灵芝提取物配伍姜黄素及大豆磷脂对化学性肝损伤大鼠的保护作用及机制分析

Protective effect and mechanism analysis of Ganoderma lucidum extract, curcumin and soy lecithin against chemical-induced liver injury in rats

摘要

目的 评价灵芝提取物（GLE）、姜黄素（CUR）配伍大豆磷脂（SL）对四氯化碳（CCl₄）诱导的大鼠急性肝损伤的保护作用。 方法 研究分两个阶段。组方筛选阶段评价GLE、CUR与SL的不同配伍效果；药效确认阶段考察优化方（GLE＋CUR及GLE＋SL＋CUR）的剂量效应关系。通过检测血清生化指标（ALT、AST、GSH、TBIL、DBIL）及肝组织病理学评价护肝效果，并利用DIA蛋白组学技术揭示高剂量GLE＋SL＋CUR组的分子机制。 结果 筛选实验显示，GLE＋CUR与GLE＋CUR＋SL组均能显著改善血清生化指标及肝组织损伤。药效确认实验证实，给药组能不同程度降低ALT、TBIL及DBIL水平，且肝组织修复呈明显量效关系。蛋白质组学共筛选出292个差异蛋白，主要富集于免疫反应、氧化应激等通路，关键蛋白如MPO、Hpx、Anxa2、Cyba表达显著改变。 结论 灵芝提取物、姜黄素配伍大豆磷脂对CCl₄致大鼠急性肝损伤具有一定保护作用，其机制可能与调节氧化应激及免疫炎症反应有关。

Abstract

Objective To evaluate the protective effects of Ganoderma lucidum extract (GLE) and curcumin (CUR) combined with soy lecithin (SL) against carbon tetrachloride (CCl₄)-induced acute liver injury in rats. Methods The study was conducted in two phases. First, screening phase: SD rats were randomly assigned to the normal, model, and various treatment groups. Following CCl₄ challenge (3% in oil), the serum levels of ALT, AST, and GSH were measured and the histopathological changes in liver tissue were observed. Second, efficacy validation and mechanism analysis: The combinations of GLE+CUR and GLE+CUR+SL were selected and administered at low, medium, and high doses. The serum levels of ALT, AST, GSH, TBIL, and DBIL were quantified, and liver pathology was assessed. Furthermore, DIA-based proteomics was employed to analyze the hepatic protein expression profiles in the normal, model, and high-dose GLE+CUR+SL groups. Results The preliminary screening indicated that both GLE+CUR and GLE+CUR+SL significantly ameliorated serum ALT, AST, and GSH levels while mitigating histopathological damages. In the validation phase, the treatment groups demonstrated varying degrees of reduction in ALT, TBIL, and DBIL levels, with hepatic tissue repair showing a clear dose-response relationship. Proteomic analyses identified 292 differentially expressed proteins (DEPs), primarily enriched in the pathways related to immune response and oxidative stress. The key proteins, including MPO, Hpx, Anxa2 and Cyba, exhibited significant changes in expression. Conclusion The combination of GLE and CUR with SL exerts a protective effect against CCl₄-induced acute liver injury in rats, whose underlying mechanism may be related to the regulation of oxidative stress and immune-inflammatory responses.

Graphical abstract

关键词

灵芝提取物 / 姜黄素 / 大豆磷脂 / 配伍 / 四氯化碳 / 肝损伤 / 氧化应激 / 炎症反应

Key words

Ganoderma lucidum extract / curcumin / soy lecithin / compatibility / carbon tetrachloride / liver injury / oxidative stress / inflammatory response

化学性肝损伤多由于长期或过量接触环境毒物、酒精及药物（如对乙酰氨基酚、抗结核药等）可引发的肝组织病理损害，已成为全球性的公共卫生问题^[1-2]。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl₄）诱导的大鼠急性肝损伤是评价保肝药物及功能食品药效的经典模型，其机制与自由基引发的脂质过氧化、线粒体功能障碍、炎症及细胞凋亡密切相关^[3-4]。目前，临床常用还原性谷胱甘肽、甘草酸制剂、水飞蓟素等保肝药物治疗^[5-6]。然而，长期使用可能增加肾脏代谢负担或产生耐药性，且单一成分难以兼顾肝损伤的多重病理环节。因此，寻找高效、低毒、具备多靶点协同作用的天然活性成分复方已成为功能食品研发领域的热点。

灵芝（ganoderma lucidum，GL）与姜黄素（curcumin，CUR）均是典型的药食同源中药。灵芝三萜与多糖通过调节免疫和清除自由基发挥护肝作用^[7-8]；CUR具有极强的清除自由基和抗炎能力^[9]。但研究^[10]发现，CUR存在亲水性差、代谢快、生物利用度低的问题，限制了其在复方中的药效发挥。大豆磷脂（soy lecithin，SL）具有修复受损的肝细胞膜、促进肝细胞再生，改善脂质代谢的作用^[11-13]，其天然的表面活性还可构建微乳或磷脂复合物，显著提升CUR等脂溶性成分的溶解度与吸收率^[14]。

本研究拟首先通过组方筛选及药效确认实验，评价GLE、CUR、SL及其不同配伍方式对CCl₄致急性肝损伤的保护效果，明确其剂量效应关系；并结合DIA蛋白质组学方法，从分子层面揭示全方（GLE+SL+CUR）通过协同调控关键蛋白及代谢通路实现对肝脏的保护作用，旨在为开发具有高效护肝功能的复方保健食品提供科学依据与实验支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠96只，体质量180～220 g。购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（沪）2023-0009。饲养于上海中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK（沪）2020-0009。所有涉及的实验方案均通过上海中医药大学动物伦理委员会审核（伦理编号：PZSHUTCM2305310006）。实验动物均在标准无菌条件下饲养，温度20℃～25℃，湿度40%～60%，12 h灯光/12 h黑暗环境下适应1周，自由饮食。

1.1.2 药物与试剂

四氯化碳（CCl₄）（批号T29638389）购自上海吉至生化科技有限公司，橄榄油（批号O392383B9）购自上海吉至生化科技有限公司，大豆油（批号HK6F9150）购自上海源叶生物科技有限公司。造模剂CCl₄油溶液配制方式：溶剂为橄榄油，分别配制为2%、3%。大豆磷脂（批号20221214L）购自河北美业斯维生物科技有限公司，姜黄素（批号20220416）购自河南中大恒源，灵芝提取物（10%提取率）购自芜湖艾森格生物，原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（批号J01IR216504）购自上海源叶生物科技有限公司，谷丙转氨酶（ALT）（批号207953）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）（批号210041）、总胆红素（TBIL）（批号301126）、直接胆红素（DBIL）（批号303196）均购自富士胶片和光纯药株式会社。

1.1.3 主要仪器

日立7080生化分析仪，Thermo scientific Varioskan LUX酶标仪，OLYMPUSBX51正置显微镜，TDL-5-A低速离心机，DK-8A型电热恒温水槽。

1.2 方法

1.2.1 组方筛选实验

将48只SPF级雄性大鼠随机分成8组：正常组、模型组、GLE（0.067 g/kg）+CUR（10 mg/kg）组，GLE（0.067 g/kg）+SL（0.2 g/kg）组、GLE（0.067 g/kg）+SL（0.2 g/kg）+CUR（10 mg/kg）组，GLE（0.067 g/kg）组，CUR（10 mg/kg）组，SL（0.2 g/kg）组，每组6只。给药组每日灌胃对应组方油溶液5 mL/kg，正常组和模型组灌胃等体积大豆油溶液，连续35 d。第35天，除正常组外，其余各组一次性灌胃3% CCl₄油溶液5 mL/kg，制备急性肝损伤模型。造模4 h后，给药组给予相应受试样品。造模24 h后处死动物，收集样本。

1.2.2 药效学确认实验

将48只SPF级雄性大鼠随机分成8组：正常组、模型组、GLE（0.016 g/kg）+CUR（2.5 mg/kg）低剂量组，GLE（0.033 g/kg）+CUR（5 mg/kg）中剂量组，GLE（0.067 g/kg）+CUR（10 mg/kg）高剂量组，GLE（0.016 g/kg）+SL（0.05 g/kg）+CUR（2.5 mg/kg）低剂量组，GLE（0.033 g/kg）+SL（0.1 g/kg）+CUR（5 mg/kg）中剂量组，GLE（0.067 g/kg）+SL（0.2 g/kg）+CUR（10 mg/kg）高剂量组，每组6只。给药组每日灌胃对应组方油溶液5 mL/kg，正常组和模型组灌胃等体积大豆油溶液，连续30 d。第30天，除正常组外，其余各组一次性灌胃2% CCl₄油溶液5 mL/kg，制备急性肝损伤模型。造模4 h后，给药组给予相应受试样品。造模24 h后处死动物，收集样本。

1.2.3 血生化指标及抗氧化能力检测

大鼠麻醉，腹主动脉采血，血液经3 500 rpm/min离心15 min，取上层血清。用全自动血生化仪器或试剂盒说明书方法，检测ALT、AST、GSH、TBIL、DBIL水平。

1.2.4 肝组织病理学检查

取大鼠肝左叶组织，以4%多聚甲醛溶液固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋后，制成5 µm切片，进行H&E染色，于普通光学显微镜下观察肝组织病理变化。

1.2.5 蛋白质组学分析（DIA技术）

取药效确认实验中的正常组、模型组和GLE（0.067 g/kg）+SL（0.2 g/kg）+CUR（10 mg/kg）高剂量组大鼠肝脏组织，每组3只，进行蛋白提取、酶解及肽段标记。

1.2.5.1 蛋白提取与酶解

肝组织样本经裂解液（8 M尿素+1% SDS，含蛋白酶抑制剂）研磨、离心后，取上清进行蛋白定量。取100 μg蛋白，经还原、烷基化、丙酮沉淀等常规步骤处理后，使用胰蛋白酶（酶:蛋白=1:50）在37℃下进行过夜酶解，以供后续分析。

1.2.5.2 肽段脱盐及定量

酶解后的肽段经真空离心抽干，以0.1%三氟乙酸（TFA）复溶，并经HLB柱脱盐。再次抽干后，使用NanoDrop One进行紫外分光光度法定量。

1.2.5.3 DIA质谱检测

肽段样品经Vanquish Neo液相系统分离，色谱柱为uPAC High Throughput（75 μm×5.5 cm，Thermo，USA），流动相A为2%乙腈/0.1%甲酸，B为80%乙腈/0.1%甲酸，进行8 min梯度洗脱。洗脱液在线导入TIMSTOF_HT（Bruker，Germany）质谱仪，在DIA正离子模式下进行分析（离子源电压：1.5 kV；扫描范围：m/z 100-1 700）。数据采集使用Compass HyStar（Bruker，Germany）软件。

1.2.5.4 DIA数据分析

DIA原始数据于Spectronaut^TM19软件中分析。主要参数设置：肽段长度7-52，酶切试剂为trypsin/P（最大漏切位数2），固定修饰为羧甲基化（C），可变修饰为甲硫氨酸氧化和蛋白N端乙酰化。鉴定过滤标准为蛋白与肽段的FDR≤0.01，肽段可信度≥99%，提取离子色谱峰宽（XIC width）≤75 ppm。蛋白定量采用Max LFQ算法。

1.2.6 生信分析

所有数据均上传至美吉云平台进行分析。采用R语言t.test函数计算组间差异，筛选出满足P＜0.05且差异倍数（foldchange，FC）> 1.5的差异表达蛋白。利用GO（Gene Ontology）数据库和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库对差异蛋白分别进行功能注释与通路富集分析。通过STRING数据库（v11.5）构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析，采用GraphPad 9.0软件进行绘图。数据结果以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以LSD-t检验进行多重比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组方筛选实验结果

2.1.1　对大鼠血清中ALT、AST及GSH水平的影响 如图1。

2.1.2 对大鼠肝脏脏器系数的影响

如图2。

2.1.3 对大鼠肝组织病理损伤的影响

如图3。与模型组比较，GLE组、CUR组及SL组大鼠的肝细胞气球样变程度均有不同程度减轻，炎性浸润范围有所缩小，显示出单位组分具有一定的初步保护作用。其中，GLE+SL+CUR组大鼠肝小叶结构趋于完整，肝细胞气球样变数量明显减少，胞浆颜色变深，坏死灶及炎症反应显著缓解。

2.2 药效学确认实验结果

2.2.1 对大鼠血清生化指标及抗氧化能力的影响

如图4。

2.2.2 对大鼠肝脏组织脏器系数的影响

如图5。

2.2.3 对大鼠肝组织病理损伤的影响

如图6所示，与模型组相比，GLE+SL+CUR各剂量组对肝组织损伤的改善呈剂量依赖性。低剂量组肝细胞气球样变范围缩小；中剂量组肝组织损伤显著改善，炎性浸润范围明显局限，肝索排列趋于整齐；高剂量组肝组织结构与正常组最为接近。GLE+CUR组虽也能减轻肝组织损伤，但与同等或更高剂量的GLE+SL+CUR组相比，其残留的气球样变区域仍较多，且肝细胞受损的广度较大。表明在GLE与CUR的基础上加入SL，能显著增强对肝细胞形态的保护效应，表现出协同增效作用。

2.3 蛋白质组学研究结果

2.3.1 蛋白质鉴定及样本质控

基于DIA质谱的定量分析，在肝脏组织中鉴定到7 597个高可信度蛋白（对应肽段72 948个），如图7A和7B。如图7C和7D，样本间相关性高（R²＞0.992），PCA分析显示组内样本聚集度高，组间分离趋势明显，且给药组样本分布向正常组趋近。以上结果表明实验数据重复性良好，药物干预能显著逆转模型引起的表达谱变化。

2.3.2 差异表达蛋白（DEPs）筛选

与正常组相比，模型组肝脏组织中筛选出743个差异蛋白（上调634个，下调109个）；与模型组相比，GLE+SL+CUR高剂量组显著调控421个差异蛋白（上调55个，下调366个）。Venn图取交集分析进一步筛选出292个共有差异蛋白，其在模型组中表达异常，而在给药干预后得到显著回调，提示这些蛋白可能是复方发挥肝保护作用的关键潜在靶点。

2.3.3 差异蛋白的GO功能及KEGG通路富集分析

GO富集分析显示，差异蛋白主要参与免疫反应（immune response）、对其他生物的防御反应（defense response to other organism）、免疫系统过程（immune system process）以及对生物刺激的响应（response to biotic stimulus）等条目。KEGG通路分析显示，差异蛋白显著富集于细胞黏附分子（cell adhesion molecules）、吞噬体（phagosome）以及肌肉细胞细胞骨架（cytoskeleton in muscle cells）等相关通路。在共有差异蛋白中，涉及氧化应激与炎症反应的关键蛋白如MPO（髓过氧化物酶）、Hpx（结合珠蛋白）、Anxa2（膜联蛋白A2）、Cyba等表现出显著的表达差异。

3 讨论

本研究组方筛选阶段发现，各组分及配伍组对CCl₄诱导的急性肝损伤表现出不同维度的保护作用。GLE+CUR组在降低ALT方面效果显著，而含有SL的配伍组在提升抗氧化水平方面表现更为突出，提示不同成分在复方中发挥着差异化的药理功能。基于此，选定了GLE+CUR（作为基础配伍组）与GLE+SL+CUR（作为增效配伍组）进行后续药效对比。

药效确认实验表明，（GLE+SL+CUR）各剂量组能显著回调血清AST水平，并在病理切片中呈现明确的量效关系。GLE、CUR与SL的配伍不仅能增强内源抗氧化能力，同时，SL作为生物膜成分，可能通过直接修复受损细胞膜，与其余组分共同构建了“抗氧化-促修复”的双重防御体系。

本研究通过DIA蛋白质组学筛选出292个共有差异蛋白，其在GLE+SL+CUR干预后表达向正常组水平回调。GO与KEGG分析表明，这些差异蛋白主要涉及免疫反应、氧化应激及吞噬体相关通路，其中，MPO水平的下调提示GLE+SL+CUR配伍能有效抑制中性粒细胞在肝脏的募集与激活，从而减轻炎症造成的二次损伤^[15-16]。Cyba表达回调可能与ROS产生途径受阻有关^[17]。Hpx水平的变化可能关联到肝损伤后氧化应激产物的清除效率^[18]。而Anxa2参与的细胞骨架调控与膜融合过程，则可能在吞噬体成熟及受损肝细胞膜的快速修复中发挥核心作用^[19-20]。上述结果从分子层面揭示了该复方通过调控吞噬体功能与炎症反应实现肝保护的机制。

综上所述，研究证实GLE、CUR与SL配伍对CCl₄诱导的大鼠急性肝损伤具有显著保护作用。本研究的局限性在于：核心靶标分子生物学验证；对于慢性肝损伤或其他类型肝损伤的保护效果及其异同点，仍需进一步研究；GLE、CUR、SL最佳配伍配比亦有待优化。后续工作将重点围绕核心靶标开展分子生物学验证，并进一步优化组方配比，为开发具有高效护肝功能的复方保健功能产品提供更多的实验依据。

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基金资助

上海市卫生健康委员会“名中医学术经验传承创新提质升级项目”(A1-C24-800-0302)