针刺内关对缺血性脑卒中大鼠的神经损伤和肠道屏障功能相关蛋白表达的影响

Effects of acupuncture at Neiguan on the neural injury and intestinal barrier function-related protein expression in rats with ischemic stroke

摘要

目的 探讨针刺内穴对缺血性脑卒中大鼠神经损伤及肠道屏障功能相关蛋白表达的调节作用。 方法 将70只SD大鼠随机分为对照组、模型组、模型+依达拉奉组、模型+针刺组、模型+假针刺组，每组各14只。采用中动脉栓塞（MCAO）技术建立缺血性脑卒中模型，模型+依达拉奉组给予依达拉奉治疗，模型+针刺组针刺内关穴，模型+假针刺组针刺非穴位，均持续干预14 d。通过改良神经损害严重程度评分（mNSS）评估神经功能，TTC染色法检测脑梗死体积；采用RT-qPCR、ELISA检测脑组织IL-1β、TNF-α水平，免疫荧光化学检测脑组织BDNF、NSE表达；Western blot检测肠道ZO-1、Occludin表达；ELISA检测血清DAO、D-LA、LPS水平。 结果 与对照组相比，模型组mNSS评分、脑梗死体积显著升高，脑组织IL-1β、TNF-α、NSE及血清DAO、D-LA、LPS水平显著升高，脑组织BDNF及肠道ZO-1、Occludin水平显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，模型+针刺组和模型+依达拉奉组上述指标均呈反向显著改善（P＜0.05）；与模型组相比，模型+假针刺组各项指标无统计学差异（P＞0.05）。 结论 针刺内关可促进缺血性脑卒中大鼠神经功能恢复，减小脑梗死体积，降低炎症反应，提高神经营养因子表达，增强肠道屏障功能。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effect of acupuncture at Neiguan (PC6) on the neural injury and intestinal barrier function-related protein expression in rats with ischemic stroke. Methods Seventy Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group, a model group, a positive control group, a model + acupuncture group, and a model + sham acupuncture group (n = 14). An ischemic stroke model was established using the middle cerebral artery occlusion (MCAO) technique. The positive control group received edaravone treatment, while the model + acupuncture group underwent acupuncture at Neiguan (PC6) and the model + sham acupuncture group received acupuncture at non-acupoints, with all interventions lasting for 14 days. The neurological function was assessed using the modified Neurological Severity Score (mNSS), and the cerebral infarction volume was measured by TTC staining. RT-qPCR and ELISA were employed to detect the IL-1β and TNF-α levels in brain tissue, and immunofluorescence chemistry was used to examine the BDNF and NSE expression in brain tissue. Western blot was performed to analyze the ZO-1 and occludin expression in the intestine, while the serum levels of DAO, D-LA and LPS were measured by ELISA. Results Compared with the control group, the model group showed significantly increased mNSS scores, cerebral infarction volume, brain tissue IL-1β, TNF-α, NSE levels, and serum DAO, D-LA, LPS levels (all P<0.05), while the brain tissue BDNF and intestinal ZO-1, occludin levels were significantly decreased (all P<0.05). Compared with the model group, both the model + acupuncture group and positive control group demonstrated significant reverse improvements in all these indicators (all P<0.05). No statistically significant differences were observed between the model group and model + sham acupuncture group (all P>0.05). Conclusion Acupuncture at Neiguan (PC6) promotes neurological function recovery, reduces cerebral infarction volume, decreases inflammatory responses, enhances neurotrophic factor expression, and improves intestinal barrier function in rats with ischemic stroke.

Graphical abstract

关键词

针刺 / 内关 / 缺血性脑卒中 / 大鼠 / 神经损伤 / 肠道屏障

Key words

acupuncture / Neiguan (PC6) / ischemic stroke / rats / neural injury / intestinal barrier

缺血性脑卒中是由脑血管血氧供应不足引起的 严重脑血管疾病，是全球范围内导致死亡或残疾的主要原因，给社会和临床带来沉重负担^[1-2]。目前常规治疗方案（药物溶栓、机械取栓）受严格时间窗限制，多数患者难以获益^[3]。近年来“脑-肠”轴机制的发现揭示了大脑与肠道的双向调控关系，其中肠道屏障功能紊乱可通过炎症反应加剧脑损伤，成为脑卒中治疗的新靶点^[4-5]。针刺疗法可有效调节肠道机械屏障功能，抑制脑卒中后的神经损伤，但其调控脑肠互作的分子机制仍需完善^[6-7]。内关是手厥阴心包经的常用穴位，与心、脑密切相关，具有宁心安神、理气止痛的功效^[8]。本研究通过建立缺血性脑卒中大鼠模型，观察针刺内关对神经炎症、神经损伤及肠道屏障功能的影响，为针刺治疗脑卒中提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

异氟烷（R510-22，美国Sigma-Aldrich公司）。2,3,5-三苯基四氮唑（TTC，T8877-25G，德国Merck公司）。依达拉奉注射液购于国药集团国瑞药业有限公司（国药准字H20080056）。神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）抗体（ab53025，英国Abcam公司）。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）抗体（ab108319，英国Abcam公司）。ZO-1抗体（61-7300，美国Invitrogen公司）。Occludin抗体（33-1500，美国Invitrogen公司）。PCR试剂盒（RR036A，日本Takara公司）。RIPA裂解液（R0278，美国Sigma-Aldrich公司）。ECL发光液（32106，美国Thermo公司）。IL-1β试剂盒（PI303，上海碧云天公司）、TNF-α试剂盒（PT516，上海碧云天公司）。二胺氧化酶试剂盒（diamine oxidase，DAO）（ER0895，武汉菲恩生物科技有限公司）。D-乳酸（D-lactate，D-LA）（YS03830B，上海雅吉生物科技有限公司）。内毒素试剂盒（lipopolysaccharide，LPS）（SP37177，武汉赛培生物科技有限公司）。

1.2 实验动物

70只SPF级雄性SD大鼠，体质量250～300 g，8～12周龄，均来源于新疆医科大学动物实验中心（许可证号：SCXK-新2021-0003）。使用独立通风笼具（IVC系统），每笼不超过5只，饲养于12 h/12 h昼夜交替，恒温（21±2）℃，恒湿（50%～60%）的条件下。所有大鼠自由进食和饮水。本研究中的所有动物实验均经新疆医科大学第七附属医院伦理委员会审批通过（20240820-002）。

1.3 模型建立与分组干预

大鼠适应性喂养1周后，采用线栓法建立大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血性脑卒中模型。术前禁食12 h，4%异氟烷腹腔注射麻醉，术中维持体温37℃、血氧饱和度＞95%、心率320～380次/分。颈部纵切口分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉远端，经颈内动脉插入4-0硅胶涂层尼龙线，头端直径（0.26±0.02）mm至大脑中动脉起始部，推进深度（18.50±0.50）mm。将大鼠随机分为5组，每组14只。1）对照组：仅暴露血管，不插入线栓；2）模型组：建立MCAO模型，不给予药物或针刺干预；3）模型+依达拉奉组（阳性对照）：造模成功后尾静脉注射依达拉奉6 mg/（kg·d），连续14 d；4）模型+针刺组：造模成功后针刺双侧内关，每日1次，每次30 min，连续14 d；5）模型+假针刺组：造模成功后针刺大鼠背部非穴位点，操作同模型+针刺组，连续14 d。

1.4 神经功能评分

术后14 d采用双盲法进行改良神经损害严重程度评分（modified Neurological Severity Score, mNSS），涵盖运动、步态、感觉、平衡、反射5个维度，总分0～12分，评分≥7分判定为模型成功。所有测试于每日上午9：00-11：00进行。

1.5 ELISA检测脑组织IL-1β和TNF-α水平

术后14 d取大鼠新鲜脑组织匀浆，检测IL-1β、TNF-α蛋白水平；取腹主动脉血分离血清，检测DAO、D-LA、LPS水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.6 RT-qPCR检测脑组织IL-1β和TNF-α的mRNA水平

检测采用Trizol法提取脑组织RNA，逆转录后进行RT-qPCR扩增，引物序列：IL-1β正向5'-GC AACTGTTCCTGAACTCA-3'、反向5'-CTCGGAGC CTGTAGTGCAG-3'；TNF-α正向5'-CCACCACGCT CTTCTGTCTAC-3'、反向5'-AGGGTCTGGGCCAT AGAACT-3'。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内参，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.7 TTC染色检测脑梗死体积

大鼠深度麻醉处死后取脑，-20℃预冷15 min后冠状位切片（2 mm 厚），1% TTC溶液37℃避光孵育30 min，Image-Pro Plus 6.0软件计算梗死体积。

1.8 免疫荧光染色检测BDNF和NSE的表达

取脑组织梗死周边区冰冻切片10 μm，通透、封闭后孵育BDNF（1:200）、NSE（1:500）一抗，4℃过夜；Alexa Fluor二抗（1:1 000）避光孵育2 h，DAPI复染核。荧光显微镜下随机选取5个视野（×200），Image J软件定量荧光强度。

1.9 Western blot检测

肠道屏障蛋白ZO-1和 Occludin的表达取回肠末端组织（距盲肠2 cm）提取总蛋白，BCA法定量后进行SDS-PAGE转PVDF膜、封闭，孵育ZO-1（1:1 000）、Occludin（1:800）一抗，4℃过夜；HRP标记二抗（1:5 000）室温孵育1 h，ECL显影。Image Lab软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法

采用SPSS 26.0软件处理，计量资料以均值±标准差（\overline{x}±s）表示。多组比较先进行Shapiro-Wilk正态性检验和Levene方差齐性检验，满足条件者采用单因素ANOVA（LSD事后检验），不满足则用Kruskal-Wallis H检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较

见表1。

2.2 各组大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α水平的比较

见表2。

2.3 各组大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α mRNA水平表达的比较

见表3。

2.4 各组大鼠脑梗死体积的比较

如图1，见表4。

2.5 各组大鼠脑组织中神经营养因子表达的比较

如图2，图3和见表5。

2.6 各组大鼠肠道屏障功能指标的影响

如图4，见表6，表7。

3 讨论

mNSS评分是评估脑卒中后神经损伤的核心指标，本研究结果显示，针刺内关可显著降低缺血性脑卒中大鼠的mNSS评分，且模型+假针刺组无明显改善，表明该效应是内关的特异性作用，而非针刺操作的非特异性刺激^[9]。同时，针刺内关可显著减小脑梗死体积，这与LIU Y Y等^[10]的研究结果一致，其机制可能与针刺改善脑血液循环、抑制神经元铁死亡有关^[10-11]。

炎症反应是缺血性脑卒中神经损伤的核心病理过程，IL-1β和TNF-α的过度表达可导致神经元凋亡和坏死^[12]。本研究发现，针刺内关可显著下调脑组织IL-1β和TNF-α的蛋白及mRNA水平，提示其可通过抑制神经炎症减轻脑损伤。既往研究表明，针刺内关可能通过抑制NF-κB炎症信号通路的激活，减少促炎因子的合成与释放^[13]。

BDNF是促进神经元存活和突触可塑性的关键神经营养因子，NSE则是神经元损伤的特异性标志物^[14]。本研究结果显示，针刺内关可上调BDNF表达、下调NSE表达，表明其可促进神经修复、减轻神经元损伤，这与模型+依达拉奉组的神经保护作用相似。

缺血性脑卒中可导致肠道屏障功能破坏，肠道通透性增加，细菌和内毒素易位进入血液循环，进一步加剧全身炎症反应和脑损伤^{[4, 15]}。DAO、D-LA和LPS是评价肠黏膜损伤的重要指标，ZO-1和Occludin是维持肠道紧密连接完整性的核心蛋白^[16-19]。本研究发现，针刺内关可显著升高肠道ZO-1和Occludin的表达，降低血清DAO、D-LA和LPS水平，表明其可通过修复肠道机械屏障，减少肠道有害物质易位，从而调节“脑-肠”轴稳态，减轻脑损伤。

本研究存在一定局限性：仅观察了术后14 d的短期疗效，未探讨针刺的长期作用；未深入研究针刺调控“脑-肠”轴的具体信号通路；未设置不同针刺时长/频率梯度，无法确定最佳干预方案；未检测肠道菌群变化，未能全面揭示脑肠互作的分子机制。后续可进一步开展长期疗效观察、信号通路研究及肠道菌群分析，为针刺内关的临床应用提供更充分的依据。

综上所述，针刺内关可通过抑制神经炎症、促进神经修复、增强肠道屏障功能，改善缺血性脑卒中大鼠的神经功能，为针刺治疗缺血性脑卒中提供了实验依据。

缺血性脑卒中后，肠道屏障功能往往会受到破坏，导致肠道通透性增加，细菌和内毒素易位进入血液循环，引发全身炎症反应^[4]。本研究中观察了模型组和针刺内关后ZO-1和Occludin的表达和血清中DAO、D-LA、LPS表达，由于血清DAO、D-LA水平是评价肠黏膜损伤程度的重要指标^[17]，且LPS是细菌分泌的一种细菌素，与肠道通透性有关，可作为评价肠黏膜功能损伤的关键指标^[18-19]。我们发现针刺内关后肠道屏障功能通过抑制血清DAO、D-LA、LPS的表达从而改善肠道屏障功能，并可能减少肠道内有害物质的吸收，减轻全身炎症反应，对“脑-肠”轴的稳定起到重要作用。ZO-1和Occludin是构成肠道紧密连接的重要蛋白，二者的正常表达和功能对于维持肠道屏障的完整性至关重要^[7-8]，本研究还证实了针刺内关可以显著促进肠道组织中ZO-1和Occludin的表达，这些结果进一步表明了内关穴在调节肠道屏障功能方面的特异性。

本研究存在一定的局限性。本研究是基于动物实验，样本量仍然较少，且缺乏对分子互作以及信号通路网络等方面的深入探讨，因此还需要进一步拓展体内外分子机制的研究。另外，本研究仅观察了术后治疗14 d的效果，对于针刺内关的长期疗效需要进行更长期的观察。

综上所述，本研究表明针刺内关对缺血性脑卒中大鼠的“脑-肠”轴具有显著的调节作用，在神经功能恢复、脑梗死体积减少、炎症因子调节和肠道屏障功能增强等方面都表现出良好的效果，为针刺内关在缺血性脑卒中及其他相关疾病的治疗中提供了坚实的理论依据。

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基金资助

省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目(SKL-HIDCA-2024-QF2)