基于DRP1/NLRP3通路探究络风宁2号方治疗心力衰竭机制

Mechanism study of Luofengning Formula 2 on heart failure based on DRP1/NLRP3-mediated pyroptosis​

摘要

目的 探究络风宁2号方（LFN2）对阿霉素（DOX）诱导的H9C2细胞线粒体动力学紊乱与细胞焦亡的干预作用，并基于DRP1/NLRP3信号通路阐明其作用机制。 方法 将对数生长期H9C2细胞随机分为对照组、模型组、LFN2组、MDIVI-1组及LFN2+MDIVI-1组，通过RT-qPCR、免疫荧光、化学发光、JC-1染色、Western blot等技术，检测细胞损伤、线粒体功能、线粒体动力学及细胞焦亡相关蛋白指标。 结果 与对照组比较，模型组ANP、BNP显著升高，DRP1、NLRP3 mRNA及蛋白表达显著上调，ROS水平升高，ATP含量与线粒体膜电位显著下降；线粒体分裂蛋白DRP1、DRP1-S616、FIS1及细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达升高，线粒体融合蛋白OPA1、MFN2表达降低。与模型组比较，LFN2组与MDIVI-1组均可有效逆转上述异常指标，改善线粒体动力学失衡、抑制细胞焦亡，二者差异无统计学意义。LFN2与MDIVI-1联用可产生协同效果，可进一步下调DRP1-S616及NLRP3表达。 结论 LFN2可通过抑制DRP1磷酸化，抑制线粒体过度分裂，阻断NLRP3介导的细胞焦亡通路，减轻心肌细胞损伤，发挥治疗心力衰竭作用。

Abstract

Objective To investigate the intervention effect of Luofengning Formula 2 (LFN2) on doxorubicin (DOX)-induced mitochondrial dynamics disorder and pyroptosis in H9C2 cardiomyocytes, and to clarify its mechanism based on the DRP1/NLRP3 signaling pathway. Methods H9C2 cells in the logarithmic growth phase were randomly divided into a control group, a model group, a LFN2 group, a MDIVI-1 group and a LFN2 + MDIVI-1 group. Multiple techniques including RT-qPCR, immunofluorescence, chemiluminescence, JC-1 staining and Western blot were adopted to detect cell injury, mitochondrial function, mitochondrial dynamics and pyroptosis-related protein indicators. Results Compared with the control group, the levels of ANP and BNP were markedly increased in the model group, and the mRNA and protein expressions of DRP1 and NLRP3 were significantly upregulated, accompanied by the elevated ROS level, decreased ATP content and mitochondrial membrane potential. Additionally, the expression of mitochondrial fission proteins DRP1, DRP1-S616 and FIS1 as well as pyroptosis-related proteins NLRP3, Caspase-1 and IL-1β was increased, while the expression of mitochondrial fusion proteins OPA1 and MFN2 was decreased. Compared with the model group, both LFN2 and MDIVI-1 groups effectively reversed the above abnormal indicators, ameliorated mitochondrial dynamics imbalance and inhibited cell pyroptosis, with no statistically significant difference between the two groups. Moreover, a combined administration of LFN2 and MDIVI-1 exerted a synergistic effect, further downregulating the expression of DRP1, DRP1-S616 and NLRP3. Conclusion LFN2 can inhibit excessive mitochondrial fission by suppressing DRP1 phosphorylation, block the NLRP3-mediated pyroptosis pathway and alleviate cardiomyocyte injury, thereby exerting a therapeutic effect on heart failure.

Graphical abstract

关键词

络风宁2号方 / 线粒体动力学 / 活性氧 / 细胞焦亡

Key words

Luofengning Formula 2 / mitochondrial dynamics / reactive oxygen species / pyroptosis

心力衰竭（Heart Failure，HF）是多种心血管疾病的终末阶段^[1]，发病机制涉及能量代谢障碍，氧化应激，炎症反应等多个病理过程。线粒体功能障碍是心力衰竭的核心环节^[2]。线粒体动力学相关蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）表达异常与氧化应激及其相关的炎症反应的发生发展密切相关^[3]。络风宁2号方（LFN2）是王显教授基于络风内动病机理论，提出治疗心力衰竭的方剂^[4]。课题组前期研究发现，络风宁2号方治疗心力衰竭网络药理学结果聚焦于PI3K-Akt、MAPK、HIF-1信号通路^[5]，研究^[6-7]发现这些通路皆可直接或者间接调控DRP1，影响线粒体功能。络风宁2号方可通过减轻线粒体损伤^[8]，抑制炎症反应^[9]，改善心室重构，保护心功能，但具体调控机制尚待探索。本课题组推测络风宁2号方可改善线粒体动力学恢复人体能量供需平衡，抑制NLRP3炎症小体的过度激活，阻断心肌细胞焦亡，起到治疗心力衰竭作用。

1 材料与方法

1.1 细胞

H9C2（2-1）心肌细胞购于普诺赛公司，货号（CL-0089）

1.2 药物与试剂

络风宁2号方水煎剂（LFN2）：购自北京中医药大学东直门医院中药房，将分装好的水煎剂经冷冻，二次干燥后制备成冻干粉；阿霉素（购自上海源叶生物科技有限公司，货号25316-40-9）；MDIVI-1（购自北京阿词玛生物科技有限公司，货号M1014）；DMEM高糖培养基、青链霉素、胎牛血清（购自北京永泰兴城商贸有限公司，货号PM150210，C100C5，164210）；胰蛋白酶消化液，无血清细胞冻存液，CCK8试剂盒，RNA快速提取试剂盒，蛋白酶磷酸酶抑制剂，彩色marker，蛋白上样缓冲液（还原性），1×PBS，RIPA裂解液，山羊抗兔IgG（H+L）（HRP）（购自苏州新赛美生物科技有限公司，货号：C100C1，C40100，C6005，M51005，P002，P9001，C500C1，WB2001，WB3100，P8002）；RT-qPCR试剂盒（ABI公司，货号A25742）；DRP1抗体、FIS1抗体、MFN1抗体，MFN2、OPA1抗体（Immunoway公司，货号分别为YM8049，YN5292，YM8608，YM8351，YN2976）、IL-1β抗体（购自武汉三鹰生物技术有限公司，货号为26048-1-AP）、NLRP3抗体（购自成都正能生物技术有限责任公司，R381207）、CASPASE-1抗体（Affinity-AF5418）；β-actin抗体（购自雅酶公司，批号LF201S）；ATP、ROS、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号分别为E-BC-F002、E-BC-K138-F、E-CK-A301）；All-in-one RT SuperMix for qPCR逆转录试剂盒、4%多聚甲醛固定液、抗荧光淬灭封片液（购自武汉塞维尔生物科技有限公司，货号分别为：G3337，G1101，G1401），曲拉通Triton X-100，QuickBlockTM免疫染色封闭液，免疫染色一抗稀释液，DAPI（购自上海碧云天生物技术有限公司，货号分别为T8200、P0260、P0103，C1006）。

1.3 仪器

细胞孵箱、实时定量PCR仪（美国Thermo Scientific公司）；多功能酶标仪（美国 Synergytm 公司，TY2014000272）；化学发光成像仪（美国General Electric Company公司）；Western blot转膜仪、Western blot电泳仪（北京凯元信瑞仪器有限公司）。电子显微镜（日本Olympus Corporation 公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养

将H9C2心肌细胞接种在T25培养瓶中，待细胞密度贴壁至90%，用0.25%胰酶消化并离心，并添加10%胎牛血清、青链霉素的DMEM重悬细胞后，接种到细胞培养瓶中，于37℃、5% CO₂条件下培养。

1.4.2 细胞分组及给药

对照组：H9C2心肌细胞+完全培养基；模型组：DOX+H9C2心肌细胞+完全培养基；LFN2组：LFN2+DOX+H9C2心肌细胞+完全培养基；MDIVI-1组：MDIVI-1+DOX+H9C2心肌细胞+完全培养基；LFN2+MDIVI-1组：LFN2+MDIVI-1+DOX+H9C2心肌细胞+完全培养基。干预细胞均为24 h。

1.4.3 CCK8药物浓度的筛选

将细胞以7×10³个/孔接种到96孔板，贴壁过夜后，根据文献[10-11]将阿霉素设置成0.1～64 μmol/L浓度梯度，分别在12、24、36、48 h时间节点加入10%CCK8溶液每孔100 μL，避光孵育1 h后通过酶标仪在450 nm条件下检测细胞活力，LFN2及MDIVI-1浓度筛选流程同上。

1.4.4 RT-qPCR检测ANP/BNP/DRP1/NLRP3

收集各组H9C2细胞，按照快速RNA提取试剂盒加入相应试剂提取细胞RNA，并测定RNA浓度及质量，以All-in-one RT SuperMix for qPCR逆转录试剂盒进行反转录放入PCR仪中，42℃孵育3 min，得到cDNA，冰上备用。依据RT-qPCR试剂盒配置反应体系：2XqPCR MasterMix10、上下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、无RNA酶水补至20 μL。扩增条件：50℃，2 min，95°C预变性2 min，95℃变性15 s，退火55℃～60℃ 15 s，72℃延伸1 min，共40个循环。依据2^-△△Ct检测ANP/BNP/DRP1/NLRP3相对表达水平。TUBULIN作为内参基因，引物具体序列见下表1。

1.4.5 免疫荧光检测DRP1/NLRP3蛋白荧光强度

将细胞根据分组处理相应时间，加入线粒体染色试剂孵育30 min后，用PBS洗涤细胞2次，加入4%多聚甲醛固定液固定细胞30 min，PBST洗涤细胞，加入Triton X-100透化细胞40 min，再次洗涤细胞，加入一抗4℃孵育过夜，洗涤细胞后加入免疫荧光二抗孵育30～40 min，PBST洗涤细胞3次，加入DAPI染色10 min，洗3次加入抗荧光淬灭试剂。荧光显微镜下观察。

1.4.6 化学发光法检测ATP

将各组细胞取上清作为待测品，阳性对照试剂根据说明书稀释到不同浓度作为标准品。取100 μL酶工作液，加入到新的96板孔中，静置5 min。向上述各孔加入100 μL不同浓度的标准品及待测品上清，并迅速用移液器吸打混匀；在酶标仪上，测定各孔吸光度。

1.4.7 荧光法检测ROS

根据分组制备细胞样品后，首先将阳性对照试剂和活性氧探针根据说明书稀释到适宜浓度，将阳性对照试剂处理对照组细胞1 h，用缓冲液冲洗后将稀释后的活性氧检测探针以1 mL/孔加入各组细胞，孵育0.5 h后荧光显微镜下观察细胞染色情况，并用Image J软件计算各组荧光值。

1.4.8 JC-1检测线粒体膜电位

将细胞接种在6孔板并根据分组给药24 h后，吸弃贴壁细胞的培养上清，用1×JC-1 Assay Buffer清洗细胞1次。每孔加入1 mLJC-1工作液，37°C孵育20 min。孵育结束后，用1×JC-1 Assay Buffer清洗细胞1次，然后加入2 mL细胞培养液荧光显微镜观察结果。

1.4.9 Western blot检测线粒体动力学及细胞焦亡相关蛋白表达量

各组细胞弃上清用冰PBS洗涤后，加入提前制备好含有蛋白酶磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液在冰上处理细胞0.5h充分裂解蛋白，并用细胞刮刀处理细胞，收集到2 mL EP管中，用超声波震荡后，12 000 rpm，离心20 min，收集上清获得蛋白，用A280法进行蛋白定量后，按照每孔20 μg/10 μL的上样量依次配置不同组别蛋白上样样本，后根据不同目的蛋白分子量选用适宜浓度的胶并上样，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，电泳条件：150 V 30 min。后制作转膜三明治，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，快速封闭液速封15 min，加入对应一抗，4℃孵育过夜，回收一抗，TBST摇床清洗后孵育二抗（1:10 000），室温孵育1 h，TBST摇床清洗后滴加ECL发光液，使用显影仪曝光拍照，应用Image J软件对得到的条带进行灰度值分析。

1.5 统计学方法

采用GraphPadPrism 9.0和SPSS 20.0软件进行数据分析和统计，结果以均数±标准差（\overline{x}±s）表示。符合正态分布且具备方差齐性的数据，采取单因素方差分析法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK8药物浓度筛选

阿霉素随着药物浓度及作用时间增加，细胞活力逐渐下降，在0.5 μmol/L作用24 h后，细胞活力最接近50%，依此作为最佳造模条件；在此造模条件下，随着药物浓度的增加，LFN2与MDIVI-1细胞活力呈现先升高后降低的变化趋势，分别在5 μg/mL的LFN2，1 μmol/mL MDIVI-1达到细胞活力的峰值，故5 μg/mL的LFN2，1 μmol/mL MDIVI-1作为最佳药物浓度，用于后续实验。见图1。

2.2 LFN2对各组ANP、BNP、DRP1、NLRP3mRNA的相对表达量的影响

与对照组比较，模型组ANP、BNP、DRP1、NLRP3的mRNA的相对表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，MDIVI-1组及LFN2组ANP、BNP、DRP1、NLRP3 mRNA的相对表达量均降低（P＜0.05），MDIVI-1组与LFN2组差异无统计学意义，但LFN2联合MDIVI-1用药与单独LFN2组比较，ANP、BNP、DRP1、NLRP3 mRNA的相对表达量呈进一步降低趋势（P＜0.05）。见表2。

注：A. CCK8对DOX浓度的筛选；B. CCK8对DOX作用时间的筛选；C. CCK8对LEN2药物浓度的筛选；D. CCK8对MDIVI-1药物浓度的筛选

2.3 LFN2对各组DRP1、NLRP3荧光强度的影响

与对照组比较，模型组DRP1、NLRP3荧光强度显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，MDIVI-1组及LFN2组DRP1、NLRP3的荧光强度均降低（P＜0.05），LFN2联合MDIVI-1用药与单独LFN2组比较，DRP1、NLRP3的荧光强度进一步降低（P＜0.05）。见表3。

2.4 LFN2对各组ATP、ROS、MMP的影响

与对照组比较，模型组ATP和膜电位（MMP）比值显著降低（P＜0.01），ROS荧光强度显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，MDIVI-1组及LFN2组ATP水平和MMP（红/绿）比值上升（P＜0.05），ROS荧光强度降低（P＜0.01），LFN2联合MDIVI-1用药与单独LFN2组比较，ATP水平显著上升（P＜0.01），ROS荧光强度降低更明显（P＜0.01）。见表4。

2.5 LFN2对线粒体动力学及细胞焦亡相关蛋白表达量的影响

与对照组比较，模型组DRP1、DRP1-S616、线粒体分裂蛋白1（fission 1，FIS1）升高（P＜0.05），视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、线粒体融合蛋白2（mitofusin 2，MFN2）线粒体融合关键蛋白降低（P＜0.05），NLRP3、Caspase-1、IL-1β细胞焦亡相关蛋白显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，MDIVI-1组及LFN2组DRP1、DRP1-S616、FIS1、NLRP3、Caspase-1、IL-1β降低（P＜0.05），OPA1、MFN2升高（P＜0.05），LFN2联合MDIVI-1用药与单独LFN2组比较，DRP1、DRP1-S616、NLRP3，IL-1β蛋白进一步降低（P＜0.05）。见表5，表6，图2。

3 讨论

心力衰竭早期阶段因心功能代偿，病程进展隐匿，一旦进入失代偿期，西医常规治疗可通过改善血流动力学、抑制神经内分泌过度激活缓解症状，但长期应用易出现电解质紊乱、肾功能恶化、药物耐受等问题。心脏损伤时，细胞质中DRP1募集到线粒体外膜后被磷酸化激活，使线粒体膜呈现高通透性引起线粒体肿胀、膜电位下降以及ROS大量释放，从而激活NLRP3炎症小体，促进Caspase-1激活和IL-1β等炎性因子的成熟与释放，诱发细胞焦亡^[12]，加重心肌损伤。ARNI、SGLT-2抑制剂等新型药物的应用为心力衰竭治疗带来突破，但其在低血压、肾功能不全患者中使用受限，且部分难治性心力衰竭患者仍面临症状反复、生活质量下降困境。中医药以“整体调节、标本兼顾”为核心，在改善心力衰竭患者症状、延缓心肌重构、降低不良事件发生率等方面展现出独特优势，为心力衰竭的综合防治提供了重要补充。

心力衰竭属中医“心水病”范畴，王显在络脉理论基础上结合临床观察发现，慢性心力衰竭急性发作常具有起病急，传变快，易累及多脏，病情迁延易反复的特点，加之心力衰竭临床症状多具有心跳加速，烦躁不安，喘促不宁等“动”象，创新性提出心力衰竭络风内动病机学说，认为心力衰竭核心病机主要在于“络”“风”两端，络脉多虚多瘀的结构特点为络虚生风提供前提条件，而风邪内动又可进一步损伤络脉，逆乱气血，促进心力衰竭的发展。针对气虚血瘀，阳虚水泛，络风内动核心病机，组方配伍而成络风宁2号方。络风宁2号方由鹿衔草、黄芪、丹参、附子等中药组成，方中风药鹿衔草有轻扬之性，含芳香之气，能直接作用于心脉，振奋阳气、宣畅气机、利水消肿、息风通络；附子辛甘大热，温壮肾阳，有助于改善气化功能，促进气血津液运行；丹参可活血祛瘀，清心除烦，疏通经络，改善血液的黏稠度，使气血运行通畅；黄芪可健脾补中，升阳益卫固表，增强脏腑功能，为机体提供充足动力，与附子配伍，可使气旺阳复，与丹参活血相结合，可化瘀不伤正。全方标本兼治，补泻兼施共奏益气温阳，活血利水，祛风通络之效，用于防治并改善心力衰竭的症状。

现代药理学^[13-15]研究表明，络风宁2号方中的多味中药及其活性成分在减轻细胞损伤，改善能量代谢、抑制心室重构与心肌纤维化、抗炎抗氧化等方面发挥着积极作用。鹿衔草总黄酮可通过抗脂质过氧化、增加NO生成和释放发挥对异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的大鼠急性心肌缺血具有保护作用^[16]。黄芪甲苷IV能下调PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，抑制肾组织中DRP1、FIS1和MFF的表达^[17]，丹参酮可抑制小鼠心肌细胞中TGF-β/Smad3信号通路，减轻心肌纤维化，亦可通过剂量依赖性降低OGD诱导抑制NLRP3信号通路激活和Caspase-1等蛋白表达，从而抑制小胶质细胞焦亡，减少炎症因子IL-1β和IL-18分泌，减轻小胶质细胞的损伤。附子有效成分可调节BNP、TNF-α、ANP等异常神经内分泌因子与炎症细胞因子水平，改善心血管疾病患者的心室重构，减轻心力衰竭症状及心肌细胞损伤程度^[18]。

本课题组前期研究证实，络风宁2号方可降低心力衰竭患者NT-proBNP水平和患者临床症状并提高射血分数，改善生活质量，并能抑制或阻断心肾综合征的慢性炎症状态，且可使患者可溶性肿瘤发生抑制蛋白2（soluble suppression of tumorigenicity 2，sST-2）、半乳糖凝集素3（galectin-3，Gal-3）等心肌纤维化标志物出现变化，收缩期左心室内径（left ventricular internal dimension at systole，LVIDs），血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平、转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁，TGF-β₁）水平低于模型组。络风宁2号方组与心力衰竭模型组比较，可使线粒体嵴断裂，线粒体肿胀、空泡化、崩解减轻^[19]，减轻氧化应激及炎症水平。基于前期研究基础，本研究通过阿霉素介导H9C2细胞建立心力衰竭模型，进一步探索络风宁2号方抑制炎症从而防治心力衰竭的分子机制。

NLRP3炎症小体作为炎症细胞传感器，在细胞焦亡中扮演着关键角色，与心室重构和心肌纤维化的炎症反应密切相关。当机体受到内环境稳态改变刺激时，NLRP3启动识别病原体相关分子模式，引起NLRP3寡聚化，并在细胞膜离子通量改变、线粒体功能障碍、ROS生成、线粒体mtDNA释放，溶酶体破坏和跨高尔基体拆卸等多种分子和细胞事件刺激下，NLRP3炎症小体被过度激活，导致细胞膜形成孔隙，引发细胞肿胀、破裂及内容物释放；加速促炎细胞因子的成熟与分泌，形成“炎症风暴”，启动焦亡执行过程。

线粒体动力学紊乱与炎症的发生和发展密切相关，而DRP1/NLRP3通路在抗炎抗氧化过程中发挥重要作用。心脏损伤过程中ROS大量蓄积被认为是导致心力衰竭的关键机制，线粒体中大量生成的ROS可激活免疫应激并损伤线粒体，促进DRP1募集到线粒体外膜并被磷酸化激活后，磷酸化后DRP1向线粒体迁移效率及其与线粒体膜受体结合的亲和力也显著增强，最终导致线粒体分裂过度激活，促使其向“碎片化”转变，并介导ROS释放进入胞质，协同触发NLRP3炎性小体激活，启动心肌细胞焦亡，引起ATP合成障碍、膜电位下降以及细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）大量释放，加重心肌细胞损伤和心肌纤维化，加速心力衰竭进程。本研究结果显示，模型组与对照组比较，DRP1、DRP1-S616、NLRP3蛋白表达升高，经LFN2治疗后，DRP1、DRP1-S616、NLRP3蛋白下降，证明LFN2能够抑制线粒体动力学紊乱和细胞焦亡。LFN2联合MDIVI-1靶向抑制DRP1后，与单独应用LFN2组细胞比较，DRP1、DRP1-S616和NLRP3蛋白表达及免疫荧光强度mRNA进一步下降，线粒体分裂蛋白FIS1减少，细胞焦亡相关蛋白Caspase-1，IL-1β含量减少，ATP和膜电位恢复，ROS降低，证明抑制DRP1可以靶向阻断线粒体动力学紊乱和NLRP3介导的细胞焦亡，改善心肌纤维化。

本研究证实络风宁2号方对阿霉素诱导心力衰竭模型的治疗作用，且通过对DRP1的靶向抑制直接验证DRP1是药物作用的关键靶点，明确其与DRP1/NLRP3通路的关联，为中药复方“多靶点”机制提供了具体分子证据。本研究缺乏NLRP3敲除模型，无法排除药物可能通过其他通路抑制炎症；且未分离中药有效成分，难以明确其直接作用于DRP1的分子结构。后续我们将采用DRP1特异性敲除小鼠，验证通路必要性，通过检测临床阿霉素化疗患者服用络风宁2号方后DRP1/NLRP3相关指标的变化，推动临床转化。

综上所述，络风宁2号方可通过抑制DRP1介导的线粒体过度分裂，阻断NLRP3炎症小体激活，改善阿霉素诱导的心肌损伤，为心力衰竭的治疗提供了新的理论依据和研究方向。

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基金资助

省部级科研基地建设项目(2025-JYB-KYPT-05)

国家自然科学基金项目(82074263)