中药黄芪（Huangqi，milkvetch root）为豆科黄芪属植物蒙古黄芪
Astragalus membranaceus（Fisch.）Beg. var. mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪
A. membranaceus（Fisch.）Beg.的干燥根，其在我国拥有悠久的用药历史，被誉为“补药之长”
[1]。黄芪中含有200余种化合物，涵盖黄酮类、三萜皂苷类、多糖、氨基酸、生物碱以及蒽醌类等，具有抗炎，抗肿瘤，保护心脏，保护神经，治疗糖尿病，抗菌，护肝和增强免疫力等作用
[2]。其中异黄酮类化合物，作为黄芪的主要活性成分，对其药理特性起着决定性作用，是阐释黄芪药用价值的关键物质基础。随着分子生物学和组学技术的发展，学界对黄芪异黄酮生物合成途径及其关键酶的认识日益深入，本文旨在梳理和总结该领域的研究成果，重点关注生物合成途径的解析、关键酶基因的克隆与功能验证、以及代谢调控机制，并对未来研究方向进行展望。
1 黄芪中的异黄酮类化合物
黄酮类化合物是黄芪中一类至关重要的活性成分，目前已从黄芪中提取分离出100多种黄酮类化合物，基于其结构，可分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇、异黄酮、花青素、二氢黄酮醇和查耳酮等
[3]。其中异黄酮含量最为丰富，如毛蕊异黄酮（calycosin）、毛蕊异黄酮苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）、芒柄花素（formononetin）和芒柄花苷 （ononin）等，占总黄芪中黄酮含量的80%，是黄芪中标志性的异黄酮类化合物
[4]，黄芪中部分异黄酮类化合物结构，见
表1。
2 黄芪中异黄酮类化合物的生物合成过程
异黄酮类化合物作为黄芪中一类重要的活性成分，其合成过程体现了植物生化反应的复杂性与精细调控。黄芪异黄酮类物质的合成始于苯丙氨酸代谢途径，如
图1。在合成途径的起始阶段，苯丙氨酸分子在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的催化下发生脱氨反应，生成肉桂酸（cinnamic acid）
[5]。PAL作为促进初级代谢的关键酶，其活性程度对后续黄酮类化合物的生成产生直接影响
[6]。肉桂酸生成后，在肉桂酸-4-羟化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）的作用下，形成对羟基香豆酸（P-coumarate）
[7]。随后对羟基香豆酸进一步在4-香豆酸辅酶A连接酶（4-cumaric acid: coenzyme A ligase，4CL）的催化下，与辅酶A结合生成对香豆酰辅酶A
[8]，为后续缩合反应奠定基础。
此后，类黄酮骨架的构建由查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）主导，其催化1分子对香豆酰辅酶A与3分子丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）缩合，生成一种具有15个碳原子构成类黄酮结构的基本化合物柚皮素查尔酮（4,2',4',6' tetrahydroxychalcone）
[9]。查尔酮异构酶（CHI）随即催化该产物进行分子内环化，形成具有二氢黄酮结构的柚皮素（naringenin）。柚皮素是黄酮类化合物合成的关键枢纽，其碳骨架可流向不同分支途径，进而形成包括黄酮、黄酮醇和异黄酮在内的多种结构类型
[10]，例如在异黄酮合酶（isoflavone synthase，IFS）的催化作用下生成染料木素（genistein）
[11]。
在黄芪等豆科植物中，异黄酮的合成存在一条特殊分支。对香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A在查尔酮还原酶（chalcone reductase，CHR）与CHS的共同作用下生成异甘草素，后者经CHI催化生成甘草素
[12]。甘草素再经异黄酮合酶（isoflavone synthase，IFS）催化，B环发生芳构化迁移，形成大豆苷元（daidzein）
[13]。IFS作为异黄酮合成的标志性酶，也属于细胞色素P450蛋白家族，其表达具有组织特异性与发育阶段依赖性。近年来研究
[14]表明，黄芪中IFS基因的表达受到多种转录因子的调控，如MYB、bHLH等，这些因子在应对环境胁迫及激素信号时能够显著影响异黄酮的合成效率。
以大豆苷元作为核心异黄酮母核，可进一步被修饰生成多种衍生物。例如，在异黄酮4'-O-甲基转移酶（isoflavone 4'-O-methyltransferase，HI4' OMT）催化下，大豆苷元转化为芒柄花素
[15]；而在异黄酮-3'-羟基化酶（I3'-hydroxylase，I3' H）作用下，大豆苷元的B环被羟基化，生成毛蕊异黄酮
[16]。这两种产物均为黄芪中代表性的异黄酮成分。近年研究进一步揭示，黄芪中还存在一类芒柄花素经过芒柄花素-7-O-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose: formononetin-7-O-glucosyltransferase，UFGT），能够催化芒柄花素和毛蕊异黄酮分别生成其相应的糖苷形式——芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷
[17]，该糖基化修饰不仅提高了化合物的水溶性，也对其在体内的稳定性与生物利用度具有重要影响
[18]。
3 黄芪中异黄酮化合物生物合成途径中的关键酶
3.1 查尔酮合成酶CHS
查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是类黄酮与异黄酮化合物生物合成途径中的首个关键限速酶，归属于III型聚酮合酶（type III PKS）家族
[19]。在黄芪等药用植物中，CHS通过催化1分子对香豆酰辅酶A（p-coumaroyl-CoA）与3分子丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）进行连续的克莱森（Claisen）缩合反应，生成柚皮素查尔酮（naringenin chalcone）
[20]，该产物是绝大多数黄酮类化合物的前体。因此，CHS所催化的反应被认为是黄酮类物质生物合成的关键起点，对整个代谢途径的流向与通量具有决定性作用
[21]。科学人员最早于欧芹（
Petroselinum hortense）中发现了CHS蛋白的生物活性，并于1983年被克隆出来，自此大量的CHS基因开始从各类植物中得到分离
[22]。CHS基因在植物次生代谢合成中具有重要意义，其活性不仅决定了黄酮类化合物的合成效率，而且还参与植物对环境胁迫的响应
[23]。大量研究
[24]表明，CHS基因在多种植物中表现出显著的抗逆活性。CHS基因可被紫外线、强光、病原菌侵染、机械损伤以及激素信号等多种因素诱导表达，进而促进具有抗氧化、抗紫外和抗菌活性的黄酮类物质的合成，以增强植物的环境适应能力。
3.2 查尔酮还原酶CHR
查尔酮还原酶（chalcone reductase，CHR）是异黄酮类化合物生物合成途径中的关键导向酶
[25]，隶属于醛酮还原酶（aldo-keto reductase，AKR）超家族中的AKR4亚族
[26]。该酶能够特异性催化以查尔酮为底物的羰基还原反应，且其催化过程严格依赖还原型辅酶Ⅱ（NADPH）作为电子供体。在代谢通路上，CHR与查尔酮合成酶（CHS）形成功能耦合：CHS首先催化对香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合生成柚皮素查尔酮，随后CHR在此基础之上，将其还原为异黄酮合成的关键中间体——异甘草素（isoliquiritigenin）
[27]。该产物是合成大豆苷元（daidzein）等主要异黄酮必不可少的共同前体
[28]，因此CHR的活性直接调控着碳流由通用黄酮途径向异黄酮分支途径的定向分配。
CHR蛋白及其编码基因最早在大豆（
Glycine max）中被鉴定
[25]，后续研究表明其在紫花苜蓿（
Medicago sativa）、百脉根（
Lotus japonicus）等多种豆科植物中广泛存在
[29]。研究
[30]表明，CHR基因家族成员在豆科植物中表现出显著的物种特异性扩张，其存在与活性被认为是豆科植物能够大量积累异黄酮类化合物的关键遗传基础之一。实验直接证实了CHR在异黄酮合成中的不可或缺性，例如，在大豆发根体系中利用RNA干扰（RNAi）技术特异性敲低CHR基因的表达后，其根中的异甘草素及下游大豆苷元等异黄酮含量均出现急剧下降，充分证明了该酶在体内的关键生理功能
[31]。
3.3 查尔酮异构酶CHI
查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）是黄酮类化合物生物合成途径中的第二个关键酶，负责催化分子内的环化异构化反应。该酶通过高效催化无色的6'-羟基查尔酮（如柚皮素查尔酮）转化为相应的（S）-黄烷酮（如柚皮素），不仅生成了黄酮骨架的核心结构，而且极大地加速了此步反应速率，被认为是黄酮代谢通路中的关键限速步骤之一
[32]。因此，CHI基因的表达水平与活性直接调控着下游各类黄酮、黄酮醇及花青素等物质的积累量
[33]。另外，CHI功能具有多样性特征，研究者发现豆科植物中的一种CHI蛋白能够独特地催化6'-脱氧查尔酮（如异甘草素）转化为5-脱氧黄烷酮（如甘草素）
[34]，而当时已知的非豆科植物CHI均不具备此能力。CHI因此被分为两种功能类型，即I型CHI和II型CHI。I型CHI较为普遍，其存在于所有陆生植物中，且仅能催化6'-羟基查尔酮（如柚皮素查尔酮）异构化生成柚皮素
[35]；而II型CHI则仅存在于都可植物中，能够同时高效地催化6'-羟基查尔酮和6'-脱氧查尔酮两类底物，分别生成柚皮素和甘草素
[36]。目前，这两类CHI均已从多种植物中被成功克隆，如典型豆科植物的大豆
[37]（
Glycine max）与苜蓿
[38]（
Medicago sativa）等，以及非豆科植物矮牵牛
[39]（
Petunia hybrida）、玉米
[40]（
Zea mays）等。有研究
[41]表明，在极端环境药用植物水母雪兔子（
Saussurea medusa）中也鉴定出了CHI基因，这也在一定程度上说明CHI在植物抗逆过程中可能扮演着重要角色。
3.4 异黄酮合酶（IFS）
异黄酮合酶（isoflavone synthase，IFS）是异黄酮代谢分支途径中的标志性酶和定速酶，位于黄酮类化合物核心代谢网络的关键分支节点
[42]。它能特异性催化黄烷酮底物（如柚皮素、甘草素）发生2-羟基化及随后分子内的芳基迁移，从而将碳流导向异黄酮的合成，因此其活性是决定植物能否以及合成多少异黄酮的关键
[43]。IFS能分别以柚皮素和甘草素为底物，通过羟基化与重排反应，合成两种最基本也是最重要的异黄酮母核——5,7,4'-三羟基异黄酮（染料木素）和7,4'-二羟基异黄酮（大豆苷元）
[44]。以大豆（
Glycine max）为例，其基因组中含有两个功能冗余的IFS基因（GmIFS1和GmIFS2），它们的编码序列同源性高达92%
[45]。研究
[46]表明，以IFS基因编码的酶对甘草素的催化效率与亲和力更高，因此，与染料木素相比，IFS能够催化生成更多的大豆苷元，这在一定程度上解释了大豆中大豆苷元及其衍生物通常更为富集的现象。研究
[47]表明，在大豆毛状根体系中过表达GmIFS1基因，能够有效促进异黄酮的从头生物合成，导致其含量显著提升。
4 小结
黄芪作为我国传统中药材，其异黄酮类成分的药理活性已被广泛研究，然而其异黄酮生物合成途径的精细调控机制仍是一个复杂且值得深入探讨的问题。黄芪异黄酮的生物合成视阈苯丙氨酸代谢途径，通过多酶协同作用形成了独特的代谢网络。一方面，黄芪通过其特有的CHR-CHS功能耦合方式，为大豆苷元及其衍生物（芒柄花素、毛蕊异黄酮）的合成提供了专属路径，与大豆、苜蓿等其他豆科植物在异黄酮成分的合成方面产生了明显差异。另一方面，在黄芪异黄酮的合成过程中，（UFGT）催化的糖基化修饰不仅能提升异黄酮的水溶性与生物利用度，还可能参与其在植物体内的转运与储存调控，该修饰过程在黄芪药材的炮制及药效形成中可能具有关键作用，值得进一步深入研究。
在黄芪中异黄酮化合物的合成过程中涉及CHS、CHR、CHI、IFS四类关键酶，共同构成了黄芪异黄酮合成的“限速-导向-分支-定速”核心体系。CHS作为途径起始的限速酶，其活性受紫外线、病原菌侵染等环境胁迫的诱导，这为通过环境调控提升黄芪药材质量提供了理论依据。CHR作为异黄酮分支的导向酶，其在黄芪中的特异性表达是大豆苷元分支形成的关键，这与RNAi介导的CHR沉默导致异黄酮含量显著下降的实验结果高度一致，其在碳流分配中起着决定性作用。II型CHI宽大的活性口袋使其能够同时催化6'-羟基查尔酮与6'-脱氧查尔酮，为黄酮与异黄酮途径的协同调控提供了分子基础。IFS作为异黄酮合成的标志性定速酶，其对甘草素的偏好性催化解释了黄芪中大豆苷元衍生物占优的成分分布特征。
尽管目前对黄芪异黄酮合成途径已有较为系统的认识，但仍存在需要进一步研究阐释的问题，如：黄芪中IFS、CHR等关键酶的其催化机制尚不明确，限制了改造的可能性；异黄酮合成途径中多个节点的代谢流分配机制尚未完全阐明，尤其是芒柄花素与毛蕊异黄酮等不同异黄酮衍生物之间是否存在竞争关系；黄芪在应对不同环境胁迫时，异黄酮合成通路如何通过转录调控与表观遗传机制实现动态响应等，这些问题都有待进一步解析。
基于上述问题，在未来的研究中，可结合多组学技术（基因组、转录组、代谢组、蛋白组）与基因编辑手段，系统揭示黄芪异黄酮合成的全局调控网络，并在此基础上开展代谢工程与合成生物学研究，为高品质黄芪药材的定向培育与绿色制造提供理论依据与技术支撑。
国家自然科学基金面上项目(82173927)
黑龙江省“双一流”学科协同创新成果项目(LJGXCG2023-058)
黑龙江省博士后资助项目(LBH-Z20199)
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