昆明地区凤仙花白粉病病原菌鉴定及其种质资源抗性评价分析

Identification of powdery mildew isolates from Impatiens balsamina and resistance evaluation of Impatiens varieties in Kunming

摘要

目的 明确昆明地区凤仙花白粉病病原菌种类及凤仙花种质资源对白粉病的抗性。 方法 以凤仙花病叶为试材，对分离纯化凤仙花白粉病病原菌进行形态学和分子生物学鉴定，并采用离体叶片接种法对19种凤仙花种质资源进行了抗性评价。 结果 病原菌分生孢子呈椭圆形，大小为24~32 μm×17~23 μm，内均含纤维体；分生孢子梗稍弯曲，大小为18~24 μm×88~97 μm，病原菌人工接种叶片与自然感病叶片症状一致。对病原菌的ITS序列进行PCR扩增，得到564 bp的序列（GenBank登录号：OQ940536），在GenBank上进行BLAST比对分析，与苍耳叉丝单囊壳白粉菌Podosphaera xanthii（GenBank登录号：OQ729746.1）的ITS序列同源性达100%，经离体叶片接种法，筛选出赤水凤仙花、大叶凤仙花2份免疫材料；棒凤仙花、白花凤仙花等10份高抗材料；滇水金凤、新几内亚凤仙花等3份感病材料和茶花凤仙花1份高感材料。 结论 昆明地区的凤仙花白粉病病原菌为苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii，筛选出赤水凤仙花、大叶凤仙花2份免疫种质资源，棒凤仙花、白花凤仙花等10份高抗种质资源，为筛选凤仙花抗白粉病基因及培育抗白粉病凤仙花新品种奠定了基础。

Abstract

Objective To clarify the pathogenic species of Impatiens powdery mildew and the resistance of Impatiens germplasm resources to powdery mildew. Method The diseased leaves of I.balsamina，used as test material in this study，and the morphological and molecular biology of the isolated and purified fungi of the Impatiens powdery mildew pathogen were carried out，and the resistance evaluation of 19 species of Impatiens germplasm resources was studied using the in vitro leaf inoculation method. Result The conidia of the pathogen were oval，measuring 24~32 μm×17~23 μm，and all of them contained fibrous bodies; the conidiophores were slightly curved，measuring 18~24 μm×88~97 μm.The symptoms of artificially inoculated leaves with pathogenic bacteria were similar to those of naturally infected leaves.The ITS sequence of the pathogenic fungus was amplified by PCR to obtain a 564 bp sequence (GenBank accession number: OQ940536)，which was compared and analyzed by BLAST on GenBank.The ITS sequence homology was 100%.Based on the result of in vitro leaf inoculation，2 immune materials including I.chishuiensis and I.apalophylla were acquired; 10 highly resistant materials such as I.clavigera and I.wilsonii; 3 susceptible materials such as I.uliginosa and I.hawkeri; and 1 highly sensitive material of I.balsamina were obtained. Conclusion The research clarified the pathogenic fungus of Impatiens powdery mildew in the Kunming and screened the germplasm resources of Impatiens with high resistance to powdery mildew，which laid the foundation for screening powdery mildew resistant genes and breeding new varieties with powdery mildew resistance.

Graphical abstract

关键词

凤仙花 / 白粉病 / 病原鉴定 / 分子系统发育 / 抗性鉴定

Key words

Impatiens / powdery mildew / pathogen identification / molecular phylogeny / identification of resistance

凤仙花（Impatiens sp.）为凤仙花科（Balsaminaceae）凤仙花属（Impatiens）一年生或多年生植物，花色丰富，花形秀丽，在我国大部分地区均有分布。凤仙花是世界上最畅销的花坛花卉之一^［1］，全世界有1 000余种，主要分布在亚洲热带、亚热带及非洲地区，中国凤仙花属植物有240余种^［2］，主要集中分布于西南部和西北部地区，以云南、四川、贵州和西藏的种类最多^［3］。凤仙花属植物通常以具有两侧对称花和花色多样化为主要特征，被誉为“兰花的双子叶姊妹” ^［4］。白粉病是一种常见且广泛分布的真菌病害，由许多不同种类的真菌引起的^［5］，该病害可通过叶面白色粉状真菌结构区分^［6-7］。凤仙花易感染白粉病，病害流行季节可造成植株叶片褪绿，甚至坏死和变脆，从而影响花卉的产量和观赏价值^［8］。白粉病的防治以化学药剂为主，但真菌易产生抗性，导致化学防治效果较差^［9］，因此培育抗病品种成为防治白粉病的最佳选择。我国凤仙花资源极为丰富，目前关于凤仙花白粉病鉴定和抗病种质资源筛选的研究报道极少。

目前，国内外关于凤仙花白粉病的病原主要有3个属：拟粉孢属Oidiopsis、粉孢属Oidium、单囊壳属Podsphaera，主要病原菌有P.xanthii、P.balsaminae、Oidium balsaminae以及Oidiopsis haplophylli^［10-13］。本研究通过对云南省昆明市西南林业大学树木园凤仙花白粉病病原菌分离纯化、形态学观察、致病性检测和rDNA-ITS 序列系统发育分析，确定其分类地位；并采用离体叶片接种法对19种凤仙花种质资源进行抗性评价，筛选出高抗种质资源，为凤仙花白粉病的抗病基因挖掘及培育抗白粉病新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：2022年7月于云南省昆明市西南林业大学树木园温室采集具有典型凤仙花白粉病症状的凤仙花病叶。致病性试验使用茶花凤仙花（I.balsamina），待长至4片真叶时供试。19种供试凤仙花分别为新几内亚凤仙花（I.hawkeri）、那坡凤仙花（I.napoensis）、凭祥凤仙花（I.pingxiangensis）、赤水凤仙花（I.chishuiensis）、龙州凤仙花（I.morsei）、红纹凤仙花（I.rubrostriata）、滇水金凤（I.uliginosa）、峨眉凤仙花（I.omeiana）、白花凤仙花（I.wilsonii）、水凤仙花（I.aquatilis）、锐齿凤仙花（I.arguta）、菱叶凤仙花（I.rhombifolia）、块节凤仙花（I.piufanensis）、茶花凤仙花（I.balsamina）、黄金凤（I.siculifer）、绿萼凤仙花（I.chlorosepala）、棒凤仙花（I.clavigera）、金平凤仙花（I.jinpingensis）、大叶凤仙花（I.apalophylla），均由西南林业大学园林园艺花卉研发中心黄海泉教授课题组提供。

健康凤仙花植株：试验前先对种子进行消毒，用脱脂纱布将种子包好，每包50粒，将其放在2% NaClO溶液中浸泡15 min消毒后，取出并用纯净水清洗纱布多遍，直至洗净，再将凤仙花种子从纱布中取出放置在灭菌的培养皿中，自然晾干。播种于装有灭菌土的营养钵中，每1个钵内播种1粒种子。

1.2 方法

1.2.1 凤仙花白粉病田间观测

2022年6、8、10月分别对西南林业大学树木园19种凤仙花进行田间观察，每种凤仙花随机选取5株，对每株上部10片叶片的白粉病发病情况进行调查及观察凤仙花植株发病症状。病情分级参照邓丽君^［14］的方法，略有调整：0 级：叶片无病症；1 级：病斑面积占整个叶片面积的 5%以下；3 级：病斑面积占整个叶片面积的5.1%~10%；5 级：病斑面积占整个叶片面积的10.1%~25%；7 级：病斑面积占整个叶片面积的 25.1%~50%；9 级：病斑面积占整个叶片面积50%以上。感病程度分级对应感病指数如下：当DI=0，为免疫；当0<DI≤10，为高抗；当10<DI≤20，为抗病；当20<DI≤50，为易感；当DI>50，为高感。调查前1个月未使用任何农药及预防措施。

病情指数（DI，%）=∑（各级病叶数×各级代表值）/（调查总病叶数×9）×100%

1.2.2 凤仙花白粉病病原菌分离纯化

采集云南省昆明市西南林业大学树木园大棚内自然发病凤仙花叶片，用灭菌刷子刷取叶片上单菌落于无菌水中，配置浓度为2.5×10⁵~5.0×10⁵个/mL孢子悬浮液，采用喷雾法接种于健康凤仙花幼苗植株叶片上。待叶片发病，再次从单菌落上分离白粉病病原菌。将发病凤仙花上的白粉病接种到健康幼苗上使其发病视为1次纯化过程。经过3次分离纯化后，活体保存于凤仙花植株上，用于后续试验。

1.2.3 凤仙花白粉病病原菌形态观察

采用粘贴法观察病原菌形态特征。用透明胶带粘取纯化后的白粉病病原菌，采用无菌水悬浮，制作5个玻片，每个玻片取3个视野，在光学显微镜下观察病原菌分生孢子和分生孢子梗的大小及形态，并测量相关数据。再滴加3%KOH溶液观察是否存在纤维状体。

1.2.4 凤仙花白粉病病原菌致病性测定

按照柯赫法则利用喷雾法进行白粉菌回接试验，检验白粉病病原菌致病性。取1.2.2纯化凤仙花白粉病菌配置浓度为2.5×10⁵~5.0×10⁵个/mL孢子悬浮液。当植株长至4片真叶时，取5株幼苗喷施孢子悬浮液10 mL于凤仙花叶片上，5株喷施等量无菌水为对照。发病后观察其病症，与自然发病的形态特征进行比较，确定其致病性。

1.2.5 白粉病病原菌分子鉴定

用灭菌毛刷刷取凤仙花叶面单菌落0.1 g收集于1.5 mL离心管中。采用试剂盒法提取病原菌DNA。采用真菌核糖体ITS区段通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′）进行PCR扩增。PCR体系为25 μL反应体系：DNA 1 μL、上下游引物各1 μL、2×Taq PCR Mix 12.5 μL、ddH₂O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，共55个循环；72 ℃延伸30 s，总延伸10 min。取5 μL PCR产物，核酸染料染色，1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过琼脂糖凝胶成像系统观察成像结果。将PCR产物送至生工生物工程（上海）有限公司正反双向测序。测序后的结果在NCBI的GenBank核酸数据库中进行 BLAST，获得与该序列同源性较高的 ITS区序列，同时通过查阅资料，下载亲缘性相近的已知菌株的 ITS 序列和已报道的能引起凤仙花属植物白粉病的病菌 ITS 区序列，用Mega 11.0软件的邻接法构建系统发育树。

1.2.6 凤仙花种质资源白粉病抗性鉴定

采用离体叶片接种法利用1.2.2纯化白粉病菌对19种凤仙花种质资源进行抗病性鉴定。在超净工作台内，用灭菌刀片把叶片裁成约1.5 cm的叶碟，然后将消毒后叶碟放入平板培养基中。每种凤仙花处理10个叶碟，3次重复，用移液枪取10 μL配置好的孢子悬浮液接种于叶碟正面中心。用封口膜封住培养皿边口后，放入培养箱，在白天26 ℃，晚上20 ℃、湿度70%、12 h光暗交替的条件下培养。

接种5 d后开始观察记录，在12 d充分发病后调查发病率和病情指数：

发病率（%）=发病叶片数/调查总叶片数×100%

病情指数（DI，%）=∑（各级叶盘数×各级代表值）/（调查总叶盘数×最高级代表值）×100%

病情分级标准参考邓丽君等^［14］的方法，略有调整：0级，叶片无病斑；1级，病斑上有淡薄菌丝层，不产生孢子；2级，叶片上出现白色斑点，直径小于0.5 cm，产生一定量的孢子；3级，叶片上白色斑点成粉状，直径0.5~1.0 cm，产孢子量较多；4级，叶片上的病斑全部成粉状，直径1.1~1.5 cm，产生大量孢子。

根据病情指数的大小将凤仙花对白粉病的抗性分为5个级别：当DI=0，为免疫；当0<DI≤10，为高抗；当10<DI≤20，为抗病；当 20<DI≤50，为易感；当DI>50，为高感。

1.3 数据分析

利用Excel 2010进行数据统计，SPSS 27.0软件采用单因素ANOVA 对多组样本进行分析处理，Duncan’s新复极差法进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 凤仙花白粉病田间症状

凤仙花白粉病多发于成熟叶片、叶柄，花果也易受害。发病初期，叶片正面出现白色粉状霉点，叶片发病部位出现褪绿病斑。粉状霉点是病原菌的菌丝、分生孢子及分生孢子梗，起初分布稀疏，之后菌丝放射状生长，相邻病斑相互融合，形成不规则形菌丝层并大面积覆盖叶片。发病末期叶片扭曲变形或枯黄皱缩，甚至坏死和变脆，但不脱落；病株发育不良且矮化（图1）。

2.2 凤仙花白粉病病原菌形态特征观察

通过对凤仙花白粉病病原菌镜检，观察到分生孢子、纤维体和分生孢子梗。分生孢子呈椭圆形、长椭圆形，大小为24~32 μm×17~23 μm，分生孢子内均含纤维体（图2-A）。分生孢子梗稍弯曲，无分支，由桶形或长椭圆形孢子串生形成，大小为18~24 μm×88~97 μm（图2-B）。未观察到白粉菌闭囊壳。根据形态学特征，初步鉴定引起凤仙花白粉病的病原菌是苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii。

2.3 凤仙花白粉病病原菌的致病性

将配制好的白粉病病原菌孢子悬浮液用喷雾法接种健康凤仙花叶片，4 d后叶片开始发病，叶面出现白色粉状斑点，9 d后凤仙花植株出现不同程度的发病症状，与自然发病状态一致，对照组无病症（图3）。挑取病斑上的白粉，经镜检发病植株白粉病病原菌形态特征与自然发病植株病原菌形态特征相同，鉴定其为引起凤仙花白粉病的病原菌。

2.4 凤仙花白粉病病原菌分子鉴定

用ITS4和ITS5通用引物对凤仙花白粉病菌总 DNA进行扩增，并对扩增产物进行测序，获得564 bp的DNA片段（图4），菌株命名为KMIB1（GenBank登录号为：OQ940536），将测序后的结果在NCBI的GenBank核酸数据库中进行BLAST比对，结果显示与已登录的来自土耳其秋葵的苍耳叉丝单囊壳白粉菌（P.xanthii 登录号：OQ729746.1）同源性达100%，而与报道寄生于凤仙花属植物上的鞑靼内丝白粉菌（Leveillula.taurica 登录号：MW242719.1、MW242703.1）序列距离较远，与其他单囊壳白粉菌属处于不同的分支上（图5）。由此进一步证明，引起昆明市地区凤仙花白粉病的病原菌是苍耳叉丝单囊壳白粉菌（P.xanthii）。

2.5 凤仙花抗白粉病种质资源的筛选

由表1可知，凤仙花白粉病病原菌在19种凤仙花上的致病性差异显著，其中赤水凤仙花和大叶凤仙花病情指数为0；病情指数最高的种是凤仙花，为55.83。根据抗性评价标准，可将供试的19个种分为免疫、高抗、抗病、感病和高感共5类：其中免疫种2个，占供试种的比例为10.52%，分别为赤水凤仙花和大叶凤仙花；高抗种10个，占供试种的比例为52.63%，分别为块节凤仙花、棒凤仙花等；抗病种4个，占供试种的比例为21.05%，分别为龙州凤仙花和绿萼凤仙花等；感病种3个，占供试种的比例为15.79%，分别为滇水金凤、新几内亚凤仙花等；高感种1个，占供试种的比例为 5.26%，仅为茶花凤仙花。不同抗性凤仙花接种白粉病菌叶盘发病存在较大差异（图6）。

3 讨论

国内外对于凤仙花属植物白粉病病原的研究结果存在一定的差异，其主要病原有4种，即苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii、凤仙花叉丝单囊壳白粉菌P.balsaminae、凤仙花粉孢菌Oidium.balsaminae和鞑靼内丝白粉菌L.taurica^［10-13］，不同种之间在形态特征上存在明显差异。臧全宇^［15］通过分生孢子有无纤维体区分P.xanthii（有纤维体）和Erysiphe cucurbitacearum（无纤维体），将杭州甜瓜白粉病鉴定为苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii。本研究观察凤仙花白粉菌形态，分生孢子呈广椭圆形，内含纤维状体，其形态与司修洋等^［16］报道的小天蓝绣球白粉菌和李茸梅等^［17］报道的小豆白粉菌形态一致，初步鉴定其为苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii。由于真菌 ITS 序列具有种内保守性强、种间存在变异的特点，因此，通过设计引物比对分析可快速有效鉴定真菌的种属信息。王晓敏等^［18］采集宁夏地区西瓜、甜瓜白粉病病原菌，通过ITS序列分析，鉴定出该地区的瓜类白粉菌为苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii。本研究中凤仙花白粉病病原菌经ITS序列分析比对，与已登录的来自土耳其秋葵的苍耳叉丝单囊壳白粉菌（P.xanthii 登录号：OQ729746.1）同源性达100%，进一步验证了昆明地区凤仙花白粉病病原菌为苍耳叉丝单囊壳白粉菌P.xanthii，这与Zhu等^［13］鉴定的引起河南新乡凤仙花白粉病的病原一致，但与Wolcan^［10］在新几内亚凤仙花和茶花凤仙花中鉴定的凤仙花叉丝单囊壳白粉菌P.balsaminae研究结果不同。然而，来自凤仙花与其他瓜类、豆类寄主上的白粉菌致病性是否相同以及是否能相互感染，有待进一步验证。

抗病材料和感病材料可分别用于植物的抗病和致病机制研究，而且抗病材料还可用于植物抗病育种^［19］。种植抗病品种是防治凤仙花白粉病最经济、有效的措施，国内对凤仙花白粉病鲜有研究，也没有不同凤仙花种质资源对白粉病抗性的相关报道。因此对凤仙花种质资源进行抗性评价，挖掘不同种质所蕴含的基因信息，为白粉病抗病品系选育提供材料。选择合理的接种方法是种质资源抗性鉴定和筛选的基础^［20］。离体叶片接种法鉴定抗病性，具有活体接种不具备的优点，如不易受污染，无需隔离设备，不受试验条件限制等，且已在甜瓜、八角等植物的病原菌生理小种鉴别、抗性鉴定和抗病品种筛选等研究中广泛应用^{［15，21］}。贾静怡等^［22］利用离体叶片接种法对11份葡萄种质资源进行鉴定，筛选出1份高抗材料和7份高感材料。本研究采用离体叶片接种法鉴定19种凤仙花对白粉病的抗病性，筛选出2份免疫材料，10份高抗材料，3份感病材料和1份高感材料。同时结合田间观察，离体叶片接种结果与田间观察结果基本一致，证明离体叶片接种法对于凤仙花白粉病抗性鉴定是可行的。19种凤仙花中高抗以上材料占63.15%，为筛选凤仙花抗白粉病种质资源、抗病基因的挖掘以及抗病新品种的创制提供了一定的基础数据和理论依据。本研究发现不同凤仙花对白粉病的抗感性与其叶片外部形态特征存在一定的相关性，其中12个高抗及免疫种凤仙花叶片多为革质或密生绒毛，而感病种凤仙花叶片多为纸质，初步推测凤仙花对白粉病的抗性可能与叶片蜡质含量、组织结构有关，其具体机理还需进一步深入探究。

4 结论

昆明地区凤仙花白粉病病原菌为苍耳叉丝单囊壳白粉菌。筛选出赤水凤仙花、大叶凤仙花2份免疫种质资源，棒凤仙花、白花凤仙花等10份高抗种质资源，滇水金凤、新几内亚凤仙花等3份感病种质资源和茶花凤仙花1份高感种质资源。筛选出12种具有育种潜力的抗白粉病凤仙花，为凤仙花抗病育种研究提供重要抗源材料。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32060364)

国家自然科学基金项目(32060366)

云南省重大科技专项(202102AE090052)

云南省园林植物遗传改良与高效繁育博士生导师团队建设项目(503210103)