草莓超低温脱毒体系优化及效果检测

Optimization and effect detection of ultra-low temperature virus-free treatment of strawberries

摘要

目的 以红颜和天仙醉2个草莓（Friagaria×ananassa Duch.）品种为试验材料进行草莓超低温脱毒体系优化探索。 方法 对超低温脱毒体系的预培养蔗糖浓度、暗培养天数、装载时间、脱水时间4个程序进行单因素筛选，根据单因素试验结果设计正交试验，筛选出成活率最高的体系。 结果 就成活率而言，超低温脱毒关键程序影响程度大小依次是：装载时间、蔗糖浓度、脱水时间、暗培养时间。2种草莓在筛选出的体系中成活率均在70%以上，且脱毒率达100%。 结论 经本研究优化的草莓超低温脱毒体系为：将建立好的外植体切取茎尖1 mm，接种到含0.5 mol/L蔗糖的预培养基上暗培养3~7 d，后装载1 h、脱水1 h，再经液氮超低温处理1 h后进行恢复培养。

Abstract

Objective Two strawberry (Friagaria×ananassa Duch.) cultivars Benihoppe and Tianxianzui were used as experimental materials to study the optimization of the strawberry ultra-low temperature detoxification system. Method The four programs of pre-culture sucrose concentration，dark culture days，loading time and dewatering time of ultra-low temperature virus-free system were screened by single factor.An orthogonal experiment was designed according to the results of the single factor experiment，and the system with the highest survival rate was selected. Result In terms of survival rate，the degree of influence of key procedures of ultra-low temperature detoxification are: loading time，sucrose concentration，dehydration time，dark culture time.The survival rate of the two strawberry varieties in the selected system was more than 70%，and the virus-free rate reached 100%. Conclusion The optimized ultra-low temperature detoxification system of strawberry was as follows: the established explants were cut to 1 mm shoot tip，inoculated on the pre-medium containing 0.5 mol/L sucrose and cultured in the dark for 3~7 days，then loaded for 1 h，dehydrated for 1 h，and treated with liquid nitrogen for 1 h before recovery culture.

Graphical abstract

关键词

草莓 / 超低温 / 脱毒 / 病毒检测

Key words

strawberry / ultra-low temperature / virus elimination / virus detection

草莓（Friagaria×ananassa Duch.）果肉多汁、酸甜可口，营养价值与经济价值均较高，因此备受消费者喜欢，市场供不应求^［1］。草莓作为一种长期进行无性繁殖的蔷薇科植物，病毒侵染率极高，导致草莓产量下降和品种退化^［2］。草莓病毒在世界各地危害严重，主要表现为植株萎蔫、叶片卷曲斑驳、果实畸形、产量降低^［3］，严重影响草莓产量并损害经济效益^［4］。草莓植株本身对病毒并没有免疫能力，且目前还没有药剂可以对其进行有效治疗，因此为保证草莓的优良性状、提高草莓产量，对草莓茎尖进行脱毒处理同时结合组培技术获得脱毒组培苗至关重要^［1］。

脱毒苗可以通过茎尖脱毒、热处理脱毒、花药培养脱毒和化学药剂处理等多种方法来获取^［5］。近年来，国内外众多学者从多方面对脱毒技术进行了研究，发现茎尖脱毒效果较好、长势好且方便投入生产使用，是目前国内外使用最广泛的脱毒方法，在草莓^［6-7］、葡萄^［8］、百合^［9］等植物脱毒上均有广泛应用。但是茎尖培养的脱毒率与茎尖大小息息相关，需要综合考虑存活率和操作的可行性^［10］，单独采用茎尖脱毒具有局限，因此茎尖脱毒需要结合其他处理。

超低温脱毒是近些年发展起来的一种在茎尖脱毒基础上进行的新型高效的理想脱毒技术。病毒在植物体内分布不均，分生组织细胞几乎不含病毒，病毒含量高的分化细胞中自由水较多，在超低温处理过程中这部分分化细胞易形成较多冰晶而被破坏致死^［11］，经过超低温处理后存活的仅有生长点的分生组织细胞，达到脱毒。相比于单独茎尖脱毒，茎尖超低温脱毒不依赖茎尖大小且脱毒率高^［12］，能够有效脱除植物病毒。1997年，法国研究员Brison等^［13］首次采用超低温脱毒技术获得无病毒植株；Helliot等^［14］运用超低温脱毒技术对香蕉进行脱毒，发现其脱毒率远高于茎尖脱毒；我国学者王乔春等^［15-16］运用超低温脱毒先后对葡萄与马铃薯脱除病毒。随着研究的深入，该技术开始在苹果、马铃薯、柑橘、葡萄、草莓、百合等物种中广泛应用，白建明等^［17］、王子成等^［18］，曲先等^［19］对马铃薯Y病毒（PVY）等进行了脱除；丁芳等^［20］成功脱除柑橘黄龙病病菌；毕文璐等^［21］成功脱除葡萄卷叶病病毒；冯超红等^［22］成功脱除苹果茎痘病毒与茎沟病毒。靳慧洁^［23］建立了百合茎尖超低温脱毒体系；陈曦等^［10］、蔡斌华等^［11］、盛宏亚等^［24］、罗娅等^{［11，25］}也相继优化了草莓超低温脱毒体系。目前，此法是公认的最有效脱除病毒的方法，为生产脱毒苗开辟了一条新途径，在今后的脱毒研究中有很好的前景。

本试验选择栽培面积最大的红颜与在本地适应性较强的天仙醉2个草莓品种进行草莓超低温脱毒优化探索，同时对本课题组前期在本地检出的草莓病毒：SMoV、SMYEV、SCV进行脱毒检测，为大规模繁育草莓脱毒组培苗提供新的方法技术。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

试验材料为青海大学农牧实验楼409实验室自行繁育获得的红颜与天仙醉2个品种的匍匐茎。

PVS₂溶液：MS+ 30%（W/V）丙三醇+ 15%（W/V）乙二醇+15%（W/V）DMSO+0.4 mol/L蔗糖；60%PVS₂溶液：40%（V/V）MS+60% PVS₂溶液；卸载液：MS+1.2 mol/L蔗糖。

1.2 外植体的消毒与建立

从2个草莓品种植株上分别剪取匍匐茎，置于烧杯中用洗洁精清洗表面，之后用自来水进行流水冲洗2 h；在超净工作台内，用75%酒精浸泡30 s，立即用无菌水冲洗3次除去残留酒精，再用0.1%HgCl₂浸泡8 min，用无菌水冲洗3次直至颜色透明。

将灭菌后的匍匐茎吸干水分，剥取2 cm左右茎尖，接种到MS培养基中；在（4±2） ℃，1 000 lx，光周期12 h环境下培养2周。培养基成分为：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L^{NAA+30 g/L蔗糖+ 8 g/L琼脂。}

1.3 超低温预培养、预处理条件筛选

本试验首先对超低温脱毒体系的预培养蔗糖浓度、暗培养天数、装载时间、脱水时间4个程序分别做单因素试验进行筛选，之后根据单因素实验结果进行正交试验设计，筛选出最优组合，每处理接种30个茎尖，重复3次。整个过程在超净工作台内进行。

恢复培养基：MS+0.4 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.2 mg/L GA₃^［25］。

1.3.1 预培养蔗糖浓度筛选

对1.2中建立的外植体切取茎尖1 mm左右，接种到蔗糖浓度分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L的带有2 mol/L甘油的MS培养基中在4 ℃无光条件下预培养5 d；在室温（25±2）℃下放到60%的PVS₂中装载1 h；将装载完毕的茎尖放入100%的PVS₂溶液冷冻管中0 °C脱水2 h；快速更换装有100%的PVS₂溶液冷冻管，将冷冻管迅速投入液氮中保存1 h；将冷冻管取出后快速放入40 ℃水浴中进行解冻2 min，干燥后用卸载液冲洗两次，每次10 min左右；最后将洗涤后的茎尖用滤纸吸干后接种于恢复培养基上，暗培养3 d后进行光照培养［（25±2）℃，3 000 lx，光周期16 h］，30 d统计茎尖成活率。

1.3.2 暗培养天数筛选

切取1 mm左右茎尖接种到蔗糖浓度为0.3 mol/L的带有2 mol/L甘油的MS培养基中在4 ℃无光条件下分别预培养1、3、5、7、9 d；之后步骤同1.3.1。

1.3.3 装载时间筛选

切取1 mm左右茎尖接种到蔗糖浓度为0.3 mol/L的带有2 mol/L甘油的MS培养基中在4 ℃无光条件下预培养5 d；然后将茎尖在室温（25±2）℃下放到60%的PVS₂中分别装载0、0.5、1、1.5、2 h；之后步骤同1.3.1。

1.3.4 脱水时间筛选

切取1 mm左右茎尖接种到蔗糖浓度为0.3 mol/L的带有2 mol/L甘油的MS培养基中在4 ℃无光条件下预培养5 d；然后将茎尖在室温（25±2）℃下放到60%的PVS₂中装载1 h；将装载完毕的茎尖放入100%的PVS₂溶液冷冻管中分别脱水0、1、2、3、4 h；之后步骤同1.3.1。

1.4 病毒检测

使用TRIzol试剂盒（天根，北京）提取RNA，参照反转录试剂盒 Fast Quant RT Super Mix （天根，北京）合成cDNA，取扩增引物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测30株，重复3次。病毒引物^［26-28］由上海生工生物公司进行合成（表1）。

1.5 数据处理

使用SPSS 20.0邓肯氏新复极差法统计分析，使用Excel、Word制作图表。

2 结果与分析

2.1 草莓超低温脱毒预培养、预处理程序单因素筛选

在液氮超低温处理之前进行预培养、预处理，以期提高外植体的超低温抗性从而提高成活率。外植体在含有蔗糖的培养基中暗培养为预培养，后续装载处理、脱水处理为预处理。

2.1.1 预培养蔗糖浓度筛选

由图1可知，随着蔗糖浓度的提高，红颜茎尖成活率呈先上升后下降趋势，在蔗糖浓度0.3~0.5 mol/L时成活率显著高于其他处理（P<0.05，下同），在0.4 mol/L条件下达到最高，为68.89%。之后蔗糖浓度再提高，成活率下降，此单因素试验筛选出红颜超低温脱毒预培养的最优蔗糖浓度为0.4 mol/L。天仙醉成活率随着蔗糖浓度的不断提高先升高后降低，在蔗糖浓度为0.5 mol/L时达到最高，与其他处理差异显著，为57.78%。蔗糖浓度再提高，成活率反而降低，此单因素实验筛选出天仙醉超低温脱毒预培养的最优蔗糖浓度为0.5 mol/L。

预培养基加入适量蔗糖可以吸收部分自由水，提高后期成活率，蔗糖浓度太低或太高会对茎尖成活可能会产生不利影响。

2.1.2 暗培养天数筛选

由图2可知，随着暗培养天数的增加，红颜茎尖成活率呈先上升后下降的趋势，暗培养5 d达到最大为64.44%，显著高于其他处理。暗培养时间再增加，成活率迅速下降。此单因素试验筛选出红颜茎尖最佳暗培养时间为5 d。天仙醉暗培养5~7 d成活率显著高于其他处理，在暗培养5 d达到最大为57.78%。后随暗培养时间延长成活率反而下降。此单因素试验筛选出天仙醉茎尖最佳暗培养时间为7 d。

适当的进行暗培养可以提高外植体的耐受性从而提高成活率，同时也说明长时间的黑暗无光可能会使外植体光照不足，不适宜茎尖成活。

2.1.3 装载时间筛选

由图3可知，不进行装载处理红颜成活率最低，为22.22%。随着装载时间的不断增加，红颜成活率先增大后减小，装载1 h时红颜成活率最高，显著高于其他处理，为64.44%。装载时间超过1 h成活率显著下降，此单因素试验筛选出红颜超低温脱毒预处理最佳装载时间为1 h。天仙醉与红颜一致，呈现先上升后下降趋势，不进行装载处理成活率最低，装载1 h效果最佳成活率为57.78%，且与其他处理差异显著。装载时间超过1 h成活率显著下降。此单因素试验筛选出天仙醉超低温脱毒预处理最佳装载时间为1 h。装载处理对成活率影响较大，适当进行装载处理可以提高对后续脱水、超低温处理的适应性，显著提高成活率，但过长或过短的装载时间会影响成活率。

2.1.4 脱水时间筛选

由图4可知，不进行脱水处理的红颜茎尖经超低温处理后成活率为27.78%，显著低于其他处理。随着脱水时间的逐渐延长，红颜成活率先升高后降低，脱水2 h红颜茎尖成活率达最大为64.44%，显著高于其他处理，之后成活率迅速降低。此单因素试验筛选出红颜超低温脱毒预处理的最适脱水时间为2 h。随着脱水时间的延长，天仙醉的成活率先提高后降低，在脱水1~3 h茎尖成活率显著高于其他处理，在2 h时达到最高为51.11%。此单因素试验筛选出天仙醉超低温脱毒预处理的最适脱水时间为2 h。

脱水处理对成活率也有较大影响，这说明脱水时间过短可能使细胞中自由水含量过高，导致超低温处理时出现大量冰晶影响成活，脱水时间过长可能使细胞中自由水含量过低而不利于茎尖存活。相较于红颜脱水处理对天仙醉的影响并不明显，这可能与品种不同有关。

2.2 超低温正交试验

基于2.1的单因素筛选结果，分别设计2个草莓品种的四因素三水平正交试验，对正交试验结果k值与极差Rj进行分析，就成活率而言，超低温脱毒关键程序影响程度大小依次是：装载时间、蔗糖浓度、脱水时间、暗培养时间（表2~3）。

进一步分析正交试验结果k值（表2~3），红颜超低温最优预培养与预处理程序为茎尖在含0.5 mol/L（k₃ 64.4）蔗糖的预培养基暗培养3 d（k₁ 61.9），后装载1 h（k₂ 69.6），再脱水1 h（k₁ 63.7），在此体系下红颜超低温处理后成活率为78%；天仙醉超低温最优预培养与预处理程序为茎尖在含0.5 mol/L（k₂ 59.89）蔗糖的预培养基暗培养7 d（k₂ 52.59），后装载1 h（k₂ 60.74），再脱水1 h（k₁ 56.67），该体系下天仙醉超低温处理后成活率为74.44%。

2.3 病毒检测

经病毒检测，超低温脱毒效果较好，两品种3种病毒脱毒率均达100%。对SMoV、SMYEV的脱除效果均显著高于传统茎尖脱毒，茎尖脱毒与超低温脱毒对SCV的脱除效果均较好（表4、图5）。

3 讨论

超低温脱毒的成活率主要与在进行超低温处理之前的预培养、预处理有关，预培养基中添加蔗糖同时进行暗处理提高抗性，通过室温装载处理、0 °C脱水处理减少外植体中多余的自由水提高对超低温的耐受性，本试验结果表明，在进行超低温处理之前进行上述处理可以提高成活率。

本研究红颜与天仙醉最佳蔗糖浓度为0.5 mol/L，与蔡斌华等^［11］对明宝草莓超低温脱毒、盛宏亚等^［24］对红颜草莓超低温脱毒、王玉英等^［29］对超低温组培虎雪兰脱毒、潘辰等^［30］对百合不定芽超低温脱毒时筛选出的蔗糖浓度0.5 mol/L结果一致。徐启红等^［31］在童子一号草莓、朱文涛等^［32］在五叶草莓的超低温保存中筛选出最佳蔗糖浓度为0.4 mol/L；罗娅等^［25］在红颜草莓超低温脱毒中筛选出的最佳蔗糖浓度为0.3 mol/L，与本试验结果有所不同。本研究筛选的预处理蔗糖浓度较高，这可能与本研究进行超低温处理的外植体为经过低温锻炼过的组培茎段有关，能适应较高浓度的蔗糖。

红颜暗培养3 d成活率最高，这与蔡斌华等^［11］、朱文涛等^［32］、陈曦等^［10］草莓超低温脱毒、王子成等^［18］超低温脱除马铃薯病毒时培养天数相同，天仙醉茎尖暗培养7 d下得到最高茎尖成活率，与罗娅等^［25］研究结果一致。本研究正交试验结果表明，暗培养天数影响最小，这说明对暗培养天数可能没有太严格的要求；本研究2个草莓品种暗培养时间有所区别，可能与品种不同有关；本研究红颜的暗培养时间较罗娅等^［25］对该品种筛选出的较短，这可能与本研究在建立外植体的过程中提前进行低温、低光照锻炼有关。

红颜与天仙醉最适装载时间均为1 h，与蔡斌华等^［11］、盛宏亚等^［24］、罗娅等^［25］优化的草莓超低温体系、子五成等^［33］对柑橘的超低温保存等前人试验结果一致。同时正交试验结果表明，装载处理对超低温脱毒影响最大，这说明装载处理可以对茎尖细胞发挥保护作用；可能是本研究使用60%PVS₂提高在后续脱水处理的适应性，可能促进外植体适应PVS₂中DMSO；可能在装载处理过程中提前吸收部分自由水提高超低温处理耐受性，提高成活率。

红颜与天仙醉最佳脱水时间为1 h，罗娅等^［25］、王玉英等^［29］、靳慧洁^［23］也认为脱水1 h处理下茎尖成活率最高；蔡斌华等^［11］、盛宏亚等^［24］在脱水2 h处理下茎尖成活率最高，与本研究结果有所差异，可能与盛宏亚等^［24］直接使用未处理的外植体有关，也可能不同品种对脱水与DMSO的耐性不同有关。脱水处理吸取自由水，以确保茎尖在超低温处理能尽量减少冰晶的产生，短时间的脱水处理可能不能充分脱除自由水，而长时间的脱水处理可能会引起DMSO毒害或脱水时间过长导致失水过多，不利于成活。

本研究表明，超低温脱毒率较高，但外植体建立方法、超低温处理方法、时间等程序仍需进一步研究，提高生产效率。

4 结论

经本试验优化的草莓超低温脱毒体系为：将建立好的外植体切取茎尖1 mm，接种到含0.5 mol/L蔗糖的预培养基上暗培养3~7 d，后装载1 h、脱水1 h，再经液氮超低温处理1 h后进行恢复培养可得到较高成活率的超低温脱毒恢复植株。

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基金资助

青海省林业厅林木种苗总站国家长期科研基地监测项目(2130211)