尿路感染（urinary tract infection，UTI）作为全球第二大细菌感染性疾病，其发病率随人口老龄化及抗生素滥用持续攀升，其中75%～95%的社区获得性UTI由大肠埃希菌引发
[1-2]。近年产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum β-lactamase，ESBLs）多重耐药大肠埃希菌感染率激增，美国2012－2017年ESBLs感染率增长了53%，我国检出率也超50%
[3-6]，其对三代头孢菌素等药物高度耐药，导致传统治疗失败率高、复发频繁
[7-8]。中医药在UTI治疗中展现独特优势，尤其针对耐药菌感染
[9-10]。国家级名老中医张炳厚创制的清肾丸，以益气养阴、清利湿热为法，临床研究证实其可显著改善耐药UTI患者症状及复发率
[11-12]，但作用机制尤其是对宿主免疫调控通路的影响尚未明确。
当前研究显示，产ESBLs大肠埃希菌通过质粒编码酶介导耐药性，其菌毛黏附可激活膀胱上皮Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）
[13]，触发核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号级联反应
[14]，释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等促炎因子
[15-16]。TLRs/NF-κB通路过度活化虽可增强病原清除，但亦引发持续性炎症损伤，形成“感染-炎症”恶性循环
[17]。临床依赖碳青霉烯类药物治疗多重耐药UTI，但耐药菌进化及药物毒性问题突出
[18-19]。因此，探寻兼顾抗菌与免疫稳态调节的新策略至关重要。本研究基于TLRs/NF-κB信号通路，系统解析清肾丸治疗耐药UTI的作用靶点，为中医药抗感染机制研究提供新证据。
1 材料与方法
1.1 试剂与耗材
28只SPF级雌性SD大鼠购于新疆医科大学实验动物中心，饲养于SPF级实验动物房（室温20℃～23℃，自然光照，自由进食）。清肾丸方：生地黄15 g，熟地黄15 g，生黄芪15 g，山药10 g，桑寄生15 g，五味子10 g，园参10 g，乌梅10 g，知母10 g，瞿麦15 g，白茅根15 g，公英10 g，石苇15 g，滑石15 g。由医院煎药室，煎煮成300 mL药液保存（0.55 g/mL）。热淋清颗粒（8 g×6袋/盒）购于贵州威门药业股份有限公司[6袋以100 mL沸水冲匀后保存（0.48 g/mL）]。产ESBLs多重耐药大肠埃希菌（1×1010 CFU/mL）由医院检验科细菌室提供。乌拉坦（氨基甲酸乙酯）500 g/瓶，配成20%溶液。兽用电子体温计（型号TB02-HRQ-A2）购于北京冀诺泰科技发展有限公司。RNA提取试剂盒（DP430）购于北京天根生化科技有限公司。反转录试剂盒（PrimeScript™ RT Master Mix）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（SYBR® Premix Ex Taq™ II）购于日本Takara生物工程有限公司。TLR2、TLR4、NF-κB p65引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TLR2抗体（ab191458）、TLR4抗体（ab13556）购于英国Abcam公司。NF-κB抗体（#8242）、p-p65抗体（#3033）、GAPDH抗体（#5174）购于美国Cell Signaling Technology公司。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、HRP标记二抗（A0208）、SDS-PAGE凝胶配制试剂（PG112）购于上海碧云天生物技术有限公司。ECL化学发光试剂盒（WBKLS0500）购于美国Merck Millipore公司。BCA蛋白定量试剂盒（PC0020）购于北京索莱宝科技有限公司。血常规检测试剂盒（BC-5000）购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。尿白细胞/细菌计数试剂盒（URITEST-500B）购于桂林优利特医疗电子有限公司。本研究经乌鲁木齐市中医医院伦理委员会批准（伦理批号：DW2024052203）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与造模
将28只SD大鼠按随机数字表分为4组，每组7只，分为空白组、模型组、热淋清组、清肾丸组。取体质量170～190 g雌性SD大鼠，造模前大鼠禁水24 h。用手指轻压大鼠腹部以充分排出残余尿。20%的乌拉坦（1 g/kg腹腔内注射）麻醉大鼠，剪下腹部毛，活扣结扎尿道口。消毒后，在下腹部正中做1.5 cm切口，用4.5号小针头抽取产ESBLs多重耐药大肠埃希菌液0.5 mL缓慢注入膀胱，缝合切口，6 h后松解尿道口，恢复正常饮食、饮水。空白组手术中不注入产ESBLs多重耐药大肠埃希菌，手术过程同上，活扣结扎尿道口6 h后松解，恢复正常饮食供水。
造模期间每日定时用电子体温计测量肛温1次，第1、7、14天分别取血、尿液检测血常规、尿白细胞计数、尿细菌计数，造模大鼠尿白细胞阳性、尿细菌计数＞105个为造模成功。
1.2.2 肛温监测与样本采集
每日定时使用电子体温计测量肛温，第1、7、14、21天采集血液及尿液样本，检测血常规（白细胞数目、中性粒细胞百分比）、尿白细胞计数（×103个/μL）及尿细菌计数（×105 CFU/mL）。
1.2.3 HE染色观察病理变化
处死大鼠后立即取膀胱三角区组织，5×5×3 mm，4%多聚甲醛（pH7.4）固定24 h。梯度乙醇脱水（70%～100%各2h），二甲苯透明3h，石蜡浸渍（60℃真空渗透仪）Leica RM2235切片机连续冠状切片（4 μm），苏木精染色5 min（Harris配方），1%盐酸乙醇分化30 s，伊红染色2 min。Nikon Eclipse E100显微镜400倍视野下观察炎性浸润。
1.2.4 qRT-PCR检测TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA水平
取50 mg膀胱组织，TRIzol法裂解，氯仿分层后12 000 g离心15 min，异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤2次，DEPC水溶解。利用PrimeScript RT试剂进行反应，反应体系20 μL（含1 μg RNA），42℃ 30 min，85℃ 5 min。引物序列见
表1。qPCR的反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸5 min。用2
-ΔΔCt法计算相对表达量，每样本设3个复孔。
1.2.5 Western blot检测TLR2、TLR4、p-p65、NF-κB的蛋白水平
组织裂解液（RIPA+1mM PMSF）冰上匀浆（15 s×3次，间隔30 s），14 000 g离心20 min取上清，BCA法（Pierce试剂盒），制作标准曲线（0～2 000 μg/mL），酶标仪562 nm测定。10%分离胶电泳（80V 30 min，120V 1 h），PVDF膜湿转（300 mA，90 min）。5%脱脂牛奶室温封闭1 h。用TLR2（1:1 000）、TLR4（1:800）、p-p65（1:500）、GAPDH（1:5 000）的一抗4℃孵育过夜。随后用HRP标记山羊抗兔（1:5 000）室温孵育1 h。ECL化学发光，Bio-Rad ChemiDoc成像系统曝光，利用Image Lab 5.2软件分析灰度值。
1.3 统计学方法
所有数据经Kolmogorov-Smirnov检验证实正态分布后，采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异，方差齐性时选用LSD-t法，方差不齐时选用Tamhane's T2法。动态数据采用重复测量方差分析，时间效应与处理效应交互作用通过Mauchly球形检验。多重比较校正采用Bonferroni法，检验水准α=0.05（双侧）。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠肛温变化趋势比较
2.2 各组白细胞数目和中性粒细胞百分比比较
2.3 各组尿白细胞计数动态变化
2.4 各组尿细菌计数动态变化
2.5 各组大鼠感染后膀胱组织的组织病理学观察
利用HE染色技术对造模后第21天的膀胱进行组织病理学检查。空白组染色后表现出健康组织学特征（如
图1A）。模型组表现出强烈炎性浸润和间质充血（如
图1B）。热淋清组膀胱组织存在感染，尿路上皮有轻度炎症浸润（如
图1C）；然而，清肾丸组显示轻度固有层水肿，未见明显炎性浸润（如
图1D）。
2.6 各组TLR2、TLR4、NF-κB mRNA相对水平比较
2.7 各组TLRs/NF-κB信号轴蛋白表达水平比较
3 讨论
本研究利用清肾丸干预UTI大鼠后，UTI大鼠的肛温、外周血白细胞数目及中性粒细胞百分比均显著降低，且优于热淋清组。清肾丸在第21天时尿白细胞计数和尿细菌计数均降低，提示其不仅能够缓解全身炎症反应，而且还可直接抑制病原菌增殖。中医学理论认为，尿路感染属“淋证”范畴，湿热毒邪蕴结下焦为本病核心病机
[11]。清肾丸以清热利湿、解毒通淋为法，其组方中黄柏
[20]和车前子
[21]已被证实具有广谱抗菌活性
[22]，而茯苓、泽泻等药味则通过调节水液代谢减轻组织水肿
[23-24]，可能协同增强抗菌效果。本实验进一步证实，清肾丸的抗菌作用不仅针对敏感菌株，对产ESBLs多重耐药大肠埃希菌亦表现出显著抑制效果。
TLRs/NF-κB通路作为连接固有免疫与炎症反应的核心枢纽
[25]，在尿路感染的病理进程中起关键作用
[26]。本研究发现，模型组大鼠TLR2、TLR4及NF-κB mRNA表达显著上调，而清肾丸干预后上述基因表达均下调。蛋白水平分析进一步显示，清肾丸显著抑制TLR2、TLR4及磷酸化p65（p-p65）的表达，但对总NF-κB蛋白无显著影响。这一结果提示，清肾丸的作用靶点可能位于TLRs下游的MyD88依赖性信号转导环节，通过阻断IκB激酶（IKK）的激活，抑制IκBα磷酸化及降解，从而减少NF-κB核转位，而非直接影响NF-κB的合成
[27]。
产ESBLs多重耐药大肠埃希菌通过菌毛黏附膀胱上皮后，其PAMPs被TLR2/TLR4识别，激活MyD88-IRAK-TRAF6信号级联，进而驱动NF-κB活化并释放大量促炎因子，导致模型组持续高热、中性粒细胞浸润及尿白细胞增多
[28-29]。清肾丸通过下调TLR2/TLR4表达及p-p65生成，有效抑制促炎因子转录，缓解炎症风暴，同时阻断感染-炎症-再感染的恶性循环。相较而言，热淋清颗粒主要依赖黄酮类成分的直接杀菌作用，虽早期尿菌量下降明显，但对TLRs/NF-κB通路的调控显著弱于清肾丸。清肾丸因含丹参、赤芍等活血化瘀成分，在后期展现出更优的尿菌清除率，提示其抗菌效应部分依赖免疫稳态修复。因此，本研究表明清肾丸通过“菌-毒-炎”协同干预，实现祛邪扶正，为减少抗生素使用及延缓耐药提供新思路，且选择性抑制p-p65使其安全性较高。
本研究仍存在以下局限：1）未探讨清肾丸具体活性成分对TLRs/NF-κB通路的分子互作机制；2）动物模型未完全模拟人类复杂性尿路感染的微环境；3）缺乏长期用药的毒性评价数据。未来研究可结合蛋白质组学筛选清肾丸的关键效应分子，并开展基于类器官模型的宿主-病原体互作研究。此外，开展清肾丸与碳青霉烯类药物的序贯疗法临床试验，将有助于推动中医药在耐药菌感染领域的应用转化。
综上所述，本研究证实，张炳厚清肾丸可通过抑制TLR2/TLR4/NF-κB信号通路，有效缓解产ESBLs多重耐药大肠埃希菌尿路感染引起的全身及局部炎症反应，其作用机制涉及病原菌清除、免疫调节及炎性损伤修复等多个环节。本研究结果不仅为阐释中医药治疗耐药菌感染的科学内涵提供了实验依据，也为临床优化抗感染治疗方案开辟了新路径。
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