解磷菌株P34对娃娃菜生长及土壤环境的影响

Effect of phosphate-degrading bacterial strain P34 on growth and soil environment of baby Chinese cabbage

摘要

目的 以娃娃菜（baby Chinese cabbage）作为研究对象，研究解磷菌株P34对蔬菜作物生长发育以及植株根际土壤微生态环境的影响，以评估该菌株的应用价值。 方法 设计双因素试验（因素A为解磷菌，因素B为营养液磷元素），测定娃娃菜植株生长指标、基质理化性状指标和微生物数量的变化。 结果 该菌株对娃娃菜幼苗生长具有显著的促生作用，其作用效应与基质磷元素含量水平相关。解磷菌处理，提高了基质速效磷、碱解氮、速效钾含量和基质酶活性；同时使基质中可培养细菌数量增加，可培养真菌数量下降。与对照A₀B₀（基质不添加磷元素和菌液）相比，处理A₁B₀（D值为1的菌液与无磷霍格兰营养液配施）速效磷含量显著提高，处理A₂B₀（D值为1.5的菌液与无磷霍格兰营养液配施）土壤磷酸酶活性在各处理中最高，分别比A₀B₀显著增加了225%和14.73%。主成分分析表明，A₁B₁（D值为1的菌液与含磷50%霍格兰营养液配施）处理的植株生长和土壤养分变化指标的综合评价评分第1。 结论 解磷菌株P34处理可有效提高土壤肥力水平，促进植物生长发育，具有重要的应用价值。

Abstract

Objective Using baby Chinese cabbage as a research object,the effects of phosphate-solubilizing bacterial strain P34 on the growth and development of vegetable crops and the micro-ecological environment of the plant rhizosphere soil were studied to evaluate the application value of this strain. Method A two-factor experiment was designed to determine the changes in plant growth indicators，substrate physical and chemical properties，and microbial biomass of baby cabbage，using factor A as the phosphorus dissolving bacteria and factor B as the phosphorus element in the nutrient solution. Result This strain has a significant growth-promoting effect on baby cabbage seedlings，and its effect is related to the level of phosphorus in the substrate.Treatment with phosphate-solubilizing bacteria increased the levels of available phosphorus，alkaline nitrogen，available potassium and substrate enzyme activity in the substrate; at the same time，the number of cultivable bacteria in the substrate increased，while the number of cultivable fungi decreased.Compared to control A₀B₀ (no addition of phosphorus elements and bacterial solution to the substrate)，the available phosphorus content of treatment A₁B₀ (combined application of bacterial solution with an D value of 1 and phosphorus-free Hoagland nutrient solution) was significantly increased.The soil phosphatase activity of treatment A₂B₀ (combined application of bacterial solution with an D value of 1.5 and phosphorus-free Hoagland nutrient solution) was the highest among all treatments，significantly increasing by 225% and 14.73%，respectively.Principal component analysis showed that the comprehensive evaluation score of plant growth and soil nutrient changes in A₁B₁ (bacterial solution with D=1 and 50% phosphorus containing Hoagland nutrient solution) ranked first. Conclusion The phosphate solubilizing bacteria strain P34 can effectively improve soil fertility and promote plant growth，and it has important application value in crop production.

Graphical abstract

关键词

娃娃菜 / 解磷菌 / 根际土壤 / 促生作用 / 土壤微生态

Key words

baby Chinese cabbage / phosphate dissolving bacteria / rhizosphere soil / growth promoting effect / soil microecology

蔬菜绿色栽培是提高蔬菜作物产量与质量的根本途径。应用根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）及其代谢产物控制植物病害，促进植物生长，保护土壤不受污染，是蔬菜绿色栽培技术研究的热点。众多PGPR成员中，是极具潜力的益生细菌，解磷菌是一类可以把土壤中不溶性或难溶性的磷元素转化为作物可以直接利用的磷元素的功能微生物^［1］，该功能微生物通过分泌各类有机酸和无机酸或酶类造成酸性环境，活化不溶性或难溶性磷，提高作物对磷元素的转化和吸收，最终提高土壤养分利用率，从而促进作物生长^［2-5］。

我国北方的钙质土壤的总磷含量较高^［6］。但是，土壤中大量的磷元素是植物难以吸收的不溶性磷酸盐^［7-8］。为提高农业生产中作物对磷的有效吸收，生产中大量使用磷肥，但作物对磷肥的转化吸收效率低，一般只有5.0%~25.0%^［9-10］，其中绝大部分变成了无效磷累积在土壤中^［11］，造成环境污染，土壤质量降低。笔者所在课题组以卵磷脂为唯一磷源的选择性培养基，从百合根际土壤中筛选分离出一株解磷量最高（45.38 μg/mL）的菌株P34（土地类芽孢杆菌 Paenibacillus terrae），并且发现其可以在根际土壤中很好的定殖，对娃娃菜有一定的促生作用^［12］。将其应用于蔬菜生产，以降低化肥，尤其是磷肥施用量，因此对于蔬菜绿色生产技术提升具有重要价值。

土壤微生物对于土壤理化性状的变化十分敏感，解磷菌的解磷作用与土壤磷素水平紧密相关^［13］。笔者所在课题组前期关于该解磷菌株P34对于娃娃菜的促生验证试验仅在一种磷素水平下进行（利用一种商品基质处理，基质养分完全，磷素供应充足）^［12］。然而在实际应用中，土壤的磷素水平差别很大，因此研究不同磷素水平条件下解磷菌的解磷效果和对作物的促生作用是评估该菌株应用价值的重要内容。娃娃菜是小株型结球大白菜，是甘肃省最重要的高原夏菜种类之一，生育期短，生长过程中对磷元素需求量高^［14］。基于上述研究背景，本研究选择娃娃菜作为研究对象，设计了双因素（解磷菌浓度与基质磷素含量）试验，研究不同磷素供应水平条件下，解磷菌株P34对植株生长发育以及基质理化性状的影响，以期评估该益生菌在蔬菜栽培中的功能作用，为该益生菌作为微生物菌剂的开发应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

选用皇妃娃娃菜为试验材料，由甘肃省农科院蔬菜研究所提供。

解磷菌P34菌株土地类芽孢杆菌（Paenibacillus terrae），由本课题组从兰州百合根际土壤中筛选分离出，保存于甘肃农业大学园艺学院蔬菜生理实验室。

1.2 试验设计与处理方法

本研究设计双因素试验，研究不同磷素水平下，解磷菌对娃娃菜幼苗的促生作用。具体为：因素A为解磷菌，设置3个浓度水平，通过调整菌液D值实现，分别为A₀（无解磷菌），A₁（解磷菌，D值=1），A₂（解磷菌，D值=1.5）；因素B为营养液磷元素，设置3个浓度水平，通过调整霍格兰营养液中磷元素浓度实现：B₀（不含磷元素的霍格兰营养液），B₁（50%磷元素的霍格兰营养液），B₂（100%磷元素的霍格兰营养液）。试验共设9个处理，每处理35株，3次重复。

解磷菌菌液制备方法：制备LB液体培养基，将P34菌株接种在培养基中，37 ℃，180 r/min过夜培养，取出培养好的发酵液，11 000 r/min，5 min离心，倾倒上清液，随后用无菌水震荡混匀，用紫外可见分光光度计测定D₆₀₀值，制备成D₆₀₀=1（细菌数量2×10⁹ cfu/mL）的菌悬液，留作备用。D₆₀₀=1.5（细菌数量3×10⁹ cfu/mL）的菌悬液以同样的方法获得。

植株处理方法：娃娃菜种子温汤浸种处理后，穴盘育苗（72穴盘，商品育苗基质处理）。待幼苗两叶一心时，移栽于营养钵（10 cm×10 cm）中进行基质栽培（泥炭与蛭石体积比2∶1）。移栽10 d后开始第一次处理：浇灌不同浓度的菌液（每株 10 mL）和不同磷素水平的霍格兰营养液（每株40 mL）于根部周围，之后每7 d浇灌1次，共浇灌3次，其余时间采用常规管理。

1.3 植株生长量指标测定

测定娃娃菜地上和地下部分的鲜质量与干质量。将植株从根颈部位切断，用百分之一电子天平分别称量植株地上部和地下部鲜质量与干质量。测定时间为幼苗移栽40 d（第3次菌液处理处理10 d后）进行。

1.4 基质理化性状与生物学性状指标的测定

土样采集：挖出植株根系并轻轻摇晃植物根部，抖落附属的基质，戴无菌手套将落下的基质作为根际土收集在无菌样本袋中。每处理随机选择5株进行测定。土样采集时间为幼苗移栽40 d（第3次菌液处理处理10 d后）进行。

碱解氮、速效钾、速效磷分别采用碱解扩散法、1.0 mol/L醋酸铵浸提-火焰光度法、0.5 mol/L碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法；用pH仪按V_水∶V_土=5：1测定土壤pH；上海雷磁电导率仪DDS-307A测定土壤电导率^［15-16］。参照韩艳洁等^［17］的研究方法测定土壤酶活性，脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定；过氧化氢酶活性用采用高锰酸钾滴定法测定；蔗糖酶活性通过3，5-二硝基水杨酸比色法测定；碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色的方法进行测定。细菌采用的是牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用的是马丁氏培养基，放线菌采用改良高氏1号培养基^［18］。采用稀释涂布平板法测真菌、细菌和放线菌的数量。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析和主成分分析，采用Duncan法进行数据的多重比较；使用Microsoft Excel 2010软件进行原始数据的处理以及绘制图、表。

采用极差法将娃娃菜生长发育和土壤养分的值标准化^［19］，再采用主成分分析法^［20］，对解磷菌处理下娃娃菜生长发育和土壤养分进行综合评价，获得的各指标的贡献率确定各综合指标的权重，并采用加权单因子法将各指标叠加，获得各处理下娃娃菜生长发育和土壤养分变化的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 解磷菌对娃娃菜苗期生长的影响

解磷菌处理对植株生长有显著影响，可以促进植株生长量的增加，其作用效应与基质中磷元素含量水平相关。由表1可知，A因素（解磷菌）对地下部分鲜质量，地上部干质量、地下部干质量，B因素（磷元素浓度）对地上部分鲜质量、地下部干质量均产生显著影响（P<0.05）。且对于地上、地下部干（鲜）A因素与B因素之间存在显著的互作效应（P<0.05）。

由表2可知，所有处理中，地上部分鲜质量除A₁B₁、A₀B₂、A₁B₂、A₂B₂外，各处理与A₀B₀差异均不显著（P>0.05）；A₁B₁、A₀B₂、A₁B₂、A₂B₂分别较A₀B₀提高45.11% 、50.05%、35.34%、39.19%（P<0.05）。地下部鲜质量以A₁B₁最大，显著高于A₀B₀、A₂B₀、A₀B₁、A₂B₁处理，较A₀B₀显著提高68.25%（P<0.05）。地上部分干质量A₁B₁处理与A₀B₂、A₁B₂、A₂B₂间差异不显著（P>0.05），与A₀B₀、A₁B₀、A₂B₀、A₂B₁之间差异显著；A₁B₁较A₀B₀相比提高48.72%（P<0.05）。地下部干质量以A₀B₂最大，较A₀B₀相比显著提高186.36%（P<0.05）。

2.2 解磷菌对娃娃菜基质理化性质的影响

解磷菌处理对娃娃菜苗期基质中pH、EC、碱解氮、速效磷和速效钾5项指标均有显著影响，可以改善基质养分状况，而且其作用效应与基质中磷元素含量水平相关。由表3可知，A因素对pH、EC、碱解氮、速效磷4项指标有显著影响；B因素对pH、EC、碱解氮、速效磷、速效钾均有显著影响；且A因素与B因素之间对各指标均存在显著的互作效应（P<0.05）。

进一步分析表明，A因素与B因素对基质理化性质还呈现一定的浓度效应：pH、碱解氮在A₁水平显著高于A因素各水平，EC、速效磷在A₂水平显著高于A因素各水平；碱解氮、速效钾B₁水平显著高于B因素各水平，pH和EC值分别在B₀、B₁和B₀水平显著高于B因素各水平（P<0.05）。

由表4可知，A₁B₁处理下pH值显著高于其他处理，与A₀B₀处理相比提高2.3%，处理A₀B₂最小；A₂B₀处理下EC值显著高于其他处理，与A₀B₀处理相比提高了58.1%（P<0.05），处理A₀B₁最小；A₁B₁处理下碱解氮含量最高，与A₁B₀处理无显著差异，但显著高于其他各处理，较A₀B₀分别提高了133.34%、109.51%（P<0.05）；A₁B₀处理速效磷含量显著高于其他处理，比最小处理 A₀B₀提高了225%（P<0.05）；A₂B₁处理下速效钾显著高于其他处理，与A₀B₀相比提高20.96%（P<0.05），处理A₂B₂最小。

2.3 解磷菌对娃娃菜基质酶活性的影响

解磷菌处理对娃娃菜苗期基质中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶均有显著影响，可以改善基质养分状况，而且其作用效应与基质中磷元素含量水平相关。由表5可知，A与B因素之间互作效应均对蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶等指标有显著影响（P<0.05）。A因素与B因素对酶活性呈现一定的浓度效应：脲酶A₁水平显著高于A因素各水平，蔗糖酶、磷酸酶、过氧化氢酶A₂水平显著高于A因素各水平，脲酶、磷酸酶B₁水平显著高于B因素各水平，蔗糖酶、过氧化氢酶分别在B₁、B₂和B₀、B₂水平显著高于B因素各水平（P<0.05）。

各处理多重比较结果表明，A₂B₀和A₂B₁处理蔗糖酶活性显著高于其他处理，分别比A₀B₀提高81.03%、87.4%（P<0.05），处理A₀B₁活性最小；A₀B₁、A₁B₁、A₁B₂处理下脲酶活性显著高于其他处理，与处理A₀B₀相比分别提高了40.87%、39.46%、43.41%（P<0.05）；A₂B₀处理下磷酸酶活性显著高于A₁B₂外的其他处理，比A₀B₀显著提高14.73%（P<0.05），处理A₁B₀酶活性最小；A₂B₀、A₂B₁处理过氧化氢酶活性显著高于其他处理，分别比A₀B₀显著提高81.03%、87.43%（P<0.05），处理A₀B₁酶活性最小（图1）。

2.4 解磷菌处理对娃娃菜基质微生物的影响

解磷菌处理对娃娃菜幼苗基质中真菌、细菌和放线菌数量均有显著影响，而且其作用效应与基质中磷元素含量水平相关。由表6可知，A因素（解磷菌）对真菌数量有显著影响，B因素（磷元素浓度）对真菌、细菌、放线菌均产生显著促进作用（P<0.05）。且A因素和B因素之间对真菌、放线菌存在显著的互作响应（P<0.05）。进一步分析表明，A因素与B因素对微生物数量的增减呈现一定的浓度效应：真菌A₀水平显著高于A因素各水平，真菌 B₀水平显著高于B因素各水平，放线菌B₂水平显著高于B因素各水平（P<0.05）。

各处理多重比较结果表明，A₀B₀处理真菌数量显著高于其他处理，A₁B₂、A₂B₂处理最小，均比A₀B₀显著降低73.6%（P<0.05）；A₂B₀、A₂B₁处理下细菌数量显著高于除A₁B₀、A₂B₂外其他处理，且数量均为18×10^-5cfu/g，比A₀B₀处理显著提高了31.7%（P<0.05），处理A₀B₂细菌数量最少；A₂B₀、A₂B₁ 、A₂B₂处理下放线菌数量显著高于其他处理，分别比A₀B₀显著提高21.54%、21.54%、25.57%（P<0.05），处理A₁B₀放线菌数量最少（表7）。

2.5 解磷菌处理对幼苗生长指标和基质养分指标的综合评价

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是一种常用的统计分析方法，通过将多个指标转化为少数几个综合指标，从而表现不同施肥处理对娃娃菜生长发育指标的综合影响。由表8可知，前3个综合指标的主成分贡献率分别为40.383%、30.108%、25.248%，累计贡献率达95.739%。第1主成分主要包括地上部、地下部鲜质量、地上、地下部干质量、碱解氮、速效钾；第2主成分主要包括速效磷、速效钾；第3主成分为碱解氮、速效磷、速效钾。

对各主成分得分进行综合得分计算，获得各处理植株生长发育和土壤养分变化的综合评价值（表9）。综合得分值反映了不同处理对娃娃菜苗期发育的综合提升能力的大小，其数值越大表示处理效果越好。根据综合得分值大小判定不同处理对娃娃菜生长发育的综合提升能力由强到弱依次为：A₁B₁>A₀B₂ >A₂B₂ >A₁B₂ >A₁B₀ >A₀B₀ >A₂B₁ >A₀B₁ >A₂B₀。

3 讨论

本研究结果表明，解磷菌处理（A因素）对植株生长有显著影响，可以促进植株生长量的增加，其作用效应与基质中磷元素（B因素）含量水平相关，且A因素与B因素之间对植株的生长产生显著的互作效应（P<0.05）。本研究所测定的4个植株生长指标中，解磷菌处理（A因素）对地下部鲜质量，地上、地下干质量3个指标产生显著影响，磷元素处理（B因素）对地上部鲜质量、地下部干质量2个指标产生显著影响，且A因素与B因素之间互作效应在4个指标间差异显著。另外，本研究中，在100%磷元素的霍格兰营养液的条件下，加入不同量的解磷菌（A₁B₂，A₂B₂），蔬菜地上部分和地下部分鲜质量/干质量受到影响。但A₁B₂，A₂B₂处理间无显著差异（表3），同时，相应处理的基质磷素水平基本相当，二者差异也不显著。由此表明，高磷水平对于植株的生长影响并不显著。本研究主成分分析结果表明，A₁B₁处理的植株生长和土壤养分变化的综合评价评分第1。

解磷菌通过分泌各类有机酸和无机酸或酶类造成酸性环境，活化不溶性或难溶性磷，提高作物对磷元素的转化和吸收 ^［21-24］。本研究关于栽培基质磷素含量的测定结果为该解磷菌P34在栽培基质中的解磷作用提供了直接证据：基质中施入解磷菌P34后，基质速效磷含量与土壤磷酸酶的活性显著提高，而且具有显著的浓度效应（表3、表5）。因此增加了植株可利用磷素的供应量，提高了土壤肥力。另一方面，解磷菌也显著影响基质的其它理化性状与生物学性状，进而对植株根系生长环境产生了深刻的影响。在测定的12个指标中，A因素（解磷菌）对pH、EC、碱解氮、速效磷、速效钾、蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶、真菌等共10个指标的作用效果达到显著水平。综上分析表明，解磷菌P34的施入土壤，使得基质养分水平显著提高，肥力状况得到显著改善，这与杜雷等^［25］贺立虎等^［26］研究关于解磷菌能促进生菜和油菜生长，提高土壤肥力，改善土壤微生态环境的结果一致。

近年来，大量报道指出植物根际促生菌可以改变根际土壤中微生物结构和数量^［27］。土壤中可培养细菌数量与真菌数量比值（B/F）增大，可有效改善了根际土壤环境，提高土壤肥力^［28］。如黄文茂等^［29］，王其传等 ^［30］关于PGPR菌剂处理辣椒的研究，刘方春等^［31］关于PGPR菌剂处理冬枣的研究，对土壤中可培养微生物的数量的测定结果均得到类似结论。解磷菌是PGPR重要的功能微生物类型之一。本研究表明，解磷菌P34处理引起土壤可培养细菌数量显著增加，可培养真菌数量显著下降，二者比值（B/F）增大，使得基质的生物学性状得到了显著改善，提高了基质肥力水平。

本研究为双因素试验设计。方差分析结果显示，解磷菌株P34的解磷效应与基质中磷元素含量水平相关：在测定的16个指标中，A因素（解钾菌）与B因素（磷元素）对地上、下部分鲜质量、pH、EC、碱解氮、速效磷、速效钾、蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、过氧化氢酶、真菌数量、放线菌数量等共15个指标产生显著的互作效应（P<0.05）。如在磷元素不足条件下（磷素浓度为50%的霍格兰营养液处理），施用D=1（细菌数量2×10⁹cfu/mL）或D=1.5（3×10⁹cfu/mL）的菌液处理，均可以显著提高土壤蔗糖酶，脲酶，磷酸酶和过氧化氢酶。土壤酶主要来源于土壤中的各种植物、微生物以及土壤中的动物，它们不仅可以直接参与土壤中营养物质的转化和能量的代谢，其活性大小也是作为一种衡量土壤肥力的重要指标^［32-34］。另一方面，与A₀处理相比，A₁，A₂处理的基质EC值显著提高。上述结果均表明，该解磷菌P34的解鳞功能发挥对于土壤磷素水平十分敏感，解磷菌株P34的解磷效应与基质中磷元素含量水平相关。本研究结果表明，在无磷元素的霍格兰营养液的条件下 2个解磷菌处理（A₁B₀、A₂B₀），基质速效磷含比对照（A₀B₀）分别增加了3.25，2.86倍。由此表明，该解磷菌在土壤缺磷条件下将土壤中难溶性磷的转化为速效磷。该方面亦有文献支持：张强等研究表明，解磷菌B2和B67处理山西省典型缺磷土壤，可使土壤速效磷含量较CK增加1.35~3.04倍^［34］。另有研究资料表明：在土壤低磷水平下，解磷菌表现出更好的解磷效果^［35］。

然而，尽管笔者模拟研究了不同磷元素水平条件下该解磷菌的作用效果，从主成分分析结果来看，也不能充分解析不同磷素水平条件下该解磷菌发挥解磷作用的浓度效应。分析其原因，可能有两个，一方面与该菌株自身的特点有关：本研究中应用的P34菌株从兰州百合根际土壤中分离获得，该菌株除了具有解磷作用外，还具有拮抗镰刀菌的作用^［12］，因此该微生物可能对植物生长及土壤生态产生更为复杂的影响。另一方面：土壤速效磷含量仅反映土壤当时的磷素营养水平。在本试验体系中，将该指标与土壤及植物全磷含量的测定结果相结合，来判定解磷菌的作用效果，更为科学。然而，受研究时间限制，本试验未进行该部分研究。因此，未来尚需在明晰试验作物需肥规律、磷素吸收利用特点以及土壤全磷水平变化特点的基础上，细化磷素浓度梯度，做进一步深入研究。

4 结论

本研究结果表明，解磷菌株P34对娃娃菜幼苗生长具有显著的促生作用，其作用效应与基质中磷元素含量水平相关。且解磷菌处理（A因素）与基质中磷元素（B因素）之间对植株的生长具有显著的互作效应（P<0.05）。解磷菌P34，显著影响基质理化性状与生物学性状，提高了基质速效磷含量与土壤磷酸酶的活性，增加了植株可利用磷素的供应量，也显著增加基质速效钾和碱解氮含量，提高了基质养分水平；同时，使得基质培养细菌数量显著增加，基质可培养真菌数量显著下降，优化了基质的生物学性状。主成分分析结果表明A₁B₁对百合植株生长和土壤养分水平的提升能力最好。综上，解磷菌株P34处理可有效提高土壤肥力水平，促进植物生长发育，具有重要的应用价值。

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基金资助

甘肃省重点研发计划项目(22YF7NA108)

国家自然科学基金项目(31860549)

兰州市科技计划项目(2017-4-95)