芍药苷调控PI3K/Akt/mTOR通路对类风湿关节炎大鼠作用机制研究

The effect and mechanisms of paeoniflorin on the cartilage tissue in rats with rheumatoid arthritis based on regulating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

摘要

目的 基于磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路探讨芍药苷对类风湿关节炎大鼠软骨组织作用机制。 方法 60只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、PI3K抑制剂组、芍药苷组、芍药苷+PI3K激动剂组，每组12只。除空白组外，其余各组均造模。观察各组大鼠不同时间节点关节炎指数，番红固绿染色观察大鼠病理形态学，TUNEL检测大鼠软骨组织细胞凋亡，Western blot检测各组大鼠软骨组织中PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、ULK1、LC3、MMP-1、MMP-3蛋白表达，免疫组化检测大鼠软骨组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平。 结果 与模型组比较，芍药苷组和PI3K抑制剂组大鼠关节炎指数降低（P＜0.01），软骨组织细胞凋亡平均荧光强度升高（P＜0.01），PI3K、Akt、mTOR、MMP-1、MMP-3蛋白表达降低（P＜0.01），Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达升高（P＜0.01）。 结论 芍药苷能调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，调节软骨细胞凋亡和自噬，调节基质水解酶水平，保护关节软骨。

Abstract

Objective To observe the effect and mechanisms of paeoniflorin on the cartilage tissue in rats with rheumatoid arthritis based on the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into the blank group, the model group, the PI3K inhibitor group, the paeoniflorin group, and the paeoniflorin + PI3K agonist group, with 12 rats in each group. Except for the blank group, a rheumatoid arthritis model was established in the other groups. The arthritis index of rats was observed in each group at different time points, and the pathological morphology was observed by safranine green staining, while the apoptosis of cartilage tissue cells was detected by TUNEL, and the protein expression levels of PI3K, Akt, mTOR, Beclin1, ULK1, LC3, MMP-1, and MMP-3 in cartilage tissue were detected by Western blot in each group, and the protein expression levels of PI3K, Akt, and mTOR in cartilage tissue were measured by immunohistochemistry. Results Compared with the model group, the arthritis index of rats was significantly reduced in the paeoniflorin group and the PI3K inhibitor group (P<0.01), while the average fluorescence intensity of cartilage tissue cell apoptosis was significantly increased (P<0.01), and the protein expression levels of PI3K, Akt, mTOR, MMP-1, and MMP-3 in cartilage tissue of rats were significantly decreased (P<0.01), while the protein expression levels of Beclin1, ULK1, and LC3 were significantly increased (P<0.01). Conclusion Paeoniflorin can act on the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, regulate cartilage cell apoptosis and autophagy, regulate matrix hydrolases, thereby protect articular cartilage.

Graphical abstract

关键词

芍药苷 / 类风湿关节炎 / 软骨组织 / 磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

Key words

paeoniflorin / rheumatoid arthritis / cartilage tissue / phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR)

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）以关节疼痛、肿胀、僵硬为临床典型表现^[1]，发病率为0.5%～1.0%，女性高于男性，患者后期可能出现肢体功能障碍^[2]。研究^[3]表明，类风湿关节炎发病机制与免疫功能失衡、氧化应激、自噬等密切相关。PI3K/Akt/mTOR信号通路是重要的自噬调节途径之一。芍药苷为中药芍药的提取物之一^[4]，具有抗肿瘤、抗炎、护肝、神经保护、抗氧化等作用^[5-7]。本研究探讨芍药苷通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路改善类风湿关节炎大鼠软骨组织的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级健康雄性SD大鼠，60只，1.5～2个月龄，体质量约350 g，购于武汉华联科生物技术有限公司[SYXK（鄂）2023-0104]。大鼠饲养于武汉华联科生物技术有限公司，无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境中饲养。环境温度22～26℃，相对湿度50%～60%。所有大鼠适应性喂养1周后开始实验。本研究经过武汉华联科生物技术有限公司动物伦理委员会批准（HLK-20250616-001）。

1.2 主要试剂和仪器

肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（Bioswamp，RA20035）、白介素-6（IL-6）试剂盒（Bioswamp，RA20607）、白介素-10（IL-10）试剂盒（Bioswamp，RA201138）；RIPA裂解液（Beyotime，P0013D）、蛋白酶磷酸酶抑制剂（Beyotime，P1046）、苏木素染液（Siwega，S781）、5×蛋白上样缓冲液（Siwega，8190011128）；PI3K Rabbit抗体（abclonal，A22996）、Akt Rabbit抗体（三鹰，10176-2-AP）、mTOR Rabbit抗体（abclonal，A2445）、MMP-1 Rabbit抗体（Bioswamp，PAB58432）、MMP-3 Rabbit抗体（Bioswamp，RMAB49604）、Beclin1Rabbit抗体（Bioswamp，PAB47943）、ULK1 Rabbit抗体（三鹰，20986-1-AP）、LC3-ⅡRabbit抗体（Bioswamp，RMAB54400）、GAPDH mouse抗体（abcam，ab8245）、二抗Goat Anti-mouse IgG H&L （HRP）（abcam，AB6789）、Tunel试剂盒（Roche，11684817910）、抗荧光淬灭封片剂（Southern Biotech，SBA-0100-01）、DAPI（sigma，D9542）。

脱水机（DIAPATH，Donatello）、包埋机（武汉俊杰，JB-P5）、病理切片机（上海徕卡，RM2016）、组织摊片机（金华科迪，KD-P）、烤箱（天津莱玻瑞，GFL-230）、脱色摇床（Monad，TSY-B）、高速离心机（Beckman Coulter，Microfuge 26）、酶标仪（PerkinElmer，Enspire）、电泳仪（北京六一，DYY-6C）

1.3 模型制备

将60只大鼠随机分为空白组、模型组、PI3K抑制剂组、芍药苷组、芍药苷组+PI3K激动剂组，每组12只。空白组自由进食、饮水，不给予干预措施，其余各组均制作类风湿关节炎模型（采用Ⅱ型胶原诱导）。将牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂在冰上混合，于大鼠双侧足底部、膝关节、尾根部，分别注射0.1 mL混合乳剂；1周后，在同样的部位再次注射相同剂量混合乳剂，造模时间1周。当大鼠足部出现足趾红肿、关节肿胀时，对造模情况进行评估。参照关节炎指数（arthritis index，AI）标准^[8]分级：0分，未见红肿现象；1分，趾关节略肿，足爪区域见炎症反应；2分，关节轻度红肿，足底部、踝关节2个区域以上见炎症反应；3分，关节出现轻度功能障碍；4分，关节明显红肿，功能严重障碍。关节炎指数≥4分时为造模成功^[9]。

1.4 药物干预

造模成功后，芍药苷+PI3K激动剂组用芍药苷0.8 g/kg，PI3K激动剂1 mg/kg溶于3 mL 0.9%生理盐水中灌胃，每日1次；芍药苷组采用芍药苷0.8 g/kg，溶于3 mL 0.9%生理盐水中灌胃，每日1次；PI3K抑制剂组采用PI3K抑制剂1 mg/kg，溶于3 mL 0.9%生理盐水中灌胃，每日1次。各组用药周期4周。

1.5 观察指标

1.5.1 关节炎指数

于干预前、干预7 d、干预14 d、干预21 d、干预28 d，测量大鼠关节炎指数，具体评分参考1.3项下。

1.5.2 软骨组织形态结构

采血结束后，处死大鼠，取各组大鼠相同部位膝关节组织，将其分为2份，用液氮保存。其中1份甲醛固定后，浸蜡、包埋、切片。操作根据番红O-固绿染色试剂盒步骤进行，显微镜观察软骨与番红结合程度，并拍照取图。

1.5.3 软骨组织细胞凋亡检测

取膝关节组织石蜡切片，常规处理后参照TUNEL试剂盒说明书，先加入TUNEL，然后加入DAPI，避光染色，置于荧光显微镜下观察软骨细胞凋亡情况。

1.5.4 免疫组化检测PI3K、Akt、mTOR蛋白表达

取膝关节组织石蜡切片，经抗原修复，与3% H₂O₂反应，消除内源性过氧化物；透膜、封闭后，分别加入PI3K、Akt、mTOR一抗，低温孵育；隔日滴加山羊抗大鼠二抗，室温反应，滴入DAB显色，然后滴入苏木素染色，盐酸分化，放置在显微镜下进行观察。采用Image J测定平均光密度。

1.5.5 Western blot法检测PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、ULK1、LC3-Ⅱ、MMP-1、MMP-3蛋白表达

提取组织中总蛋白质。将蛋白质进行定量、上样、电泳分离、转膜、膜的封闭后，加一抗PI3K（1:1 000）、AKT（1:1 000）、mTOR（1:1 000）、Beclin1（1:1 000）、ULK1（1:1 000）、LC3-Ⅱ（1:1 000）、MMP-1（1:1 000）、MMP-3（1:1 000）、GAPDH（1:1 000）室温孵育1 h，PBS洗3次。稀释二抗（1:10 000），与膜室温孵育1 h。PBST洗涤3次，将膜放置在暗室中，发光液等量混匀，膜置于分析仪中检测，采用Image J分析灰度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。若数据符合正态分布，多组间比较，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析；若数据不符合正态分布，采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间节点关节炎指数变化情况

与空白组比较，模型组大鼠关节炎指数显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，21 d、28 d芍药苷+PI3K激动剂组大鼠关节炎指数降低（P＜0.05），芍药苷组和PI3K抑制剂组大鼠关节炎指数显著降低（P＜0.01）。见图1。

2.2 各组大鼠软骨组织病理形态

空白组，关节面完整光滑，软骨细胞排列整齐；模型组，关节软骨损伤，滑膜细胞排列紊乱；芍药苷+PI3K激动剂组，关节软骨轻度损伤，滑膜细胞排列紊乱，可见炎性细胞浸润；芍药苷组和PI3K抑制剂组，关节软骨损伤改善，滑膜细胞排列整齐。见图2。

2.3 各组大鼠软骨组织细胞凋亡比较

与空白组比较，模型组软骨组织细胞凋亡平均荧光强度明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，芍药苷+PI3K激动剂组，软骨组织细胞凋亡平均荧光强度升高（P＜0.05）；芍药苷组和PI3K抑制剂组软骨组织细胞凋亡平均荧光强度明显升高（P＜0.01）。见表1。

2.4 各组大鼠软骨组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达比较

检测PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、ULK1、LC3-Ⅱ、MMP-1、MMP-3蛋白表达结果显示，与空白组比较，模型组大鼠软骨组织PI3K、Akt、mTOR蛋白平均吸光度值明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，芍药苷+PI3K激动剂组，PI3K、Akt、mTOR蛋白表达平均吸光度值降低（P＜0.05）；芍药苷组和PI3K抑制剂组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达平均吸光度值明显降低（P＜0.01）。见图3，表2。

2.5 各组大鼠MMP-1、MMP-3蛋白表达比较

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中MMP-1、MMP-3蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，芍药苷+PI3K激动剂组，MMP-1、MMP-3蛋白表达水平降低（P＜0.05）；芍药苷组和PI3K抑制剂组MMP-1、MMP-3蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图4，表3。

2.6 各组大鼠Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达比较

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，芍药苷+PI3K激动剂组，Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达水平升高（P＜0.05），组间差异有统计学意义；芍药苷组和PI3K抑制组Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。见图5，表4。

2.7 各组大鼠PI3K、Akt和mTOR蛋白表达比较

与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，芍药苷组和PI3K抑制剂组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；芍药苷+ PI3K激动剂组，PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平降低（P＜0.05）。见图6，表5。

3 讨论

类风湿关节炎属中医学“痹病”范畴，又称为“顽痹”。类风湿关节炎多为机体正气不足，外感风寒湿邪所致，临床多以养血止痛、调和营卫为治疗大法。白芍，性苦酸、微寒，能活血止痛，广泛使用于类风湿关节炎临床治疗中^[10]。芍药苷为白芍的成分之一，具有抗炎、抗骨质疏松、镇痛等作用^[11]。自噬在自身免疫系统疾病中发挥重要作用^[12-13]。研究^[14-15]表明，机体免疫能力下降，自噬通路受到抑制，软骨细胞大量凋亡，从而加速类风湿关节炎的病程。因此，从自噬角度寻找治疗类风湿关节炎的靶点药物具有可行性，调控自噬通路可能是治疗类风湿关节炎的关键环节。

李楠等^[16]研究发现桂枝芍药知母汤能抑制小鼠软骨组织中MMP-1、MMP-3表达水平，保护关节软骨，其机制与JAK2/STAT3信号通路有关。徐海涛等^[17]研究显示，芍药舒筋片可以通过调节甲基化修饰水平来调节miR-140表达水平，保护膝骨关节炎大鼠软骨细胞。暴丁溯等^[18]研究发现，芍药甘草附子汤可显著缓解膝骨关节炎患者膝关节疼痛症状，激活自噬，抑制细胞凋亡。基质金属蛋白酶（MMP-1）和基质金属蛋白酶（MMP-3）是能降解骨质和骨基质的重要水解酶，可直接参与骨关节破坏^[19]。MMP-1能降解Ⅱ型胶原蛋白，削弱软骨基质的保护作用，MMP-3能激活其他蛋白水解酶，降解软骨和骨质^[20]。本研究结果显示，模型组大鼠番红固绿染色关节软骨损伤，MMP-1、MMP-3蛋白表达明显升高，经芍药苷处理后，关节软骨损伤改善，MMP-1、MMP-3蛋白表达降低；TUNEL检测显示，芍药苷能调节软骨细胞凋亡水平。

自噬是真核细胞体内的生物过程，根据细胞所处环境，将细胞质内物质运送到溶酶体进行降解，其涉及多种信号通路，是一种高度调控的生理过程。自噬与类风湿关节炎的发生、发展密切相关^[21]。肖莉等^[22]研究发现，芍药苷能调控自噬通路，改善小梁网细胞功能障碍。何芳等^[23]研究发现，芍药苷通过抑制STAT3蛋白磷酸化，抑制炎症因子表达，改善哮喘中细胞氧化应激和自噬效应。代鑫等^[24]研究发现，芍药苷激活AMPK/mTOR信号通路，减轻溃疡性结肠炎小鼠的炎症损伤。Beclin-1是一种自噬调节因子，能促进自噬体双层膜形成，在自噬早期阶段起关键作用^[25-27]。LC3是典型的自噬标志性蛋白，通常以LC3-Ⅰ的形式存在，当自噬被激活时，LC3-1裂解为LC3-Ⅱ，因此，可以通过LC3-Ⅱ水平来评估自噬水平高低^[28-30]。unc-51样激酶1（ULK1）是一种自噬起始酶，其复合物能刺激Beclin-1，在自噬中发挥重要作用^[31]。本研究结果发现，模型组Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达明显降低，芍药苷处理后，Beclin1、ULK1、LC3蛋白表达明显升高，表明芍药苷能调节自噬水平。

卓涛等^[32]发现，九味健步饮含药血清可抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路，减轻炎症，减少软骨细胞凋亡。樊琼等^[33]研究发现，黄芩苷可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进神经胶质瘤细胞U251凋亡与自噬，具有抑制胶质瘤的作用。PI3K/Akt/mTOR是重要的自噬信号通路。当PI3K活化时，其促使底物磷脂酰肌醇磷酸化PIP3，同时激活Akt。mTOR为自噬的关键负调节因子^[34]。研究^[35]显示，在膝骨关节炎所致的关节炎症大鼠模型中存在软骨细胞减少、凋亡增多、自噬相关蛋白增多、PI3K/Akt/mTOR相关通路蛋白的表达水平降低，表明软骨细胞减少以及PI3K/Akt/mTOR信号通路表达异常可能是关节红肿疼痛等炎性症状的内在机制。在急性痛风性关节炎模型大鼠体内，黄芩清热除痹胶囊改善关节肿胀的作用机制可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关^[36]。因此，我们推测芍药苷能改善类风湿关节炎模型大鼠关节炎症，其机制与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达有关。本研究Western blot和免疫组化结果显示，模型组大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白水平明显升高，表明模型组激活了PI3K/Akt/mTOR通路。经芍药苷处理后，PI3K、Akt、mTOR蛋白水平降低，表明芍药苷抑制激活的PI3K/Akt/mTOR通路；芍药苷和PI3K激动剂共同作用后，PI3K、Akt、mTOR蛋白水平明显降低；单一PI3K抑制剂处理后，PI3K、Akt、mTOR蛋白水平明显降低。

综上所述，芍药苷能够改善类风湿关节炎大鼠关节炎症，其机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。本研究结果丰富了芍药苷治疗类风湿关节炎的理论基础，可为临床治疗类风湿关节炎提供理论依据。

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基金资助

湖北省中医药管理局中医药重大项目(ZY2025Z014)

武汉市卫生计生科研基金资助(WZ24Q02)

武汉市蔡甸区人民医院院内科研项目(XHJBYYKXYJJJ-QNXM-05)

武汉市蔡甸区人民医院院内科研项目(XHJBKXYJJJ-MSXM-03)