基于SphK1/S1P/S1PR1信号通路探讨针刺治疗脑缺血再灌注损伤大鼠效果

Efficacy of acupuncture in the treatment of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury based on the SphK1//S1P/P/S1PR1 pathway

摘要

目的 基于鞘氨醇激酶1（SphK1）/1-磷酸鞘氨醇（S1P）/鞘氨醇1磷酸酯受体1（S1PR1）通路，探讨针刺对脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠模型的疗效。 方法 将40只雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、针刺+Sphk1激动剂组，各10只。模型组、针刺组、针刺+Sphk1激动剂组构建脑缺血再灌注损伤模型。造模后，针刺组予针刺干预，针刺+SphK1激动剂组在针刺基础上腹腔注射K6PC-5，连续15 d。干预结束后，采用Western blot法检测各组脑组织中SphK1、S1P、S1PR1及凋亡相关蛋白（Bax、Bad）表达水平；TUNEL法检测神经细胞凋亡情况；评估各组神经功能缺损评分，并测量各组脑梗死面积与脑含水量。 结果 与假手术组比较，模型组、针刺组、针刺+Sphk1激动剂组第1、5、10、15天神经功能缺损评分均显著降低（P＜0.05），针刺组高于模型组（P＜0.05），针刺+SphK1激动剂组低于针刺组（P＜0.05）。模型组、针刺组、针刺+SphK1激动剂组SphK1/S1P/S1PR1通路蛋白及Bax、Bad表达水平，神经细胞凋亡数量均显著高于假手术组（P＜0.05），针刺组低于模型组（P＜0.05），针刺+SphK1激动剂组高于针刺组（P＜0.05）。模型组、针刺组、针刺+SphK1激动剂组脑梗死面积与脑含水量均高于假手术组（P＜0.05），针刺组低于模型组（P＜0.05），针刺+SphK1激动剂组高于针刺组（P＜0.05）。 结论 针刺可能通过抑制SphK1/S1P/S1PR1信号通路，下调促凋亡蛋白Bax与Bad的表达，减少神经细胞凋亡，减轻脑梗死与脑水肿，改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能缺损。

Abstract

Objective To explore the efficacy of acupuncture in the treatment of rat models of cerebral ischemia-reperfusion injury (CIRI) based on the sphingosine kinase 1 (SphK1)/sphingosine 1 phosphate (S1P)/sphingosine 1 phosphate receptor 1 (S1PR1) pathway. Methods Forty male rats were assigned randomly to four groups (n=10): sham operation group, model group, acupuncture group, and acupuncture + SphK1 agonist group. The CIRI rat models were established in all groups except the sham operation group. The rats in the acupuncture group were treated with acupuncture, while the rats in the acupuncture + SphK1 agonist group were treated with acupuncture and SphK1 agonist K6PC-5, both for 15 days. After the intervention, Western blot was used to detect the expression levels of SphK1, S1P, S1PR1 and apoptosis-related proteins (Bax, Bad) in the four groups to assess the degree of neurological damage in the rats. The TUNEL assay was used to detect neuronal apoptosis. The neurological deficit scores of each group were evaluated, and the cerebral infarction area and brain water content were measured in the model group, acupuncture group, and acupuncture + SphK1 agonist group. Results Compared with the sham group, the other three groups showed significantly reduced scores on days 1, 5, 10, and 15 (P<0.05). The acupuncture group scored higher than the model group (P<0.05), while the acupuncture + SphK1 agonist group scored lower than the acupuncture group (P<0.05). The SphK1/S1P/S1PR1 pathway protein levels, Bax and Bad expression, and neuronal apoptosis counts in the model group, acupuncture group, and acupuncture + SphK1 agonist group were all significantly higher than those in the sham group (P<0.05), and the acupuncture group showed lower scores than the model group (P<0.05), while the acupuncture + SphK1 agonist group had higher levels than the acupuncture group (P<0.05). The cerebral infarction area and brain water content in the model group, acupuncture group, and acupuncture + SphK1 agonist group were all greater than those in the sham group (P<0.05), while the two indicators in the acupuncture group were lower than the model group (P<0.05), and the acupuncture + SphK1 agonist group exceeded the acupuncture group in both metrics (P<0.05). Conclusion Acupuncture can down-regulate the expression of Bax and Bad, reduce neurocyte apoptosis, cerebral infarction and cerebral edema, and finally improve neurological dysfunction in CIRI rats, which may be related to the inhibition of the SphK1/S1P/S1PR1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

脑缺血再灌注损伤 / 针刺 / 凋亡

Key words

cerebral ischemia-reperfusion injury / acupuncture / apoptosis

脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）是指脑组织在经历缺血后，因血流恢复而引发更严重损伤的病理过程^[1]。研究^[2]显示，针刺能够有效改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺损。鞘氨醇激酶1（SphK1）/1-磷酸鞘氨醇（S1P）/鞘氨醇1磷酸酯受体1（S1PR1）信号通路在缺血再灌注损伤中扮演重要角色^[3]。本研究以SphK1/S1P/S1PR1通路为切入点，探讨针刺对脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经功能恢复及神经细胞凋亡的影响，报道如下。

1 材料和方法

1.1 大鼠

SPF级雄性SD大鼠40只来源于黑龙江中医药大学[合格号：SCXK（黑）2023-001]，平均体质量204.2～221.8 g，给予12 h/12 h昼夜交替照明，室温（22.5±1.5）℃，湿度60%～70%，无菌饲料、无菌水，自由饮食。本研究经黑龙江中医药大学附属第二医院伦理委员会批准（202300011）。

1.2 主要试剂

兔一抗β-actin（ab8227）、SphK1（ab71700）、S1P（ab233396）、S1PR1（ab11424）、Bad（ab32445）、Bax（ab32503），英国abcam公司；兔二抗（SA00001-2），美国Proteintech公司；RIPA裂解液（R0020）、2%TTC溶液（T8170），北京索莱宝公司；BCA蛋白定量试剂盒（P0012）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1086），上海碧云天公司；SphK1激动剂K6PC-5（HY-50710），美国MCE公司。

1.3 方法

1.3.1 脑缺血再灌注损伤大鼠造模

大鼠经2%异氟烷麻醉，然后颈部剃毛。碘伏消毒，于大鼠颈部2块腺体之间作1 cm长切口。先后暴露右颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。以手术线结扎ECA近心端，以止血夹夹住CCA、ICA，在血管下方预留1根手术线。从ECA远心端插入MCAO栓线并固定。剪断ECA末端，将栓线缓慢插入，栓线无法前进时停止。2 h后，缓慢抽出栓线以使血流再灌注，然后缝合伤口。模型组、针刺组、针刺+SphK1激动剂组大鼠均按上述操作造模；假手术组大鼠不插入栓线，其余如前。造模方法参考文献[4]完成。

1.3.2 大鼠分组、治疗和给药

大鼠适应性饲养1周后，随机分为假手术组、模型组、针刺组、针刺+ SphK1激动剂组，各10只。造模成功后立即开始相应干预。针刺组与针刺+SphK1激动剂组大鼠接受相同针刺处理。参照文献[5]方法，首先以酒精灯火焰消毒针刺针（规格0.40 mm×13 mm）约15 s，随后针刺百会（斜刺，深度2 mm）、风池（直刺，深度2 mm）、三阴交（直刺，深度4 mm）、合谷（直刺，深度1 mm）、足三里与阳陵泉（直刺，深度6 mm）。每日治疗1次，每次留针30 min，手法采用平补平泻。每连续治疗3 d为1个疗程，疗程间休息2 d，共进行3个疗程。针刺+SphK1激动剂组大鼠在针刺治疗基础上，于治疗日每日腹腔注射SphK1激动剂K6PC-5（剂量0.05 mg/kg）。假手术组与模型组大鼠则在相同时点腹腔注射等体积生理盐水。

1.3.3 神经功能评分

大鼠苏醒后及术后第1、5、10、15天采用Garcia复合评分法^[6]进行神经功能评估。该评分体系包含多项行为学指标，总分值为18分，其得分与神经功能的恢复程度呈正相关。

1.3.4 Western blot

取80 mg大脑皮层组织，加RIPA裂解液裂解30 min。然后于4°C、10 000 r·min^-1离心30 min以获取蛋白上清。通过BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经过SDS-PAGE电泳分离、转印至PVDF膜上。膜先后与5%脱脂奶粉、一抗溶液（1:1 000）、二抗溶液（1:5 000）在室温下孵育2 h。最后，对膜上的蛋白条带进行曝光显影。

1.3.5 TUNEL细胞凋亡检测实验

取大鼠脑组织并切取皮层，用4%多聚甲醛固定10 min。之后用磷酸盐缓冲液清洗5 min，加入羊血清在室温下孵育2 h。TUNEL染色反应参照试剂盒说明书执行，以标记凋亡细胞。最后采用DAPI进行细胞核复染，封片后在荧光显微镜下观察并采集图像，使用Image软件定量分析神经细胞凋亡情况。

1.3.6 脑梗死面积

取模型组、针刺组、针刺+ SphK1激动剂组大鼠脑组织，沿冠状位切片，约2 mm厚度。将切片浸泡于2% TTC溶液中染色30 min，再将切片浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h。在显微镜下拍照，计算脑梗死面积。

1.3.7 脑含水量

取模型组、针刺组、针刺+SphK1激动剂组大鼠脑组织并直接称量湿重。然后将脑组织置于90℃烘箱内烘干直至质量不再变化，此时称量脑组织质量为干重。

1.4 统计学方法

采用Graphpad Prism 8.0处理数据。计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，对于符合正态性和方差齐性的数据，采用单因素方差分析或t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

与假手术组相比，其余3组在观察期内神经功能评分均较低（P＜0.05）。从第5天起，针刺组的评分显著高于模型组（P＜0.05）。联合使用SphK1激动剂后，此改善作用被显著削弱（P＜0.05）。见表1。

2.2 Western blot结果

Western blot检测结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠SphK1/S1P/S1PR1信号通路及其下游促凋亡蛋白Bax、Bad的表达均被激活（P＜0.05）。针刺组上述蛋白表达水平显著低于模型组（P＜0.05）。联合使用SphK1激动剂则逆转了针刺抑制效应，针刺+SphK1激动剂组的蛋白表达水平回升，高于针刺组（P＜0.05）。见图1，表2。

2.3 TUNEL凋亡实验结果

模型组、针刺组、针刺+SphK1激动剂组大鼠的神经细胞凋亡数量均高于假手术组（P＜0.05）。针刺干预显著降低了神经细胞凋亡数量（P＜0.05）；联合使用SphK1激动剂后，针刺所减少的凋亡数量回升（P＜0.05）。见图2，表3。

2.4 各组脑梗死面积和脑含水量比较

与假手术组相比，模型组、针刺组及针刺+SphK1激动剂组大鼠脑梗死面积和脑含水量均显著增加（P＜0.05）。针刺治疗能有效降低模型大鼠的脑梗死面积和脑含水量（P＜0.05）；加用SphK1激动剂后，此治疗效应被部分逆转，该组脑梗死面积和脑含水量均高于针刺组（P＜0.05）。见图3，表4。

3 讨论

目前，临床防治脑缺血再灌注损伤手段有限。脑缺血再灌注损伤高致残率与病死率严重威胁患者健康。为探究脑缺血再灌注损伤发病机制，本研究成功构建了具有损伤小、易操作且贴近人体病理特点的脑缺血再灌注损伤大鼠模型^[7]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分显著降低，并伴随脑梗死面积、脑含水量及神经细胞凋亡数量的增加。针刺干预仅5 d便显著改善了神经功能，并有效减小了脑梗死面积、降低脑含水量及减少细胞凋亡，这验证了该模型的可靠性并与既往研究^[8]一致。以上结果表明，针刺对脑缺血再灌注损伤具有确切的神经保护作用，为后续机制研究提供了实验基础。

大量炎症因子的释放在脑缺血再灌注损伤进展过程中进一步加剧神经细胞凋亡^[9]。百会、风池、三阴交等穴位具有减轻神经损伤、促进功能修复的作用。神经细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤核心病理环节之一，Bax与Bad作为关键促凋亡蛋白，其表达水平与细胞凋亡程度密切相关^[10-11]。本研究结果显示，模型组、针刺组及针刺+SphK1激动剂组大鼠神经细胞凋亡数量及脑组织中Bax、Bad蛋白表达均显著高于假手术组；针刺干预可有效下调上述蛋白表达，该效应在联合SphK1激动剂K6PC-5后被部分逆转。这表明针刺可能通过抑制Bax、Bad等促凋亡蛋白的表达，减少神经细胞凋亡，发挥神经保护作用。

脂质酶SphK1表达可诱导S1P表达升高，而S1P可与S1PR1结合，从而共同调节机体炎症反应^[12]。SphK1/S1P/S1PR1通路作为调控炎症与凋亡的关键信号轴，在多种疾病模型中均显示出重要功能。研究表明，抑制SphK1/S1P/S1PR1通路可改善小鼠自身免疫性甲状腺炎^[13]和急性肝损伤相关的炎症反应^[14]，并可降低心肌缺血再灌注损伤中心肌炎症因子释放^[5]。近年来，该通路在神经系统疾病中的作用也日益受到关注^[15]。范茹莉等^[16]研究发现血根碱可通过阻断SphK1/S1P通路发挥对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用，SphK1激动剂可部分逆转该效应。本研究发现，针刺能显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中SphK1/S1P/S1PR1通路表达水平，并伴随神经功能改善；联合使用SphK1激动剂K6PC-5后，针刺保护作用被部分削弱。本研究结果提示，上调SphK1/S1P/S1PR1通路可能促进脑缺血再灌注损伤进展，针刺治疗可通过抑制该通路，缓解脑组织损伤。

综上所述，针刺可能通过抑制SphK1/S1P/S1PR1信号通路，下调促凋亡蛋白Bax与Bad的表达，减少神经细胞凋亡，进而缩小脑梗死面积、降低脑含水量，改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损。本研究为阐释针刺治疗脑缺血再灌注损伤的分子机制提供了实验依据，也为临床推广应用提供了一定的理论参考。

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基金资助

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(13241935)