。APS处理组与空白对照组比较在上调中有862个显著差异的基因，有54个显著差异的代谢物；在下调中有334个显著差异的基因，有84个显著差异的代谢物。

2.3.2 代谢与转录KEGG富集分析

基于代谢与转录同一比较对的KEGG富集结果，以KEGG Pathways为条目，代谢、转录共同富集到的通路主要有组氨酸代谢、嘌呤代谢、碳代谢、二羧酸代谢、谷胱甘肽代谢、神经活性配体-受体相互作用、β-丙氨酸代谢、嘧啶代谢、磷脂酰肌醇信号系统等（图7）。

3 讨论

在饲料端“禁抗”背景下，诸多学者致力于研究无毒副作用的天然植物类饲料添加剂，有效减少抗生素用量，缓解细菌耐药性、抵抗力下降和药物残留等问题^［19-20］。APS作为传统中药黄芪的主要成分，其具有多种生物学活性，其中免疫调节作用已被广泛认可。虽然黄芪多糖作为畜禽养殖端疾病防控的主要药物，但其对畜禽天然免疫调节作用的机制研究尚不深入^［21］。在前期研究中已证明，APS对正常的HD11细胞具有免疫增强作用^［22-23］。为深入研究APS对HD11细胞的免疫增强机制，本研究通过转录组和代谢组对200 μg/mL APS处理的HD11细胞进行差异分析，以期促进APS免疫增强作用的深入研究，为多糖类物质在免疫增强方面的产品开发和临床应用奠定理论基础。

本研究结果显示，APS试验组与空白对照组共筛选出差异基因1 196个，APS试验组862个基因表达较空白对照组上调、334个基因表达下调；APS试验组与空白对照组的320个差异基因富集于128条KEGG通路，差异表达基因主要富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号通路、ECM受体相互作用、吞噬体等信号通路上富集。

巨噬细胞存在于大部分组织中，因此具有不同的功能。除了能启动对病原体的免疫反应和炎症反应，巨噬细胞还维持组织稳态以及在组织的修复和重塑中发挥作用^［24］。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能^［25］；M2型巨噬细胞仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-B等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用^［26］。其中M1型巨噬细胞对于早期抵御畜禽感染性疾病至关重要^［27］。炎症因子主要是由单核/巨噬细胞或淋巴细胞产生的细胞因子，参与炎症或级联反应，包括IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等。这些细胞因子参与机体多种疾病的炎症、感染和免疫等多种生理病理过程^［28］。在细胞因子-细胞因子受体相互作用的通路中，我们发现200 μg/mLAPS促进IL-8、IL13RA2、CXCL13L3及CCL4等的转录，抑制CCR5、IL12B等的转录。

Toll样受体是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁^［29］。TLR是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。新近研究发现，TLR能结合机体自身产生的一些内源性分子（即内源性配体）^［30］。免疫佐剂可增强抗肿瘤免疫，其分子和细胞机制得到进一步阐明TLR也在其中扮演重要角色。由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些能被TLR识别的内源性配体，所以TLR在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用^［31-32］。在Toll样受体信号通路中，我们发现APS促进IL8、IL8L1、CCL4、IL1B和SPP1等的转录，抑制TLR2A、TLR2B、TLR7、IL12B、MAP2K6和TLR5的转录。

细胞代谢是细胞内所发生的用于维持生命的一系列有序的化学反应的总称^［33］。这些反应进程使得生物体能够生长和繁殖、保持它们的结构以及对外界环境做出反应。细胞代谢中的化学反应可以归纳为代谢途径，通过一系列酶的作用将一种化学物质转化为另一种化学物质。酶对于细胞代谢反应来说是非常重要的，因为酶可以通过一个热力学上易于发生的反应来驱动另一个难以进行的反应，使之变得可行。在细胞代谢过程中，复杂多样的代谢酶会产生大量的代谢产物小分子。这些小分子除了在经典的代谢途径中发挥作用外，还作为信号分子发挥非代谢性的功能，将来源于细胞外的微环境因素和细胞内的基因表达信息联系起来，对细胞的各种特性和进程产生影响^［34-36］。研究结果显示，APS处理组共筛选出623个差异代谢物，其中差异显著的代谢物总数为138个。在差异显著的代谢物中，下调的差异代谢物为84个，上调的差异代谢物为54个。且差异表达代谢物主要在6-唾液乳糖、生物素、阿糖尿苷等通路上富集。差异表达基因富集到56条KEGG通路中，主要富集于嘌呤代谢、碳代谢、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、酪氨酸代谢等。其中ACSS2、ATP酶H+转运V0亚单位（ATP6V0）、5´-脱氧-5´-硫腺苷（MTA，一种甲基转移酶抑制剂）、腺嘌呤、一氧化氮合酶（iNOS）等被显著性上调，而己糖-6-磷酸脱氢酶（H6PD，是磷酸戊糖途径NAPDH合成的关键酶，与G6PDH具有相似的反应特点）、磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRPS2）、GSH、柠檬酸（CA）、甲基琥珀酸（MSA）等被显著性下调。研究发现在免疫作用刺激下，细胞中代谢重新编程，包括葡萄糖摄取增加，糖酵解速率提高，磷酸戊糖途径上调以及通过TCA循环的氧化磷酸化水平降低。转录组与代谢组联合分析表明，嘌呤代谢、碳代谢、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等是代谢、转录共同富集到的通路代谢途径，因此根据试验推测出200 μg/mLAPS作用HD11细胞后，主要发生糖酵解和磷酸戊糖途径等的代谢重编程。

4 结论

本研究通过转录组学和代谢组学对200 μg/mL APS处理的鸡巨噬细胞的免疫调节作用进行研究，发现了糖酵解和磷酸戊糖途径以及Toll样受体信号通路可能参与200 μg/mL APS处理的鸡巨噬细胞的免疫调节作用，从而揭示了200 μg/mL APS处理的鸡巨噬细胞免疫调节作用的转录和代谢响应规律，涉及到IL8、IL13RA2、CXCL13L3、CCL4、CSF1、IL1B、TLR2A、TLR2B等基因以及谷胱甘肽、甲基丁二酸、柠檬酸、6-唾液乳糖、生物素、次黄嘌呤、肌苷、溶血磷脂酰胆碱（11∶10）等代谢物。该研究结果有助于解析200 μg/mL APS的鸡巨噬细胞免疫调节作用的研究，为促进APS免疫增强作用的深入研究与免疫增强方面产品的开发和应用奠定理论基础。

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基金资助

甘肃省国际合作项目(22YF7WA032)

甘肃省技术创新引导计划项目(22CX8NA013)

中国农业科学院中兽医与临床创新团队(CAAS-ASTIP-2015-LIHPS-06)