马齿苋总生物碱的制备及其降尿酸作用研究

Research on the preparation of total alkaloids from purslane and their hypouricemic effect

摘要

目的 探讨马齿苋总生物碱降低尿酸的作用机制。 方法 选取60只雄性ICR小鼠，随机分为对照组（空白）、模型组（模型）、非布司他阳性药物组（Feb）、马齿苋生物碱高剂量组［ALK-H，0.58 g/（kg·d）］、中剂量组［ALK-M，0.29 g/（kg·d）］及低剂量组［ALK-L，0.145 g/（kg·d）］。检测各组小鼠血清尿酸（SUA）、肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）水平；收集肾脏组织样本，测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及核因子κB（NF-κB）蛋白表达量，检测血清黄嘌呤氧化酶（XOD）活性；HE染色法观察肾组织病理学变化；Western blot法检测肾组织中尿酸盐转运蛋白1（URAT1）、葡萄糖转运蛋白9型（GLUT9）、表皮生长因子受体（EGFR）、有机阴离子转运蛋白1（OAT1）及有机阴离子转运蛋白3（OAT3）蛋白表达水平。 结果 马齿苋生物碱可抑制黄嘌呤氧化酶活性、下调GLUT9、URAT1和EGFR蛋白或上调OAT1、OAT3蛋白的表达。 结论 马齿苋总生物碱降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平的作用机制可能与抑制尿酸生成、促进尿酸排泄、抑制炎症反应及增强抗氧化能力有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of the total alkaloids of purslane in lowering the uric acid levels. Methods Sixty male ICR mice were randomly divided into six groups: a control group (blank), a model group (model), a febuxostat positive drug group (Feb), a purslane alkaloid high-dose group (ALK-H, 0.58 g/kg/d), a medium dose group (ALK-M, 0.29 g/kg/d), and a low-dose group (ALK-L, 0.145 g/kg/d). The levels of serum uric acid (SUA), creatinine (CRE), and blood urea nitrogen (BUN) were measured in mice. The kidney issue samples were collected to detect the levels of malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) activity, and the protein expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB). The level of serum xanthine oxidase (XOD) activity was detected in the mice of each group. HE staining was used to observe the renal histopathological changes. Western blot was used to detect the expression levels of URAT1, GLUT9, EGFR, OAT1 and OAT3 proteins in renal tissue, and to explore the mechanism of ALK in reducing uric acid in hyperuricemia mice. Results The experimental results showed that the total alkaloids can reduce the level of SUA in hyperuricemia mice and has a certain protective effect on the kidney by inhibiting the xanthine oxidase activity, downregulating the expression of GLUT9, URAT1 and EGFR proteins, or upregulating the expression of OAT1 and OAT3 proteins. Conclusion The mechanism by which the total alkaloids of purslane reduce the serum uric acid levels in hyperuricemia mice may be related to reducing the uric acid synthesis, increasing the uric acid excretion, inhibiting inflammatory reactions and increasing antioxidant stress capacity.

Graphical abstract

关键词

马齿苋 / 降尿酸 / 尿酸盐转运蛋白1

Key words

purslane / lowering uric acid / urate transporter protein 1 (URAT1)

尿酸是内源性和外源性嘌呤的最终代谢产物，尿酸代谢生产过剩或肾脏排泄不足可导致高尿酸血症^[1-2]。马齿苋（Portulaca oleracea L.），又名马齿草、长寿菜等，广泛分布于热带和亚热带地区^[3]。马齿苋中含有有机酸、生物碱、黄酮类、萜类、香豆素类、挥发油类等多种化合物^[4]，具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗炎、镇痛、降尿酸等功能^[5]。马齿苋总生物碱降尿酸的作用机制鲜有报道。本研究制备了马齿苋总生物碱，探究其降尿酸作用机制，为马齿苋后续开发和应用提供数据支持。

1 材料

1.1 动物

60只SPF级ICR雄性小鼠[长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK（吉）-2020-0002]，体质量（20.0±2.0）g，在（20±2）℃、45%～55%相对湿度条件下饲养，自由饮水，适应性喂养1周后进行正式实验。

1.2 试剂

非布司他，美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；黄嘌呤氧化酶试剂盒、尿酸（UA）试剂盒、肌酐（Cr）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、尿素氮（BUN）试剂盒，南京建成生物制品研究所；尿酸盐转运蛋白1（URAT1）抗体、葡萄糖转运蛋白9型（GLUT9）抗体、表皮生长因子受体（EGFR）抗体、有机阴离子转运蛋白1（OAT1）抗体、有机阴离子转运蛋白3（OAT3）抗体、核因子κB（NF-κB）抗体，ABclonal Technology 有限公司。

2 实验方法

2.1 马齿苋总生物碱制备

取干马齿苋100 g，置于2 000 mL单颈烧瓶中，加入10倍体积pH5盐酸，超声提取（45 kHz，50℃）100 min，过滤，将提取液用浓氨水调至pH8～9，置于1 000 mL分液漏斗中，加入石油醚分2次萃取，弃石油醚层。将碱水层加入氯仿萃取，直至无颜色反应，每次30 min，回收氯仿，得生物碱。

2.2 马齿苋总生物碱含量测定

采用分光光度法基于生物碱与溴甲酚绿在酸性缓冲液中形成复合物，于634 nm 波长下测定吸光度，通过咖啡因标准曲线测定总生物碱含量。

2.3 动物分组及给药

选用SPF级雄性ICR小鼠60只，随机分成空白组、高尿酸血症模型组（hyperuricemia，HUA）、非布司他组[febuxostat，Feb，0.008 g/（kg·d）]、生物碱高剂量组[alkaloid high dose group，ALK-H，0.58 g/（kg·d）]、生物碱中剂量组[alkaloid medium dose group，ALK-M，0.29 g/（kg·d）]、生物碱低剂量组[alkaloid low dose group，ALK-L，0.145 g/（kg·d）]。给药方式为预防性给药，除空白组和高尿酸血症模型组外，其他各组均按相同剂量联合灌胃给药21 d。从第7天起，空白组腹腔注入生理盐水，其他组别小鼠腹腔注入次黄嘌呤[hypoxanthine，HX，0.3 g/（kg·d）]和氧嗪酸钾[oxonic acid potassium salt，OAPS，0.3 g/（kg·d）]，造模14 d，采集血液，摘取肝、肾、脾，进行相关生化指标检测。

2.4 血清尿酸和黄嘌呤氧化酶检测

末次给药1 h后，小鼠眼球取血，静置1 h，离心取上清（4℃，4 000 r/min，20 min）分别检测小鼠尿酸和黄嘌呤氧化酶水平，具体方法参照说明书进行。血尿酸检测波长为510 nm，黄嘌呤氧化酶检测波长为530 nm。

2.5 血肌酐和尿素氮检测

分别采用肌氨酸氧化酶法和脲酶法检测小鼠血清中肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）水平，具体方法参照说明书进行。血清中Scr检测波长为546 nm，BUN检测波长为640 nm。

2.6 超氧化物歧化酶和丙二醛检测

肾组织匀浆制备：取所需肾组织，按1:9比例用生理盐水在冰上裂解。匀浆液以3 500 rpm速度离心10 min，取上清液检测小鼠肾脏超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平。

2.7 HE染色观察肾脏组织病理学变化

取小鼠肾脏组织，置于4%多聚甲醛中固定72 h。依次脱水、浸透、包埋、切片、染色，中性树胶封片后在光学显微镜下观察。

2.8 Western blot试验

肾组织裂解液匀浆用10% SDS-PAGE分离，电转移到PVDF膜上；用5%脱脂牛奶在室温下封闭1.5 h；将PVDF膜与特异性一抗孵育并于4 ℃下孵育过夜；清洗膜，二抗室温作用1 h；采用Image J分析软件进行密度定量分析，并归一化到各自对照组。

2.9 统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，数据分析采用GraphPad Prism 8.0。通过单因素方差分析（ANOVA）检验组间统计学差异。定量数据以均值±标准差（\overline{x}±s）表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 马齿苋总生物碱含量测定

实验得出咖啡因标准品浓度C（mg/mL）与吸光度所得标准曲线方程为A=0.2745C-0.0011（r² = 0.999 5）表明咖啡因在0.1～1.1 mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，利用上述方法测得酸水提取法生物碱的平均吸光度为0.165，依据提取率公式计算得酸水提取法平均提取率为0.304%，通过使用D101大孔树脂对生物碱粗品进行精制纯化，最终测得纯化后生物碱含量为67.6%。

3.2 马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠血尿酸、肌酐和尿素氮的影响

本研究结果显示，与空白组比较，模型组小鼠血清尿酸水平显著升高（P＜0.001），表明高尿酸血症小鼠造模成功。与模型组比较，非布司他组尿酸水平显著降低（P＜0.001），生物碱中剂量和高剂量组显著降低了血清尿酸水平（P＜0.05），表明马齿苋总生物碱可以缓解次黄嘌呤联合氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症。CRE和BUN是反映肾脏损伤的重要指标。本研究结果显示，与空白组比较，模型组的CRE和BUN水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，生物碱中剂量组显著降低CRE和BUN水平（P＜0.05），表明马齿苋总生物碱可有效改善次黄嘌呤联合氧嗪酸钾诱导的小鼠肾脏损伤，见图1。

3.3 马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠超氧化物歧化酶、丙二醛和尿蛋白的影响

马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠肾脏超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影响结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肾脏SOD水平极显著降低（P＜0.001），表明次黄嘌呤联合氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠自由基清除能力下降。与模型组比较，生物碱中剂量和高剂量组SOD水平显著升高（P＜0.01），表明马齿苋总生物碱可以提高次黄嘌呤联合氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的自由基清除能力。丙二醛（MDA）数据显示，与空白组比较，模型组小鼠肾脏（MDA）水平显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，生物碱中剂量组小鼠肾脏MDA水平显著降低（P＜0.001）。尿蛋白（UPr）结果显示，与空白组比较，模型组小鼠UPr水平显著升高（P＜0.01），表明次黄嘌呤联合氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠出现肾脏损伤。与模型组比较，生物碱中剂量和高剂量组UPr水平均极显著降低（P＜0.01）。本研究结果表明，马齿苋总生物碱可通过减轻肾脏氧化应激的方式减轻肾脏损伤，对小鼠肾脏有一定的保护作用，见图2。

3.4 马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠黄嘌呤氧化酶的影响

黄嘌呤氧化酶（XOD）会催化黄嘌呤生成尿酸，故黄嘌呤氧化酶与尿酸的产生密切相关。本研究结果显示，与空白比较，模型组血清中黄嘌呤氧化酶水平显著升高（P＜0.001）。马齿苋总生物碱给药组均可显著降低血清和肝脏黄嘌呤氧化酶水平（P＜0.05或P＜0.001），表明马齿苋总生物碱降低尿酸产生的效果与抑制黄嘌呤氧化酶水平密切相关，见图3。

3.5 马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠肾组织病理变化的影响

HE结果显示，空白组肾脏结构正常，肾小球毛细血管袢结构清晰，系膜细胞未见增生，肾小管上皮细胞结构致密，未见明显变性；组织未见明显炎症细胞浸润。模型组肾组织损伤严重，间质可见大量炎症细胞灶性浸润，如红色箭头所示；肾小球系膜细胞增生，基底膜增厚，如黑色箭头所示；部分肾小管上皮细胞嗜碱性变，管腔结构不清晰，如黄色箭头所示。阳性药组肾组织结构基本正常，肾小球结构清晰，肾小管未见明显损伤。低中高剂量组损伤程度较模型组均有所改善，其中低剂量组治疗效果较差，部分肾小球毛细血管袢结构不清晰，肾小管上皮细胞嗜碱性变，如黄色箭头所示；间质炎症细胞数量减少，如红色箭头所示；中、高剂量组损伤程度进一步减轻，肾小球及肾小管基本正常，间质可见少量炎症细胞浸润，见图4。

3.6 马齿苋总生物碱对尿酸转运体蛋白表达的影响

肾脏中的尿酸转运体与尿酸的排泄密切相关。GLUT9和URAT1是小鼠和人类肾小管系统尿酸盐重吸收的主要介质，而OAT1和OAT3具有尿酸盐排泄功能。为了研究马齿苋总生物碱对高尿酸血症小鼠尿酸转运蛋白的影响，用Western blot法检测相关蛋白表达。本研究结果表明，与空白组比较，模型组EGFR、URAT1和GLUT9的蛋白水平显著升高（P＜0.01），OAT1和OAT3的蛋白水平显著降低（P＜0.01）；而经马齿苋总生物碱治疗后小鼠肾组织中EGFR、GLUT9和URAT1蛋白表达显著降低（P＜0.01），OAT1和OAT3蛋白表达显著升高（P＜0.01）。综上所述，马齿苋总生物碱可以通过调节相关肾脏尿酸转运蛋白表达促进尿酸排泄，见图5。

3.7 马齿苋总生物碱对炎症因子蛋白表达的影响

尿酸盐积累可以引起体内NF-κB含量升高，NF-κB是炎症反应的重要调控因子。本研究结果表明，与空白组比较，模型组NF-κB蛋白表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，非布司他组、生物碱中剂量和高剂量组NF-κB蛋白表达量均明显降低（P＜0.01），且生物碱高剂量组对NF-κB蛋白表达的影响优于非布司他组，见图6。

4 讨论

黄嘌呤氧化酶抑制剂是临床治疗高尿酸血症的一线药物。非布司他是临床常用的黄嘌呤氧化酶选择性抑制剂，作用于黄嘌呤氧化酶，抑制次黄嘌呤转化为黄嘌呤，达到抑制尿酸生成效果^[6]。本研究结果显示，马齿苋总生物碱可显著抑制血清中的黄嘌呤氧化酶活性，降低高尿酸血症小鼠血清中尿酸水平，提示马齿苋总生物碱降尿酸机制可能通过抑制黄嘌呤氧化酶活性，减少尿酸合成。尿酸排泄包括尿酸重吸收和尿酸分泌2个过程。尿酸转运蛋白在尿酸排泄中起重要作用。URAT1和GLUT9主要参与尿酸重吸收，OAT1和OAT3是促进肾尿酸排泄的重要转运蛋白^[7]。此外，研究^[8]表明EGFR在高尿酸血症发展中起到重要作用，下调EGFR的表达，会提高OAT1和OAT3的表达，是治疗高尿酸血症药物的主要靶点。本研究表明，经马齿苋总生物碱治疗后小鼠肾脏GLUT9、URAT1和EGFR蛋白表达水平显著降低，OAT1和OAT3表达水平显著升高，表明马齿苋总生物碱可通过减少尿酸重吸收和促进尿酸排泄的机制来治疗高尿酸血症。蛋白尿是肾脏疾病的重要特征，会引起细胞因子作用产生氧化物，会与尿蛋白中的蛋白质和胰岛样生长因子-1（IGF-1）结合，形成异常蛋白质，异常蛋白会诱导核转录因子（NF-κB）表达。NF-κB作为炎症反应的重要调控因子，调控很多前炎症细胞因子编码。对白细胞介素-2（IL-2）、IL-8和血管细胞黏附分子（VCAM）发挥重要调控作用，结果会导致细胞外基质增多，炎症加剧^[9]。本研究结果表明，经马齿苋总生物碱治疗后小鼠肾脏NF-κB蛋白表达水平显著降低，说明马齿苋总生物碱可以减轻高尿酸血症的肾脏炎症反应，对小鼠肾功能损伤有一定改善作用。

综上所述，马齿苋总生物碱可抑制黄嘌呤氧化酶活性、下调GLUT9、URAT1和EGFR蛋白或上调OAT1、OAT3蛋白表达，减少尿酸的合成和尿酸重吸收以及促进尿酸排泄，使尿酸含量降低。马齿苋总生物碱可减缓肾脏炎症反应，下调肾脏NF-κB蛋白表达，抑制炎症细胞因子反应，改善肾功能。

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基金资助

吉林市科技创新发展计划项目(20230103030)