清脾除湿饮含药血清对寻常型天疱疮细胞模型Dsg3内吞及STAT3磷酸化蛋白表达的影响

Effects of Qingpi Chushi Decoction medicated serum on the protein expression of Dsg3 endocytosis and STAT3 phosphorylation in a cellular model of pemphigus vulgaris

摘要

目的 探讨清脾除湿饮含药血清对寻常型天疱疮（PV）细胞模型Dsg3内吞及STAT3磷酸化的影响。 方法 制备清脾除湿饮含药血清并确定其最佳干预浓度。采用抗Dsg3单抗孵育HaCaT细胞构建PV细胞模型，将细胞分为空白组、模型组及中药组。干预24 h后，采用细胞解离实验观察细胞碎片数量，免疫荧光法检测细胞表面Dsg3荧光染色模式，Western blot检测Dsg3总蛋白、Triton X-100可溶性Dsg3及p-STAT3/STAT3蛋白表达水平。 结果 5%清脾除湿饮含药血清为最佳干预浓度。与空白组比较，模型组细胞碎片数明显增多；细胞表面Dsg3连续线状荧光部分断裂、不连续，并向细胞内聚集；Dsg3总蛋白水平降低，Triton X-100可溶性Dsg3及p-STAT3/STAT3蛋白水平升高。与模型组比较，中药组细胞碎片数明显减少，Dsg3荧光模式恢复，Dsg3总蛋白水平升高，Triton X-100可溶性Dsg3及p-STAT3/STAT3蛋白水平降低。 结论 清脾除湿饮含药血清可通过抑制Dsg3内吞及STAT3蛋白磷酸化，从而减轻PV细胞模型棘层松解。

Abstract

Objective To investigate the effects of Qingpi Chushi Decoction medicated serum on Dsg3 endocytosis and STAT3 phosphorylation in a cellular model of pemphigus vulgaris (PV). Methods The medicated serum of Qingpi Chushi Decoction was prepared, and its optimal concentration was determined. A PV cell model was established by incubating HaCaT cells with an anti-Dsg3 monoclonal antibody, and the PV cells were divided into three groups: blank control group, model group, and traditional Chinese medicine (TCM) group. After 24 hours of intervention, a cell dissociation assay was performed to count cell fragments, and immunofluorescence staining was used to observe the distribution pattern of cell surface Dsg3, while Western blot was applied to detect the protein levels of total Dsg3, Triton X-100-soluble Dsg3, and p-STAT3/STAT3. Results The 5% concentration of Qingpi Chushi Decoction medicated serum was identified as the optimal intervention concentration. Compared with the blank control group, the model group exhibited a significantly increased number of cell fragments; the continuous linear fluorescence staining of cell surface Dsg3 was partially disrupted and discontinuous, with Dsg3 internalized into cytoplasm. Additionally, the total Dsg3 protein level was decreased, while the levels of Triton X-100-soluble Dsg3 and p-STAT3/STAT3 were increased in the model group. Compared with the model group, the TCM group showed a significant reduction in cell fragments, a restored Dsg3 immunofluorescence pattern, an elevated total Dsg3 protein level, and decreased levels of Triton X-100-soluble Dsg3 and p-STAT3/STAT3. Conclusion The medicated serum of Qingpi Chushi Decoction alleviates acantholysis in the PV cell model, at least in part, by inhibiting Dsg3 endocytosis and STAT3 phosphorylation.

Graphical abstract

关键词

寻常型天疱疮 / Dsg3 / 棘层松解 / p-STAT3 / 清脾除湿饮

Key words

pemphigus vulgaris / desmoglein 3 (Dsg3) / acantholysis / p-STAT3 / Qingpi Chushi Decoction

寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris，PV）是一种严重危及生命的自身免疫性大疱性皮肤病，临床特征为皮肤及（或）黏膜出现广泛的松弛性水疱或大疱^[1]。患者自身抗体与表皮或黏膜上皮细胞表面抗原结合，导致棘层松解、细胞间黏附丧失，进而形成表皮内水疱^[2]。PV自身抗体主要为抗桥粒芯糖蛋白3（desmoglein 3，Dsg3）抗体及抗桥粒芯糖蛋白1（desmoglein 1，Dsg1）抗体。目前治疗手段包括糖皮质激素、免疫抑制剂、利妥昔单抗、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换及免疫吸附等^[3-4]，但均伴有不同程度的不良反应。《验方新编·卷二十四》载清脾除湿饮主治心火脾湿证天疱疮^[5]。多项研究^[6-7]表明，清脾除湿饮治疗PV心火脾湿证具有显著临床疗效，但其具体作用机制尚不明确。研究显示，信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是调控角质形成细胞（keratinocyte，KC）Dsg3转录的关键转录因子^[8]，可能参与PV棘层松解的病理过程。本研究通过构建PV细胞模型，探讨清脾除湿饮含药血清对Dsg3内吞及STAT3磷酸化的影响，以期阐明其抑制PV棘层松解的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞系

BALB/c小鼠，SPF级，雌性，8周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司湖北分公司[许可证号：SCXK（鄂）2022-0030]。本实验经武汉华联科生物技术有限公司实验动物福利与伦理审查批准（HLK-20241223-002）。HaCaT细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 药物及主要试剂

清脾除湿饮组方：茯苓、连翘、苍术、白术、泽泻、黄芩、淡竹叶、栀子、茵陈、麦冬、枳壳、甘草各10 g，生地黄15 g。10%胎牛血清、DMEM培养基、AK23（日本MBL公司）、DispaseⅡ、4%～20% Bis-tris预制胶、MOPS电泳缓冲液、鼠抗人Dsg3单抗（美国Thermo Fisher Scientific）、兔抗人STAT3单抗、兔抗人磷酸化STAT3单抗（Tyr705）（成都正能生物技术有限责任公司）、RIPA裂解液、Triton X-100裂解液、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG、FITC标记山羊抗小鼠IgG、Cy3标记山羊抗小鼠IgG（武汉爱博泰克生物科技有限公司）。

1.1.3 实验仪器

倒置显微镜、倒置荧光显微镜（日本Nikon公司），凝胶成像仪（美国Bio-rad公司，Chemi DocTM XRS+），酶标仪（美国Molecular Devices公司），电泳仪（美国Bio-rad公司，Mini-PROTEAN 3 Cell）。

1.2 实验方法

1.2.1 清脾除湿饮含药血清的制备

将8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠随机分为清脾除湿饮组和生理盐水组，每组15只。清脾除湿饮组给药剂量为17.55 g/（kg·d）（按“人与动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算），以0.877 g/mL药液灌胃；生理盐水组灌胃等量生理盐水。连续7 d，每日1次。末次灌胃后禁食4 h，摘眼球取血，室温静置30 min后离心（1 500 rpm，15 min）分离血清，56℃水浴灭活30 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装于无菌EP管中，-80℃保存备用。

1.2.2 CCK-8法检测HaCaT细胞增殖活性以确定清脾除湿饮含药血清最佳干预浓度

取对数生长期HaCaT细胞，以5×10³个/孔接种于96孔板，每孔100 μL，于37℃、5% CO₂培养箱中培养过夜。空白孔以PBS填充。弃去原培养基，分别加入含不同浓度清脾除湿饮含药血清的完全培养基，每组设3个复孔；空白组为正常培养的细胞。继续孵育24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，混匀后继续孵育2 h。采用酶标仪测定450 nm处吸光度（OD）值。细胞增殖率（%）=[（实验组OD值-空白孔OD值）/（空白组OD值-空白孔OD值）]×100%。

1.2.3 细胞建模及实验分组

采用AK23（一种致病性抗Dsg3单克隆抗体）与HaCaT细胞共培养，建立体外PV细胞模型。AK23使用浓度为1 μg/mL^[9]。实验分为空白组（5%生理盐水组血清+DMEM培养基）、模型组（AK23+5%胎牛血清DMEM培养基）、中药组（AK23+5%清脾除湿饮含药血清+DMEM培养基），共培养24 h后收集细胞进行后期检测。每组设3个复孔。

1.2.4 细胞解离实验

将HaCaT细胞接种于24孔板，培养至融合度约80%后更换培养基，37℃继续培养24 h。PBS洗涤细胞2次，每孔加入1 mL含2 U/mL Dispase Ⅱ的溶液，孵育30 min使细胞单层自然脱落。保持细胞间连接完整，轻柔吸弃Dispase II溶液，以10 μM噻唑蓝四唑溴化铵处理30 min标记活细胞。采用电动移液管施加恒定剪切力促使细胞解离，倒置显微镜下观察、拍照并统计细胞碎片数量。

1.2.5 免疫荧光检测

取对数生长期HaCaT细胞接种于铺有细胞爬片的24孔板中，待细胞融合至50%时进行干预处理，24 h后PBS清洗2次，依次以4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100透化、5% BSA室温封闭、随后进行一抗及二抗孵育，PBS洗涤后，将爬片细胞培面朝下覆盖于滴加抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）的载玻片上。倒置荧光显微镜下观察并记录Dsg3荧光染色模式。

1.2.6 蛋白提取及Western blot检测

冷PBS清洗细胞2次后，分别加入RIPA裂解液及Triton X-100裂解液，冰上裂解20 min后提取蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，变性处理后依次进行上样、电泳、转膜、快速封闭、一抗及二抗孵育、显影等步骤，应用ImageJ软件分析条带平均灰度值。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism 8.0.1软件作图。计量资料以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 清脾除湿饮含药血清对HaCaT细胞增殖活性的影响

与空白组比较，10%、20%、30%、40%清脾除湿饮含药血清抑制HaCaT细胞增殖（P＜0.05），可能对细胞产生毒性作用。因此以5%清脾除湿饮含药血清浓度进行后续实验。如图1。

2.2 清脾除湿饮含药血清可抑制PV细胞模型细胞间失黏附

如图2。

2.3 清脾除湿饮含药血清可抑制PV细胞模型Dsg3内吞

如图3。

2.4 清脾除湿饮含药血清对PV细胞模型Dsg3蛋白水平的影响

如图4。

2.5 清脾除湿饮含药血清对PV细胞模型STAT3磷酸化蛋白水平的影响

如图5。

3 讨论

PV患者体内抗Dsg自身抗体与表皮抗原结合，可促使Dsg空间构象改变^[10]，激活细胞内信号传导通路^[11]，诱导细胞间黏附丧失，最终导致棘层松解及表皮内水疱形成。系统应用激素虽可缓解病情，但易引起多种不良反应；激素联合免疫抑制剂起效较慢、临床复发率高等问题^[12]。利妥昔单抗已被推荐为中度至重度天疱疮的一线治疗方案^[13]，研究^[14-15]显示激素联合利妥昔单抗较联合吗替麦考酚酯可获得更高的持续完全缓解率，且激素减量更快。然而，利妥昔单抗亦可引起B细胞耗竭、机会性感染^[16]、补体活化水平降低及耐药性等不良反应^[17]。清脾除湿饮治疗PV有助于减少激素用量、降低其不良反应^[18]。该方以茯苓、连翘为君药，研究^[19]表明茯苓多糖可升高环磷酰胺诱导免疫抑制大鼠的免疫器官指数及血清IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ水平，从而增强免疫功能；连翘可通过调控炎症因子及MAPK、NF-κB^[20]、JAK/STAT^[21-22]等信号通路发挥抗炎作用。因此，深入探究清脾除湿饮治疗PV的作用机制，对临床“态靶辨治”具有重要理论意义。

研究^[23]表明，Dsg3敲除的HaCaT细胞对PV-IgG诱导的细胞黏附丧失具有保护作用。本研究显示，与空白组比较，模型组细胞碎片数明显增多；Dsg3荧光染色呈不连续模式，与既往报道一致^[24]；Dsg3总蛋白表达降低，与蛋白内化后降解相关；在抗Dsg3单抗作用下，Dsg3结构可能松动并从细胞骨架解离，溶解于Triton X-100，导致Triton X-100可溶性Dsg3升高。清脾除湿饮含药血清可抑制上述病理改变，改善细胞间黏附丧失及Dsg3蛋白染色模式异常。STAT3参与调节细胞增殖、存活、分化及免疫细胞功能^[25]。在多发性硬化症、系统性红斑狼疮等动物模型中，STAT3抑制剂已显示出靶向治疗的有益作用^[26]。在上皮角质形成细胞中，STAT3负向调控Dsg3的转录与表达^[8]。IL-37可通过抑制STAT3通路并上调Cav-1表达，抑制PV中Dsg3内吞及KC解离，表明抑制STAT3通路有助于缓解PV棘层松解^[27]。本研究显示，与空白组比较，模型组Dsg3总蛋白水平降低，Triton X-100可溶性Dsg3及p-STAT3/STAT3蛋白水平升高，提示抗Dsg3抗体与抗原结合可促使Dsg3内吞，降低Dsg3总蛋白水平，同时增加Triton X-100可溶性Dsg3及STAT3磷酸化水平。加入清脾除湿饮含药血清后，Dsg3总蛋白表达水平升高，Triton X-100可溶性Dsg3及p-STAT3/STAT3蛋白水平降低并恢复至空白组水平，提示清脾除湿饮含药血清可抑制Dsg3蛋白内吞及STAT3蛋白磷酸化。

综上所述，清脾除湿饮含药血清可通过抑制Dsg3蛋白内吞及STAT3蛋白磷酸化，改善PV细胞模型棘层松解，为临床中医药治疗PV提供了实验依据。鉴于PV棘层松解机制较为复杂，后续尚需开展体内实验以进一步评价其疗效，为深入阐明其作用机制及临床转化提供实验依据。

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基金资助

湖北省自然科学基金项目(2022CFA037)

武汉市卫健委科研项目(WX12A12)