加味补阳还五汤抑制兔软骨细胞凋亡及调控Bcl-2、Bax蛋白的作用机制研究

Mechanistic investigation of modified Buyang Huanwu Decoction in inhibiting apoptosis of rabbit chondrocytes by regulating Bcl-2 and Bax protein expression

摘要

目的 探讨加味补阳还五汤抑制膝软骨细胞凋亡延缓骨关节炎进展的作用机制。 方法 24只雄性新西兰兔采用随机数字表法，分为正常组、模型组、加味补阳还五汤组、壮骨关节丸组，每组6只。造模后第2周起开始干预，连续6周。干预结束次日，进行行为学评分，测量模型兔患膝周径、痛阈，然后处死，取KOA兔膝左侧胫骨平台及股骨关节面，保留软骨，观察关节腔表面关节软骨及滑膜形态。HE染色后观察膝关节组织病理变化，采用TUNEL法检测膝关节软骨细胞凋亡率，用免疫组化法检测膝关节软骨细胞Bcl-2/Bax蛋白表达。 结果 与正常组比较，模型组兔膝关节周径明显升高，痛阈降低，细胞凋亡率高，Bax评分高（P＜0.01）；与模型组比较，壮骨关节丸组、加味补阳还五汤组兔膝关节周径明显降低，痛阈明显升高，凋亡细胞的数量明显减少，Bax评分低（P＜0.01）。 结论 加味补阳还五汤可改善兔膝骨关节炎，其治疗机制可能是通过上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达水平，抑制膝软骨细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the underlying mechanisms of modified Buyang Huanwu Decoction (MBHD) in inhibiting knee chondrocyte apoptosis and delaying the progression of knee osteoarthritis (KOA). Methods Twenty-four male New Zealand rabbits were allocated into four groups (n = 6 per group) using a random number table: the control group, the model group, the MBHD group, and the Zhuanggu Guanjie Pill (ZGP) group. Interventions commenced two weeks post-modeling and lasted for six consecutive weeks. On the day following the final intervention, the behavioral scores, affected knee circumferences, and pain thresholds were assessed. Following euthanasia, the left tibial plateau and femoral articular surfaces were harvested to observe the morphology of the articular cartilage and synovium. The histopathological changes were evaluated using hematoxylin and eosin (HE) staining. The chondrocyte apoptosis rates were detected via the TUNEL assay, and the protein expression levels of Bcl-2 and Bax were quantified using immunohistochemistry. Results Compared to the control group, the model group demonstrated significantly increased knee circumferences, decreased pain thresholds, elevated apoptosis rates, and higher immunohistochemistry scores (Bax) (P<0.01). Conversely, compared to the model group, both the MBHD and ZGP groups exhibited significantly reduced knee circumferences, elevated pain thresholds, fewer apoptotic cells, and lower Bax scores (P<0.01). Conclusion Modified Buyang Huanwu Decoction demonstrates substantial therapeutic efficacy against KOA in rabbits. This protective mechanism is likely mediated through the regulation of chondrocyte apoptosis via the upregulation of Bcl-2 and the downregulation of Bax protein expression.

Graphical abstract

关键词

膝骨关节炎 / 加味补阳还五汤 / 细胞凋亡

Key words

knee osteoarthritis / modified Buyang Huanwu Decoction / apoptosis

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）^[1]是一种以膝关节软骨破坏、退变、软骨下骨硬化、软骨边缘骨赘形成为主要特征的慢性关节疾病，常伴有滑膜炎症^[2-3]。据1990－2020年全球KOA流行病学数据统计，2020年全球有5.95亿人患有KOA，自1990年以来增加了132.2%，预测到2050年全球KOA的患病率将继续提升74.9%^[4]。中医学上将膝骨关节炎称之为“膝痹”，气虚血瘀、络脉瘀痹是其主要病机。加味补阳还五汤具有益气活血、通经活络的作用，是出自《医林改错》中的经典方剂，笔者前期多次用此方进行加减治疗KOA气虚血瘀型的患者，疗效甚佳。但具体机制尚不清楚，研究发现，软骨细胞的凋亡是KOA发展的核心因素之一，凋亡软骨细胞的数量与关节炎介导的人类软骨降解程度成正相关^[5]。Bcl-2蛋白家族是凋亡细胞的关键调节因子^[6]。细胞凋亡的关键步骤是线粒体外膜（MOM）的通透性增加，使软骨细胞产生不可逆的死亡^[7]。促凋亡效应蛋白Bax通过将MOMP的嵌入微囊的寡聚孔发挥核心作用。Bax主要以非活跃的状态存在，在细胞凋亡过程中，Bcl-2通过与Bax的相互作用，形成孔蛋白复合体，破坏线粒体膜的完整性，触发凋亡诱导因子的释放，最终导致软骨细胞凋亡，诱发膝关节炎症^[8]。本研究将建立兔膝骨关节炎模型，以Bcl-2、Bax蛋白表达水平为切入点，系统研究中药复方加味补阳还五汤抑制软骨细胞凋亡治疗膝骨关节炎的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

24只5月龄的普通级雄性新西兰白兔，体质量为1.8～2.2 kg（由上海松联，合格证号SCXK：2023-0008），动物许可证：SYXK（闽）：2023-0005。实验方案经福建中医药大学附属第二人民医院伦理委员会审核通过（审批号：FJPSPH-IAEC2023081）。

1.2 实验药物及试剂

壮骨关节丸：国药准字Z4402377，规格：60 g/盒，6 g/袋，华润三九制药有限公司；加味补阳还五汤组成：生黄芪30 g、当归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、丹参、党参、牛膝、薏苡仁、鸡血藤、泽兰、淫羊藿、巴戟天、肉苁蓉各9 g。总药材量156 g。均统一购自福建中医药大学附属第二人民医院中药房，制备为浓度0.1 g/mL壮骨关节丸混悬液及2 g/mL加味补阳还五汤水煎液，4℃冰箱保存备用。3%戊巴比妥钠、4%多聚甲醛、EDTA脱钙液，二甲苯、苏木素、中性树胶，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche Applied Science），DAB免疫组化试剂盒、HRP标记的兔二抗（D110063-0100）、HE染色液试剂盒。

1.3 实验仪器

显微镜（日本奥林巴斯公司）、多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics公司）、包埋机（德国莱卡公司）、石蜡切片机（德国莱卡公司）、定温干燥箱（日本雅马拓）、恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）。

2 方法

2.1 造模方法

除正常组外，其余3组均采用“改良Hulth+驱赶法”制备KOA兔模型^[9]。新西兰兔实验前纯净水喂养12 h，实验以3%戊巴比妥钠35 mg/kg，选取左耳耳缘静脉注射麻醉，取左膝关节剃毛，消毒，从兔膝关节内侧纵行切口2 cm，显露出兔关节腔，剪断内侧副韧带及前十字韧带，术毕用生理盐水冲洗伤口，并逐层缝合，常规抗生素肌肉注射预防关节内感染。术后休息1周，于第8天开始，每日下午驱赶兔活动30 min，连续8周，造模总时间共为9周。

2.2 分组方法

24只新西兰兔采用随机数字表法分为正常组、模型组、加味补阳还五汤组和壮骨关节丸组，每组6只。

2.3 干预方法

造模第2周起，开始进行干预。壮骨关节丸组按“人兔体表面积剂量比”的等效剂量，1.2 g/（kg·d）灌胃，加味补阳还五汤组按“人兔体表面积剂量比”的等效剂量2.5倍，20 g/（kg·d）灌胃，正常组和模型组则予蒸馏水10 g/（kg·d）灌胃，连续干预6周^[10]。

2.4 标本制作方法

干预结束次日，各组新西兰兔以3%戊巴比妥钠麻醉过量处死动物，取股骨、胫骨关节表面软骨，清除周围肌肉、筋膜等，观察关节腔表面关节腔、关节软骨面及滑膜形态。取左侧胫骨平台及股骨关节面，保留软骨，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，换液继续固定10 d，弃4%多聚甲醛，流水清洗至无醛味，转至EDTA液中脱钙，每2～3 d换一次脱钙液，共脱钙12周。HE染色、TUNEL染色、免疫组化法均在脱钙完成后2周内完成。

2.5 实验指标测定

2.5.1 行为学测试

采用Lequesne MG行为学量表对各组兔行为进行评估，干预结束次日开始评估，具体指标如下：实验兔膝关节对疼痛刺激做出的反应：无疼痛得0分；患肢收缩则为轻度疼痛，得1分；兔患膝痉挛，有收缩，为中度疼痛，得2分；兔患膝痉挛、抽搐且患肢不能着地，得3分，为重度疼痛。膝关节活动范围变化：膝关节活动＞90°得0分；＞45°且＜90°得1分；＞15°且＜45°得2分；＜15°得3分。步态变化：患肢无跛行，运动正常得0分；患肢轻度跛行，运动减少得1分；患肢明显跛行，运动受限得2分；患肢不能着地，不能行走得3分。膝关节红肿情况：无肿胀得0分，轻度肿胀得1分，中度肿胀得2分，重度肿胀得3分。所得分数与兔膝关节功能障碍程度成正比。

2.5.2 兔患膝关节周径与痛阈测量

用软皮尺环绕KOA兔患膝股骨内外侧髁一圈，所测数值即为兔膝关节周径。在各组兔干预结束之后使用压力测痛仪按压各组兔手术切口部位，若兔因疼痛而出现弹跳、蹬腿等反应时记录下压力值。测量2次，取平均值。

2.5.3 膝关节病理组织观察

兔膝骨关节样本脱钙至用刀片切割组织无较大阻力时，对膝骨关节软骨进行常规脱水、石蜡包埋、脱蜡、入水、HE染色及封片处理，封片完成后用光学显微镜观察软骨组织的结构、细胞形态和数量。

2.5.4 兔膝关节软骨细胞调亡水平检测

将所取得的切片严格按照TUNEL细胞凋亡、检测试剂盒说明进行处理^[11]。细胞核内可观察到棕黄色颗粒，染色质呈现出明亮的凝聚斑块形态。单个软骨细胞在凋亡后与周围细胞分离，形态表现为收缩，呈卵圆形或圆形，并显示阳性染色，提示其处于凋亡状态。（凋亡系数＝阳性结果数量/细胞总数×100%）。

2.5.5 Bcl-2/Bax蛋白表达水平检测

采用免疫组织化学染色技术处理切片：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，弃去多余液体，不清洗。滴加第一抗体，置4℃过夜孵育，0.1M PBS冲洗3次，每次5 min。加生物素标记第二抗体（IgG），37℃孵育20 min，0.1M PBS冲洗3次。滴加HRP标记的链霉卵白素复合物（S-A/HRP），37℃孵育20 min，继续PBS清洗3次。显色步骤采用DAB试剂盒：1 mL蒸馏水中加入显色剂A、B、C各一滴，混匀后加至切片，显色6 min，流水充分洗涤。苏木素复染细胞核1 min，流水洗净，1%盐酸酒精分化，1%氨水返蓝，彻底水洗；脱水透明处理，中性树脂封片，晾干，封片。实验样本进行400×的显微照相，进行染色强度评分。使用Image-Pro Plus图像处理软件分析、读取数据、最后存盘^[12]。对结果进行判定，判定标准：细胞核中有棕黄色颗粒者，染色质呈明亮的凝聚块，单个凋亡的软骨细胞与周围细胞分离，细胞皱缩呈卵圆形或圆形为阳性的凋亡软骨细胞；Bcl-2/Bax：Bcl-2以核表达阳性为主，Bax以细胞浆表达阳性为主，而Bcl-2、Bax免疫阳性细胞均呈棕黄色。鉴于关节软骨细胞比较少，尤其在骨关节炎发生时，软骨会被破坏并剥脱。故在细胞很少的情况下，有如下判定标准：在高倍镜视野下，有6个以上的阳性细胞者可视为：强阳性（+++）；有3～5个阳性细胞者可视为：阳性（++）；在高倍镜视野下，有1～2个阳性细胞者可视为：弱阳性（+）；在高倍镜下偶尔可见及未见到任何阳性细胞者可视为：可疑（-）、阴性（-）。评分标准：A为阳性细胞数分级0%～1%为0分；1%～10%为1分；10%～50%为2分；50%～80%为3分；80%～100%为4分；B为阳性细胞显色强度分级0（阴性、可疑）；1（弱阳性）；2（阳性）；3（强阳性）。免疫组化评分（immunohistochemistry score，IHS）=A×B，即为目标蛋白表达量。

2.6 统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件，计量资料采用均值±标准差表示，属正态分布，组间比较采用单因素方差分析比较，方差齐性，采用LSD-t检验，非正态分布，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组兔Lequesne MG评分的比较

见表1。

3.2 各组兔患膝关节周径、痛阈的比较

见表2。

3.3 各组兔膝关节软骨大体外观形态比较

正常组：关节软骨表面与边缘平整光滑，呈淡蓝色，色泽鲜明，无骨赘形成或软骨结构破坏，关节腔内未见明显积液；模型组：关节腔内存在积液，液体较为混浊，软骨表面色泽转为淡黄色，呈不规则凹凸状，伴有软骨缺损及滑膜增生，部分内侧区域出现骨赘；壮骨关节丸组、加味补阳还五汤组：关节腔中可见积液，但液体相对澄清，关节表面略显粗糙，局部出现凹陷，软骨表面偏苍白，滑膜轻度增生，软骨损伤程度较模型组减轻，未观察到骨赘形成，如图1。

3.4 各组兔膝关节软骨病理形态学

正常组：关节软骨浅层表面平整，软骨细胞多呈圆形或椭圆形，排列规则，具有明显四层结构，潮线边界清晰，软骨下骨骨小梁分布均匀（蓝色箭头）；模型组：浅层软骨发生明显磨损，伴随裂隙形成，软骨细胞形态多样、排列紊乱，局部可见细胞簇集，层次结构不清，潮线中断，骨小梁排列紊乱，滑膜区可观察到增生变化（蓝色箭头）；壮骨关节丸组：浅层软骨表面略显粗糙，细胞排列紊乱且数量减少，部分呈簇集状态，四层结构仍可辨识，潮线较模型组更为清晰，骨小梁分布不均（蓝色箭头）；加味补阳还五汤组：软骨表面相较模型组更趋平整，浅层细胞排列较为规整，部分细胞呈不规则形态，层次结构清晰，可辨潮线，骨小梁分布均匀，软骨下骨接近正常状态，如图2。

3.5 各组软骨细胞凋亡率比较

TUNEL检测阳性细胞的细胞核中可见棕黄色颗粒（蓝色箭头）。正常组可见少量棕染的阳性细胞；模型组见大量阳性棕黄色细胞，呈片状分布；壮骨关节丸组可见软骨浅层棕染细胞数量较多，可延及中层，总体数量明显少于模型组；加味补阳还五汤组凋亡细胞数量多于正常组，而明显少于模型组，主要分布于浅层组织，如图3，见表3。

3.6 各组Bcl-2/Bax蛋白免疫组化结果

正常组Bcl-2蛋白（蓝色箭头）检测中棕染阳性细胞数量较多，而在Bax蛋白（红色箭头）检测中棕黄色的阳性细胞稀少；模型组可见Bcl-2蛋白阳性表达的细胞稀少，而Bax表达的阳性细胞数量较多；壮骨关节丸组、加味补阳还五汤组可见Bcl-2阳性表达的棕染细胞数量较多，Bax表达的细胞数量少。如图4和图5，见表4。

4 讨论

KOA是骨关节炎中最常见的发病类型^[13]，在我国约有8.1%的人群患有症状性KOA^[14]，并且女性的发病率高于男性，研究表明绝经后女性雌激素水平的变化会直接影响KOA的发生，LIANG Y J等^[15]使用雌激素去干预卵巢切除的骨关节炎大鼠，软骨的凋亡水平明显得到抑制。KOA的病程长、致残率高，给患者、家庭和社会带来巨大的经济压力。为此，寻找出有效且安全的KOA治疗药物，减轻患者的负担和疾病带来的痛苦，具有重要的意义。本研究聚焦于中药复方壮骨关节丸及加味补阳还五汤对KOA的干预作用，从组织病理学视角出发，深入探究其对大鼠软骨细胞凋亡的影响。研究结果显示，两种中药复方均能对大鼠的软骨细胞凋亡起到不同程度的抑制作用，且这一作用与Bcl-2、Bax蛋白表达水平的变化高度契合，尤为突出的是，加味补阳还五汤组在抑制效果上表现得更为显著，这有力地表明加味补阳还五汤可通过精准调节Bcl-2、Bax蛋白表达，进而有效抑制膝骨关节炎兔的软骨细胞凋亡进程。

补阳还五汤出自清代医家王清任所著《医林改错》，此方具有补气活血通络之效，笔者在原方基础上加党参、薏苡仁、鸡血藤、巴戟天、泽兰、淫羊藿、肉苁蓉、丹参、牛膝，增强其活血通络止痛之功。研究证实，加味补阳还五汤中多种药味具有调节细胞凋亡和自噬的作用。现代药理学研究发现，淫羊藿中的淫羊藿苷可通过抑制骨细胞凋亡防止氧化应激诱导的内皮祖细胞自噬促进血管分化，改善骨关节疾病^[16]。LIN J等^[17]发现杜仲通过抑制Caspases3、Caspases6、Caspases7、Caspases9信号通路，拮抗过氧化氢诱导的大鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡。黄芪总黄酮是中药黄芪提取物，通过调控JAK2/STAT3信号通路，增强IL-10、Bax表达，降低IL-6、Bcl-2水平，抑制RA-FLS细胞的增殖，诱导细胞凋亡^[18]。独活等药物上清液灌胃KOA模型大鼠发现能明显改善大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10炎症指标，从而发挥抗炎、抗凋亡作用^[19]。研究中对照组采用壮骨关节丸，该方由熟地黄、狗脊、续断、骨碎补、独活、补骨脂、淫羊藿、乳香等活血止痛、滋补肝肾的药物组成。张少卓等^[20]研究发现该方可降低基质金属蛋白酶-3（MMP-3）及其组织金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）含量，抑制MMP-3对关节软骨基质中蛋白多糖的裂解活性，减少II型胶原的降解，治疗KOA。但近期的一些研究表明，壮骨关节丸可能造成肝损伤风险^[21-23]。

软骨细胞凋亡的诱导是调节组织稳态和平衡增殖的基本方面之一。它可以通过细胞外配体（外源性细胞凋亡）或内部信号（内源性细胞凋亡）启动^[24]。通路之间存在多种串扰模式，并且都需要激活Caspase来执行细胞凋亡。Bcl-2蛋白家族通过调节细胞色素c和其他有害蛋白从线粒体释放至胞质溶胶中。一旦进入胞质，细胞色素c导致凋亡小体复合物的形成和Caspase9和Caspase级联反应的激活，最终导致细胞死亡。软骨细胞是膝关节软骨中唯一的驻留细胞，在正常膝关节组织中，细胞的凋亡和增殖处于动态平衡。在膝骨关节炎的进程中，软骨细胞的过度凋亡，打破这种动态平衡，导致软骨细胞数量减少和细胞外基质的降解，加速膝骨关节炎的形成^[25]。并且，研究^[26]发现软骨细胞凋亡水平与骨关节炎中软骨细胞的退行性病变呈正相关。Bcl-2家族蛋白根据功能和结构域数量可分为：多结构域抗凋亡蛋白、多结构域促凋亡蛋白和仅 BH₃促凋亡蛋白^[27]。各种促凋亡和抗凋亡成员之间相互作用决定细胞是响应促死亡信号而存活，还是通过启动线粒体外膜的透化而死亡^[28]。在健康细胞中，守护蛋白Bax和Bcl-2杀伤蛋白1结合，阻止促凋亡蛋白诱导透化。研究结果显示，模型组软骨细胞的凋亡率显著高于正常组。经加味补阳还五汤灌胃干预后，观察到兔关节腔积液色泽较为清澈，关节表面轻度粗糙，明显优于模型组，滑膜轻度增生，软骨损伤程度显著减轻，未见骨赘形成。对兔膝关节软骨组织进一步检测发现，加味补阳还五汤组与壮骨关节丸组中Bcl-2蛋白表达上调，Bax蛋白表达下调，与组织病理学观察结果相一致，提示其对软骨细胞凋亡具有调控作用，说明中药复方加味补阳还五汤治疗KOA兔疗效确切。

综上所述，本研究通过动物实验证实，加味补阳还五汤通过靶向介导Bcl-2、Bax线粒体凋亡通路，能够有效保护软骨组织，降低软骨细胞的凋亡率，延缓KOA的进展。

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基金资助

福建省自然科学基金资助项目(2018J01320)

福建省卫健委科教处医学创新课题(2023CXA047)

福建省中医药科研课题(2017FJZYJC202)

福建中医药大学科学技术处专项项目(XB2024290)