柴胡桂枝干姜汤通过调控细胞周期和凋亡改善慢性胆囊炎

Chaihu Guizhi Ganjiang Decoction improves chronic cholecystitis by regulating cell cycle and apoptosis

摘要

目的 研究旨在探讨柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎的改善作用及其潜在机制。 方法 选用36只3～4月龄雄性豚鼠，随机分为对照组、模型组、柴胡桂枝干姜汤低、中、高剂量组以及阳性组。除对照组外，其余组均喂食高脂致石饲料构建慢性胆囊炎模型，随后进行为期8周的灌胃给药。柴胡桂枝干姜汤低、中、高剂量分别为8.2 g/kg、16.4 g/kg和32.8 g/kg，阳性组给予54.2 mg/kg熊去氧胆酸胶囊。实验采用苏木精-伊红（HE）染色检测胆囊病理情况、Tunel法检测胆囊组织细胞凋亡、免疫组化法检测胆囊组织Ki67蛋白表达、流式细胞术分析胆囊组织细胞周期分布以及Western blot法检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。 结果 柴胡桂枝干姜汤各剂量组均能显著减轻模型组胆囊组织的病理损伤，降低Ki67阳性表达量，并调控细胞周期和凋亡相关蛋白。与对照组相比，模型组豚鼠胆囊组织中Cyclin D1、NF-κB p65、Caspase-3、Caspase-9及Cyt c蛋白上调，而Cyclin A、Bcl-2及PARP1蛋白下调。与模型组相比，柴胡桂枝干姜汤下调了Cyclin D1、NF-κB p65及PARP1蛋白，上调了Cyclin A、Bax、Caspase-3、Caspase-9及Cyt c蛋白。 结论 柴胡桂枝干姜汤通过调控细胞周期和促进细胞凋亡对慢性胆囊炎具有显著的改善作用。

Abstract

Objective To investigate the ameliorative effects of Chaihu Guizhi Ganjiang Decoction (CGGD) on chronic cholecystitis (CCC) and its underlying mechanisms. Methods Thirty-six male guinea pigs aged 3-4 months were randomly divided into a control group, a model group, and low-, medium-, and high-dose CGGD groups, as well as a positive group. Except the control group, all the other groups were fed a high-fat, cholesterol-rich diet to induce the model, followed by eight weeks of gavage administration. The low, medium, and high doses of CGGD were 8.2 g/kg, 16.4 g/kg, and 32.8 g/kg, respectively, while the positive group received 54.2 mg/kg of ursodeoxycholic acid capsules. The experimental methods included hematoxylin and eosin (HE) staining to assess gallbladder pathology, the Tunel method to detect gallbladder tissue apoptosis, immunohistochemical staining to detect Ki67 protein expression in gallbladder tissue, flow cytometry to analyze the cell cycle distribution in gallbladder tissue, and Western blot analysis to detect the expression of cell cycle and apoptosis-related proteins. Results All the groups of CGGD significantly alleviated the pathological damage to the gallbladder tissue in the model group, reduced Ki67 positive expression, and regulated the expression of cell cycle and apoptosis-related proteins. Compared with the control group, the model group exhibited an upregulated expression of CyclinD1, NF-κB p65, Caspase3, Caspase9, and Cyt c proteins, while downregulated the expression of Cyclin A, Bcl-2, and PARP1 proteins in guinea pig gallbladder tissue. Compared with the model group, CGGD downregulated the expression of Cyclin D1, NF-κB p65, and PARP1 proteins, while upregulated the expression of Cyclin A, Bax, Caspase-3, Caspase-9, and Cyt c proteins. Conclusion Chaihu Guizhi Ganjiang Decoction exerts significant ameliorative effects on chronic cholecystitis by regulating the cell cycle and promoting cell apoptosis.

Graphical abstract

关键词

柴胡桂枝干姜汤 / 慢性胆囊炎 / 细胞周期 / 细胞凋亡

Key words

Chaihu Guizhi Ganjiang Decoction / chronic cholecystitis / cell cycle / apoptosis

慢性胆囊炎（chronic cholecystitis，CCC）是一种常见的胆囊疾病，主要表现为胆囊壁增厚^[1]、纤维化和慢性炎症反应^[2-3]，严重影响患者的生活质量。近年来，随着生活方式和饮食习惯的改变，慢性胆囊炎的发病率逐渐上升^[4]。尽管现代医学在治疗慢性胆囊炎方面取得了一定进展，但仍存在疗效不稳定、不良反应较大等问题^[5-7]。中医药在治疗慢性胆囊炎方面具有独特的优势^[8]。然而，柴胡桂枝干姜汤在慢性胆囊炎治疗中的具体机制尚不明确。本研究旨在通过动物实验，探讨柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎细胞周期和凋亡的调控作用，为其在慢性胆囊炎治疗中的应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级3～4月龄，健康豚鼠36只，雄性，体质量200～250 g，由四川省动物专委会养殖场提供（SCXK（川）2021-0037）。实验动物使用许可证号：SYXK（川）2021-0246，环境等级为屏障系统，温度20℃～26℃，相对湿度30%～70%，12 h日/12 h夜光照循环，按照3只/笼饲养。此研究已通过宁夏回族自治区中医医院伦理委员会审批（科伦理第2022-86号）。

1.2 药材准备

柴胡桂枝干姜汤：醋北柴胡10 g，桂枝10 g，干姜10 g，天花粉15 g，黄芩10 g，煅牡蛎（先煎）30 g，炙甘草6 g。高脂致石饲料购自江苏协同，配方为：苜蓿粉40%，猪油2%，胆固醇1%，黄豆粉10%，鱼粉3%，食盐1%，麸皮10%，酵母粉1%，酪蛋白2%，蔗糖5%，玉米粉15%。

1.3 仪器

JY-SCZ4+型垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），电泳电源（武汉Servicebio公司），RM2016型石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司），BMJ-A型组织包埋机（常州郊区中威电子仪器厂），BA210Digital型数码三目摄像显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Cytoflex型流式分析仪（美国Beckman公司），BC004型组化笔（北京兰杰柯科技有限公司），S1010E型掌上离心机（美国SCLOGEX公司），Pannoramic 250型数字切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司），HY-5型脱色摇床（上海程捷仪器设备有限公司），XK80-A型旋涡混匀仪（江苏新康医疗器械有限公司）。

2 方法

2.1 分组与给药

动物入室适应性饲喂7 d后，将实验动物随机分为6组，1）对照组，2）模型组，3）柴胡桂枝干姜汤低剂量组（CL），4）柴胡桂枝干姜汤中剂量组（CM），5）柴胡桂枝干姜汤高剂量组（CH），6）阳性组。对照组喂食正常豚鼠饲料，其余组喂食高脂致石饲料造模8周。造模完成后灌胃给药8周，每日灌胃给药2次，CL组给予8.2 g/kg的柴胡桂枝干姜汤；CM组给予16.4 g/kg的柴胡桂枝干姜汤；CH组给予32.8 g/kg的柴胡桂枝干姜汤；阳性组给予54.2 mg/kg的熊去氧胆酸胶囊；对照组、模型组予等量的生理盐水。

2.2 HE染色

将豚鼠胆囊组织用生理盐水清洗后，4%多聚甲醛固定30～50 min，制备石蜡切片，组织切片在45℃培养箱中干燥，常规脱蜡。蒸馏水浸泡5 min，苏木素染色5 min，自来水冲洗3 s，1%盐酸乙醇分化3 s，5%伊红染色3 min，自来水冲洗，晾干，采用光学显微镜观察组织切片。

2.3 Tunel染色

取各组豚鼠胆囊组织石蜡切片，经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后，用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）缓冲液充分水洗，滴加浓度为20 μg/mL的蛋白酶K试剂在组织上，于37°C孵育30 min后用PBS冲洗3次，每次5 min，随后滴加Tunel染色液，于37°C孵育1 h，最后用DAPI液复染细胞核并封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

2.4 免疫组化染色

采用免疫组织化学法检测胆囊组织中Ki67蛋白（厂家：华安生物，货号：HA721115）的表达情况。取材后立即置入4%中性甲醛固定液中浸泡，常规包埋、切片、脱蜡、脱水、灭活内源性过氧化物酶、抗原修复、封闭、孵育抗体、DAB显色、苏木精复染细胞核及封片。观察并拍照，使用Halo数据分析系统计算每张图像阳性面积占比（% DAB Positive Tissue）。

2.5 流式细胞术

胆囊组织置于装有预冷的2 mL PBS的60 mm玻璃平皿中漂洗干净后，用眼科剪剪成小块，用研磨器将组织轻轻研磨，收集细胞悬液用200目细胞筛过滤，300 g离心5 min，弃上清，用PBS洗涤2次，300 g离心5 min，弃上清，加入3倍体积的红细胞裂解液，室温裂解5 min，用PBS洗涤2次，离心收集细胞沉淀备用。细胞悬液样本75%冷乙醇20℃固定过夜后，300 g离心5 min，吸弃上清液，加入适量PBS洗涤2次，300 g离心5 min，吸弃上清，获得细胞沉淀，将Rnase A:PI按1:9体积配制成染色工作液（现配现用），500 μL PI/RNase A染色工作液重悬细胞，室温避光30 min后，上机检测分析。用软件CytExpert、ModFilLT分析流式数据，导出结果。

2.6 Western blot检测

取各组豚鼠胆囊组织加入RIPA裂解液（厂家：Beyotime，货号：P0013）提取总蛋白，BCA（厂家：Beyotime，货号：P0009）法检测总蛋白浓度。各蛋白样品使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳后转膜，5%脱脂牛奶室温孵育2 h，洗涤3次后分别加入一抗（Cyclin D1 1:5000厂家：三鹰，货号：60186-1-Ig；Cyclin A 1:2000厂家：Huabio，货号：ER63153；Cyclin B1 1:1000厂家：Proteintech，货号：28603-1-AP；Bax 1:2000厂家：Abclonal，货号：A19684；Bcl-2 11:2000厂家：proteintech，货号：26593-1-AP；NF-κB p65 1:5000厂家：proteintech，货号：80979-1-RR；Caspase-3 1:2000厂家：proteintech，货号：25128-1-AP；Caspase-9 1:2000厂家：huabio，货号：ER60008；PARP1 1:2000厂家：proteintech，货号：13371-1-AP；Cyt c 1:1000厂家：beyotime，货号：AF2047；β-actin 1:50000厂家：Abclonal，货号：AC026），在4℃下孵育12 h，洗涤后加入二抗室温孵育2 h，再次洗涤后使用电化学发光（electrochemiluminescence，ECL，厂家：Biosharp货号：BL520B）法检测蛋白条带，Image J软件评估蛋白的灰度值。

2.7 数据分析

应用IBM^® SPSS 20.0统计分析软件，数据以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，组间比较采用One-Way ANOVA检验，检验结果以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎豚鼠病理损伤的改善作用

HE染色结果如图1，与对照组相比，模型组可见黏膜层水肿、炎性细胞浸润等较为明显的病理改变；与模型组相比，柴胡桂枝干姜汤低剂量组的病变程度有所减轻，柴胡桂枝干姜汤中剂量组的病变程度减轻更为明显，而柴胡桂枝干姜汤高剂量组、阳性组的胆囊组织病变程度则相对最轻。

3.2 柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎豚鼠细胞凋亡的调控作用

如图2，图3。

3.3 柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎豚鼠细胞周期的调控作用

如图4。

3.4 柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎豚鼠细胞周期相关蛋白的调控作用

如图5。

3.5 柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎豚鼠NF-κB p65通路及凋亡相关蛋白的调控作用

如图6，见表1，表2。

4 讨论

柴胡桂枝干姜汤作为一种中药复方，广泛应用于肝胆疾病的治疗，其作用慢性胆囊炎的机制尚不清晰。本研究通过体内动物实验，深入探讨了柴胡桂枝干姜汤对慢性胆囊炎细胞周期和凋亡的调控作用，并初步揭示了其可能的作用机制。

慢性胆囊炎可能由胆汁分泌和排泄障碍引起，导致胆汁酸在血液中蓄积，进而引起局部或全身促炎因子的过度产生^[9]。在本研究中，柴胡桂枝干姜汤可显著改善胆囊组织病理改变，表明柴胡桂枝干姜汤对实验动物豚鼠慢性胆囊炎具有较好的治疗效果。细胞凋亡是维持组织稳态的重要机制，适度的细胞凋亡有助于清除损伤细胞，减少炎症反应^[10]。在正常胆囊组织中，细胞凋亡维持着胆囊黏膜上皮细胞的更新和稳态，在慢性胆囊炎的病理状态下，细胞凋亡的平衡被打破，炎症刺激导致胆囊黏膜上皮细胞凋亡增加，过多的细胞凋亡会破坏胆囊黏膜的完整性，使胆囊的屏障功能受损，进一步加重炎症反应。在本研究中，柴胡桂枝干姜汤中、高剂量组和阳性组动物的凋亡细胞百分率显著升高，但柴胡桂枝干姜汤抑制了Ki67蛋白的表达，这显示柴胡桂枝干姜汤可能通过促进细胞凋亡，从而缓解慢性胆囊炎豚鼠胆囊组织的炎症反应。

细胞周期的失调是慢性胆囊炎进展的重要因素之一，慢性炎症刺激可使胆囊细胞的细胞周期发生改变。炎症因子和生长因子可以促使胆囊细胞从G0期进入G1期，并加速细胞通过G1期进入S期，导致细胞增殖活跃。同时，细胞周期调控蛋白（如Cyclin、CDK等）的表达和活性也会发生变化，进一步影响细胞周期的进程。Cyclin D1蛋白的异常升高被认为可能会导致细胞过度增殖^[11]，而Cyclin A的降低则可能抑制细胞周期的正常进程^[12]。在本研究中，柴胡桂枝干姜汤低、中、高剂量组在G0/G1、G2/M及S期均有显著差异，且柴胡桂枝干姜汤能降低Cyclin D1蛋白表达，提高Cyclin A蛋白表达，表明柴胡桂枝干姜汤通过调节细胞周期蛋白的表达，可能有助于恢复细胞周期的正常分布。

NF-κB是炎症反应的关键转录因子，其激活可导致炎症因子的释放和细胞增殖^[13]。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡中起关键作用，Bax和Bcl-2的平衡决定了细胞的生存或凋亡^[14-15]。Caspase家族蛋白是细胞凋亡的执行者，其激活可导致细胞凋亡^[16-17]。在细胞凋亡过程中，PARP1会被Caspase-3特异性切割成两个片段，这种切割导致PARP1的酶活性丧失，无法正常发挥DNA修复功能，同时也是细胞凋亡的一个重要生化标志^[18-20]。此外，当细胞受到凋亡刺激时，线粒体膜通透性发生改变，Cyt c从线粒体膜间隙释放到细胞质中，细胞质中的Cyt c与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP结合形成凋亡体，参与细胞凋亡^[21-23]。本结果显示，柴胡桂枝干姜汤能够显著降低NF-κB p65和Bcl-2蛋白表达，提高Bax、Caspase-3、Caspase-9、PARP1和Cyt c蛋白表达，表明柴胡桂枝干姜汤通过调控这些关键蛋白的表达，介导胆囊组织细胞凋亡，抑制炎症反应。

综上所述，本研究表明柴胡桂枝干姜汤改善胆囊组织病理损伤，调节细胞周期蛋白及凋亡相关蛋白的表达，发挥抗炎、抗增殖和促凋亡的作用，从而对慢性胆囊炎表现出较好的治疗效果。然而，本研究仍存在一些局限性，如柴胡桂枝干姜汤调控细胞凋亡及细胞周期的具体作用途径（NF-κB通路、线粒体通路）等，这将在未来的研究中进行进一步的探讨。

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基金资助

宁夏自然科学基金项目(2023AAC03697)