化痰健脾益肺汤调节EGFR/MAPK通路对COPD大鼠气道炎症和黏液高分泌的影响

Effects of Huatan Jianpi Yifei Decoction on airway inflammation and mucus hypersecretion in COPD rats by regulating EGFR/MAPK pathway

摘要

目的 观察化痰健脾益肺汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症及黏液高分泌的影响，通过EGFR/MAPK通路探讨其潜在机制。 方法 60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松对照组、化痰健脾益肺汤低、中、高剂量组，每组10只。以气管内注射脂多糖（LPS）联合烟熏建立慢性阻塞性肺疾病模型。地塞米松对照组予0.01 mg/kg灌胃，各剂量组予7.3、14.6、29.2 mg/kg灌胃，连续28 d。检测肺功能（PEF、FVC、FEV₁），计数BALF中白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞，观察肺组织病理，免疫组化检测肺组织中黏蛋白（MUC5AC、MUC5B）的表达量，ELISA检测BALF及血清中炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α）的水平，Western-blot检测肺组织中EGFR、p38 MAPK、p-EGFR、p-p38 MAPK蛋白的表达量。 结果 与正常组比较，模型组肺功能降低，BALF炎症细胞增多，肺组织见明显炎症和肺气肿改变，MUC5AC、MUC5B的表达显著增强（P＜0.05），BALF及血清中IL-6、IL-8、TNF-α的水平及肺组织中p-EGFR、p-p38 MAPK的蛋白水平显著升高（P＜0.05）；各给药组上述指标均显著改善（P＜0.05）。 结论 化痰健脾益肺汤可减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和黏液高分泌，促进肺功能恢复，其机制可能与抑制EGFR/MAPK信号通路的异常激活相关。

Abstract

Objective To observe the effects of Huatan Jianpi Yifei Decoction on airway inflammation and mucus hypersecretion in COPD rats and to explore its potential mechanism via the EGFR/MAPK pathway. Methods Sixty SD rats were randomly divided into the normal group, model group, dexamethasone control group, and low-, medium-, and high-dose Huatan Jianpi Yifei Decoction groups, with 10 rats in each group. A COPD model was established by intratracheal injection of LPS combined with cigarette smoke exposure. The dexamethasone control group received 0.01 mg/kg dexamethasone by gavage, and the decoction groups received 7.3, 14.6, and 29.2 mg/kg respectively, once daily for 28 consecutive days. The lung function (PEF, FVC, FEV₁) was measured; the white blood cells, neutrophils, and macrophages in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were counted; lung histopathology was observed; the expression of mucins (MUC5AC, MUC5B) in lung tissue was detected by immunohistochemistry; the levels of inflammatory cytokines (IL-6, IL-8, TNF-α) in BALF and serum were measured by ELISA; and the protein expression of EGFR, p38 MAPK, p-EGFR, and p-p38 MAPK in lung tissue was detected by Western-blot. Results Compared with the normal group, the model group showed reduced lung function, increased inflammatory cells in BALF, obvious inflammation and emphysematous changes in lung tissue, significantly enhanced expression of MUC5AC and MUC5B (P<0.05), and significantly elevated levels of IL-6, IL-8, TNF-α in BALF and serum as well as p-EGFR and p-p38 MAPK in lung tissue (P<0.05). The above indicators were all significantly improved in the treatment groups (P<0.05). Conclusion Huatan Jianpi Yifei Decoction can alleviate airway inflammation and mucus hypersecretion, and promote the lung function recovery in COPD rats, and its mechanism may be related to inhibiting the EGFR/MAPK pathway.

Graphical abstract

关键词

慢性阻塞性肺疾病 / 化痰健脾益肺汤 / 气道炎症 / 黏液高分泌 / EGFR/MAPK通路

Key words

chronic obstructive pulmonary disease / Huatan Jianpi Yifei Decoction / airway inflammation / mucus hypersecretion / EGFR/MAPK pathway

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续性通气受限和气道慢性炎症为特征的疾病^[1]，中国40岁及以上人群患病率达13.7%^[2]。中医学将其归为“肺胀”“喘证”，以正虚积损为核心病机。化痰健脾益肺汤为本院验方，具有清肺止咳、健脾化痰、益气滋肾之效。COPD本质是香烟烟雾等毒性气体引发的气道慢性炎症，其中气道黏液高分泌是重要病理特征^[3-4]。现代研究^[5]证实，表皮生长因子受体/丝裂原活化蛋白激酶（epidermal growth factor receptor/mitogen-activated protein kinase，EGFR/MAPK）信号通路的活化可介导气道炎症与黏液高分泌。本研究通过脂多糖联合烟熏构建COPD大鼠模型，观察化痰健脾益肺汤对肺功能、气道病理及EGFR/MAPK通路的影响，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量（200±20）g，购自新疆医科大学［许可证号：SYXK（新）2023-0004］。实验经乌鲁木齐市中医医院伦理委员会批准（审批号：20230821311）。

1.2 实验药物及试剂

化痰健脾益肺汤组方：黄芪30 g，肉苁蓉15 g，党参15 g，熟地黄15 g，枸杞子15 g，川贝母12 g，五味子10 g，紫苏10 g，苦杏仁10 g，射干10 g，神香草10 g，芜菁10 g。换算为大鼠灌胃剂量14.6 mg/kg为中剂量，1/2和2倍分别为低、高剂量。地塞米松（浙江仙琚制药）、LPS（北京索莱宝）、HE染色试剂盒（南京森贝伽）、MUC5AC/MUC5B一抗（武汉华美）、SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂（上海经科）、IL-6/IL-8/TNF-α ELISA试剂盒（上海森雄）、EGFR/p38 MAPK/p-EGFR/p-p38 MAPK/β-actin抗体（Abcam公司）。

1.3 实验仪器

小动物肺功能检测系统（上海玉研科学仪器有限公司，型号：RC），石蜡切片机（Leica公司，德国，型号：RM 2235），光学显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：DSX1000），多功能酶标仪（Molecular Devices公司，美国，型号：CMax Plus），旋涡振荡器（上海雷磁仪器有限公司，型号：HY-1-2），脱色摇床（常州金坛良友仪器有限公司，型号：TSM-180），蛋白垂直电泳仪（Bio-Rad公司，美国，型号：Mini-protean）。

1.4 模型建立及给药

60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松对照组及化痰健脾益肺汤低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余各组采用气管内注射LPS联合烟熏建立COPD模型^[6]：于第1天、第14天经气管插管注入1 mg/mL LPS溶液0.2 mL，第2～28天行香烟烟熏（玻璃染毒箱内，每次30 min，每日2次，间隔4 h）。造模后，地塞米松组予0.01 mg/kg灌胃^[7]，中药组分别予7.3、14.6、29.2 mg/kg灌胃，正常组予等体积生理盐水，每日1次，连续28 d。

1.5 观察指标

1.5.1 肺功能评价

治疗完成后，各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，暴露气管，用手术尖刀在气管上划开1 mm长的切口，从下方小心插入导管，置于无创肺功能监测系统，记录一段平静呼吸后检测呼气气流高峰流速（PEF）、用力肺活量（FVC）及1 s最大呼气量（FEV₁）。

1.5.2 BALF细胞分类计数

暴露气管和双肺，由气管注入生理盐水灌洗左肺，回收80%～90%支气管肺泡灌洗液（BALF），取BALF 0.1 mL，1 500 r/min下离心15 min，吸取上清液于-80℃冰箱保存，细胞沉淀于PBS中重悬，作细胞涂片，染色计数白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞的绝对计数。

1.5.3 HE染色观察肺组织病理形态学改变

大鼠处死后，取部分肺组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、透明、石蜡包埋后，作5 μm组织切片，行HE染色，光学显微镜观察组织形态学变化并拍照。

1.5.4 ELISA检测血清、BALF中炎症因子水平

大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，经腹主动脉采血，BALF上清液于常温下解冻，分别于3 000 r/min下离心15 min后检测，按试剂盒说明书进行操作，计算血清及BALF中IL-6、IL-8、TNF-α的浓度。

1.5.5 免疫组化检测肺组织中黏蛋白表达

大鼠处死后，取部分肺组织于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、透明、石蜡包埋后，作5 μm组织切片，行免疫组化染色，应用Image J软件统计MUC5AC、MUC5B的积分光密度（IOD）。

1.5.6 Western-blot检测肺组织中EGFR/MAPK通路相关蛋白表达

取大鼠肺组织100 mg，用手术剪剪成碎块，于冰上匀浆，4℃，12 000 r/min下离心30 min，取蛋白上清，BCA法测定蛋白含量。上样蛋白样品10 μL，电泳分离，PVDF转膜，5% TBST脱脂奶粉封闭，加入一抗（1:1 000）于4℃孵育过夜，加入二抗（1:5 000）室温孵育1 h，发光液显色后曝光拍照，应用Image J软件分析目的蛋白灰度值，经内参校正后得到蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

实验数据采用SPSS 26.0软件分析，以均值±标准差（\overline{x}±s）描述，以GraphPad Prism 5.0软件绘制柱状图，组间数据采用t检验，2组以上数据采用单因素方差分析，以P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能指标比较

见表1。

2.2 各组大鼠BALF中炎症细胞计数比较

见表2。

2.3 肺组织病理形态变化

HE染色显示，正常组肺泡形态完好；模型组出现细支气管充血、间质水肿、肺泡扩张及炎细胞浸润；化痰健脾益肺汤各剂量组上述病理改变减轻，高剂量组和地塞米松对照组肺组织形态基本恢复正常，如图1。

2.4 BALF、血清炎症因子水平比较

见表3。

2.5 肺组织黏蛋白阳性表达比较

如图2。

2.6 肺组织EGFR/MAPK通路蛋白表达比较

如图3。

3 讨论

COPD病机可概括为正虚积损，痰浊、瘀血与正虚互为因果，导致病情迁延^[8]。化痰健脾益肺方中黄芪、党参补益肺脾，肉苁蓉、熟地黄、枸杞子滋肾填精，五味子敛肺滋肾，紫苏、川贝母、射干、苦杏仁、神香草、芜菁清肺化痰、平喘利咽，诸药共奏清肺止咳、健脾化痰、益气滋肾之效。前期临床研究证实，该方对COPD稳定期患者具有较好疗效，并能降低血清IL-6、TNF-α水平^[9]。

本实验中，LPS联合烟熏造模后大鼠出现咳嗽、气促，BALF中白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞显著增多，肺组织出现充血、水肿、炎细胞浸润及局限性肺不张，PEF、FVC、FEV₁降低，提示造模成功。各剂量化痰健脾益肺汤干预后，上述炎症细胞数显著减少，肺组织病理改变明显减轻，高剂量组肺组织形态基本恢复，肺功能指标显著提升。既往研究亦表明，黄芪甲苷可通过调控JAK3/STAT3/NF-κB通路缓解COPD小鼠肺组织病变^[10]，贝母素乙可降低COPD大鼠IL-8 mRNA水平并改善肺功能^[11]，党参多糖、紫苏醛可降低促炎细胞因子水平^[12-13]。

COPD患者气道中巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞持续分泌，同时释放IL-6、IL-8、TNF-α等炎性介质，造成肺部炎细胞浸润，肺组织损伤与修复交替发生，导致气流受限和肺泡结构的改变^[14]。MUC是呼吸道黏液大分子的重要组成部分，香烟烟雾等刺激性气体可导致MUC黏性增大，气道内炎症因子的释放可刺激MUC分泌^[4]。气道慢性炎症中，MUC主要由MUC5AC和MUC5B调节，MUC5AC、MUC5B常呈高表达，引起黏液高分泌，加剧炎症反应^[15]。EGFR是一类细胞跨膜蛋白受体，能够结合多种生长因子，并激活MAPK等下游信号^[16]。p38 MAPK是调节炎症反应及气道黏液高分泌的关键因子，多种刺激因素可通过活化p38MAPK途径上调MUC5AC水平，进而影响黏液分泌^[17]。本研究中，模型组大鼠BALF及血清中IL-6、IL-8、TNF-α的水平显著升高，肺组织MUC5AC、MUC5B及p-EGFR、p-p38 MAPK的表达明显增强，化痰健脾益肺汤各剂量组干预后，均下调了炎症介质水平，降低了黏蛋白和p-EGFR、p-p38 MAPK的表达，其中高剂量组改善最明显，提示化痰健脾益肺汤可能通过抑制EGFR/MAPK通路实现对COPD气道炎症和黏液高分泌的改善作用，且呈剂量依赖性。

综上所述，本研究表明化痰健脾益肺汤对COPD大鼠有一定的治疗作用，能够改善肺组织病理损伤，减轻炎症和黏液高分泌状态，促进肺功能恢复，其机制可能与抑制EGFR/MAPK信号通路的异常激活相关。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01A33)