海洋中药羊栖菜岩藻多糖抗肝癌活性构效关系初步研究

Preliminary study on the structure-activity relationship of fucoidans extracted from Sargassum fusiforme from the perspective of their anti-liver cancer activities

摘要

目的 海洋中药羊栖菜活性大分子岩藻多糖根据分子量的差异表达不同的生物活性。 方法 对羊栖菜水提取物进行30%、50%、80%浓度乙醇分级沉淀，收集的活性组分通过DEAE Cellulose离子交换柱分离，对所得的活性多糖组分进行平均分子量、单糖组成及体外抗肝癌活性研究。 结果 经过分级醇沉后，获得活性岩藻多糖沉淀，依次通过离子交换柱分离获得了四种不同的分子量的岩藻多糖组分，根据乙醇体积浓度命名为：SFP-30F1、SFP-30F2、SFP-50F1及SFP-80F1。发现乙醇体积浓度与岩藻多糖分子量成反比。体外细胞结果显示，不同分子量的岩藻多糖对肝癌细胞具有不同程度的抑制增殖作用，抗癌效果SFP-30F1＞SFP-30F2＞SFP-50F1＞SFP-80F1。 结论 通过分级醇沉结合离子交换柱分离方法，对羊栖菜岩藻多糖进行不同分子量的活性组分的分离，发现分子量与抗肝癌效果之间存在一定规律，为后续羊栖菜岩藻多糖抗癌药物开发和临床应用提供科学参考。

Abstract

Active macromolecule fucoidans, extracted from Sargassum fusiforme, a marine Chinese medicine, express different biological activities based on their varying molecular weights. In this paper, the water extracts of Sargassum fusiforme were precipitated by 30%, 50% and 80% ethanol, and the collected active components were separated by DEAE Cellulose ion exchange column, in which the average molecular weight, monosaccharide composition and in vitro anti-liver cancer activity were investigated. Four active fractions, namely SFP-30F1, SFP-30F2, SFP-50F1, and SFP-80F1, were obtained. It was found that the volume concentration of ethanol was inversely proportional to the molecular weight of fucoidans. In vitro experiments showed that fucoidans with different molecular weights had a dose-dependent inhibitory effect on the proliferation of liver cancer cells, among which SFP-30F1 demonstrated the most remarkable effect, followed in decreasing sequence by SFP-30F2、SFP-50F1, and SFP-80F1. Using a combination of graded alcohol precipitation and ion exchange column separation method, this study separated the active components of different molecular weights of Sargassum fusiforme, asserting that there was a certain pattern between their molecular weights and anti-liver cancer effects, providing a scientific reference for the development and clinical application of anti-cancer drugs with Sargassum fusiforme in the future.

Graphical abstract

关键词

羊栖菜 / 岩藻多糖 / 构效关系 / 抗肝癌活性

Key words

Sargassum fusiforme / fucoidan / structure-activity relationship / anti-liver cancer activity

长期饮酒容易导致肝炎和肝纤维化，甚至发展成肝癌。脂肪变性、酒精性肝炎和肝纤维化是发展成为肝硬化前期病理指标，其中酒精性肝炎患者的风险最高。近十年，全球大部分地区肝癌恶性肿瘤发病率呈现逐年上升趋势，也是致死率最高的疾病之一^[1]。由肝脏导致的相关疾病消耗了大部分医疗资源，对社会和经济发展产生了不利影响。迄今为止，虽然肝癌的发病机制至今尚未完全明确。但是，可靠证据^[2]表明，酒精会增加肝脏细胞内活性氧和机体活性氧簇的含量，加速细胞凋亡。因此，长期酗酒与肝癌的发病呈现正相关性。

羊栖菜[Sargassum fusiforme（Harv.）Setch.]属于棕藻，味苦，具有软坚散结，利水消肿，泻热化痰功能^[3]。《本草问答》记载：海藻生于水中，能清火润肝木^[4]。《肘后备急方》首次提出应用海藻、昆布等含碘中药治疗瘿病^[5]，因此，中医学认为羊栖菜对清火润肝和改善肝脏功能具有显著的疗效。近年来，我国黄海海域季节性暴发“赤潮”和“金潮”，对当地海洋环境造成巨大危害^[6]。羊栖菜是“金潮”暴发的组成之一，说明羊栖菜资源十分丰富。

羊栖菜中含有多糖、蛋白质、脂肪酸和色素等活性物质^[7]，其中岩藻多糖活性多达十余种，如抗癌、抗血栓、抗氧化、抗病毒、降血脂等功能^[8]。岩藻多糖是大分子化合物，因此不同种类海藻的岩藻多糖结构差异较大。基于岩藻多糖的强大活性和特殊结构，课题组前期通过柠檬酸炮制羊栖菜的方法提取到了一种具有护肝活性的岩藻多糖JHCF4，并发现了其抗癌^[9]，抗氧化^[10]和解酒护肝^[11]的活性。但是羊栖菜岩藻多糖的结构与活性关系并未深入研究，不同分子量岩藻多糖的活性作用尚未开展研究。

由于岩藻多糖的活性受种属、提取方法、分子量等因素的影响而变化。同时，空间结构和硫酸根在岩藻多糖活性方面也起到重要作用^[12]。因此，基于前期研究基础，本文采用分级水提醇沉法联合DEAE纤维素离子交换柱分离技术获得不同分子量的岩藻多糖组分，探究分子量对岩藻多糖抗肝癌活性的影响，进一步明确岩藻多糖抗癌构效关系。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

N-1300型旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；Infinite M200 PRO型酶标仪（瑞士Tecan公司）；FDU 2100型冻干机（日本EYELA公司）；XP205型精密分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TECAN 96孔板（美国Costar公司）；Dionex UltiMate 3000超高液相色谱仪（美国Thermo公司）。

无水乙醇（分析纯，国药集团）；二甲基亚砜（DMSO）、DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液（P/S）、0.25%胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（普诺赛）；色谱甲醇（色谱纯，美国Thermo公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜岩藻多糖的提取分离

羊栖菜采集于山东省青岛市黄海海域，经长春中医药大学于澎鉴定为正品。样品储存于长春中医药大学吉林省人参科学研究院样本室，样品干燥后粉碎过筛（三号筛），备用。

称量羊栖菜粉末500 g，100 ℃沸水提取1.5 h，纱布过滤残渣，残渣再提取1次，合并提取滤液，通过旋转蒸发仪浓缩。将羊栖菜岩藻多糖浓缩液加入无水乙醇，至乙醇终体积分数为30%时，低温静置12 h后，将溶液离心（7 000 r/min）15 min，收集沉淀物，将其命名为SFP-30。对上述30%乙醇体积分数的岩藻多糖浓缩液继续加入无水乙醇，至乙醇体积分数达到50%，静置，离心，收集沉淀物，命名为SFP-50。参照上述操作，将岩藻多糖浓缩液乙醇体积分数定为80%的沉淀物命名为SFP-80。

1.2.2 DEAE-cellulose离子交换柱的分离

将0.6 g岩藻多糖粉末溶于12 mL纯水中，过滤后，溶液上样于DEAE-cellulose离子交换柱(17 cm×2.5 cm)，利用50.0 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.0）平衡离子柱。在醋酸钠缓冲液中，依次从0-2 M氯化钠溶液开始梯度洗脱，进行柱分离。每15 mL洗脱液放入一个试管中，共收集120个试管。每根试管中的多糖含量通过苯酚硫酸法测定^[13]。收集多糖阳性试管并冻干。将每个组分溶解在纯水中，转移到透析膜中洗脱，以去除离子污染物并冻干。

1.2.3 岩藻多糖单糖组成测定

溶解单糖标准品，加0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液6 mL，加0.3 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，70 ℃水浴反应1 h，加0.3 mol/L盐酸溶液5 mL中和，用等体积三氯甲烷萃取，取水层，制得对照品溶液。岩藻多糖组分的衍生化重复上述操作。

色谱条件：采用Diamonsil C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：磷酸盐缓冲液（pH = 6.8）乙腈溶液（85:15，v/v）；流动相B：PBS（pH = 6.8）：乙腈（60:40，v/v）；流速：0.9 mL/min；柱温：40℃，检测波长250 nm，进样量10 μL；梯度洗脱：0 min→10 min→40 min→51 min→52 min→60 min；浓度梯度B为0%→8%→13%→20%→0%→0%。

1.2.4 岩藻多糖分子量及理化性质测定

对照品溶液的配制：根据样品分子量的大小，选用重均分子量为葡聚糖1 000、5 000、12 000、50 000、150 000不同分子量的标准品加流动相配制成10 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液的配制：取岩藻多糖组分，加流动相配成10 mg/mL的溶液，过0.45 μm滤膜，滤液作为供试品溶液。采用色谱柱SepexSRTSEC-100（7.8×300 mm，5 μm）；流动相：0.7%硫酸钠溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器。

岩藻多糖组分的糖醛酸、硫酸盐含量、蛋白质含量^[14]的测定条件根据已有方法进行。

1.2.5 Hep3B肝癌细胞培养及存活率测定

Hep3B细胞采用RPMI培养基（含10% FBS），在37 ℃、体积分数为5% CO₂的培养箱中孵育。待细胞生长至80%后进行传代，取生长状态良好的细胞用于后续实验。实验分为空白组和岩藻多糖干预组（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）。

将Hep3B细胞以1×10⁵个/mL，取180 μL细胞悬液接种到96孔板中，培养箱孵育24 h，加入不同浓度的岩藻多糖组分，Hep3B细胞孵育24 h后加入MTT溶液，避光孵育3 h后，吸去上清液，加入200 μL DMSO，酶标仪540 nm下测定每孔的吸光度值，空白组设定为100%存活率，计算细胞存活率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0进行数据处理，每组实验重复3次，数值以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较选用单因素方差分析，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 岩藻多糖的分离与得率

羊栖菜水提取液经80%、50%、30%乙醇沉淀后，获得了3个粗岩藻多糖组分SFP-80、SFP-50和SFP-30，得率分别为8.2%、6.3%、6.4%。利用DEAE纤维素离子交换柱对岩藻多糖粗糖进一步分离。结果显示SFP-30流出2个岩藻多糖组分SFP-30F1和SFP-30F2，得率分别为15.2%和8.7%，SFP-80和SFP-50经过离子交换纯化分别得到一个组分，即SFP-80F1和SFP-50F1，得率为6.5%和10.7%，如图1。

2.2 岩藻多糖重均分子量与单糖组成

根据分子量测定标准曲线，计算各组分的重均分子量。四个岩藻多糖SFP-30F1、SFP-30F2、SFP-50F1和SFP-80F1的重均分子量分别约为134 016 Da、101 174 Da、42 910 Da、6 102 Da。可以看出，岩藻多糖的重均分子量大小随着乙醇浓度的增加而减少。

与甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖9个混标的保留时间的比对（如图2），发现各组岩藻多糖主要以岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖为主要组成。以岩藻糖为例，各组分含量均高于15%，其中SFP-30F1含量最高，SFP-80F1含量最低。乙醇沉淀的体积分数与岩藻糖的含量有相关性。各组分蛋白含量均低于8%，而糖醛酸含量在9.74%～23.20%，见表1。

2.3 Hep3B肝癌细胞存活率

通过对岩藻多糖活性组分进行抗肝癌活性筛选，结果如图3所示：四个组分SFP-30F1、SFP-30F2、SFP-50F1和SFP-80F1均对Hep3B肝癌细胞产生抑制生长的作用，并呈剂量依赖方式。其中，SFP-30F1具有最强的抗癌活性，IC₅₀达到23.2 μg/mL。结果发现，较低乙醇体积分数沉淀的岩藻多糖具有更高的岩藻糖含量，更大的重均分子量。推断分子量大小和岩藻糖的含量与抗肝癌活性密切相关。

3 讨论

海藻是重要的海洋生物，数百年来为人类提供了食物来源和医疗保健资源。海藻主要分为棕藻、绿藻和红藻。海藻多糖分为褐藻多糖、红藻多糖、绿藻多糖和蓝藻多糖，其中褐藻含有卡拉胶、藻酸、岩藻多糖、琼胶等多糖类物质^[15]。1913年Kylin首次在褐藻中提取到岩藻多糖，岩藻多糖是具有支链结构的生物大分子结构化合物，同时具有一个线性的骨架主链。不同提取方法得到的岩藻多糖也可能具有不同的结构，空间结构和分子量大小对活性产生重要影响^[16]。最早发现岩藻多糖由1,2-α-连接的L-型岩藻糖的聚合物组成，硫酸基连接在岩藻糖的C-4位^[17]。随着对不同种属提取的岩藻多糖的研究，发现岩藻多糖主要骨架是1,3-α-连接的L-型岩藻糖的聚合物组成，伴随部分1,2-α-连接和1,4-α-连接，硫酸根占据C-2，C-3，或C-4位^[18]。经过结构修饰和去硫酸化，对比活性效果后，显示岩藻多糖的最佳活性模型是分支无规卷曲^[19]。因此，岩藻多糖的复杂结构与其活性能力密切相关。在我们前期研究中，利用红外和高效液相色谱鉴定了岩藻多糖的部分结构，还利用高分辨质谱鉴定了炮制后羊栖菜岩藻多糖的部分结构单元，发现了一个甘露糖和岩藻糖1,3连接的二糖单元^[20]。在本研究中，我们通过分级沉淀和离子交换柱方法获得了不同分子量的岩藻多糖，鉴定了各个组分的重均分子量，并发现分子量越大的岩藻多糖组分具有更强的抗肝癌活性，该研究为羊栖菜岩藻多糖的抗肝癌新药开发提供了构效关系方面的理论支撑。

本文通过离子交换柱等分离化学手段结合体外肝癌细胞活性试验，对羊栖菜不同分子量的岩藻多糖进行了构效关系的分析。发现分子量大小与岩藻多糖的抑制肝癌细胞生长呈正相关性。不考虑岩藻多糖空间构型因素，初步推断大分子量的岩藻多糖呈现更强的抗肝癌作用。本研究为企业深入开发转化以羊栖菜岩藻多糖为主要成分的抗癌新药提供了科学支持。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82204719)