参鹿抑颤颗粒对帕金森病小鼠细胞凋亡的影响作用

Effects of Shenlu Yichan Granules on apoptosis in a mouse model of Parkinson's disease

摘要

目的 探讨参鹿抑颤颗粒对帕金森病（PD）小鼠模型细胞凋亡的影响。 方法 研究模拟帕金森病病理过程，通过连续5 d，每日1次的MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）腹腔注射，建立PD小鼠模型，末次MPTP注射2 h后，各剂量组分别给予对应浓度参鹿抑颤溶液，灌胃给药连续干预14 d。在用药干预结束后观察小鼠神经行为变化；灌胃14 d实验结束后获取黑质纹状体组织，用免疫组化法检测大脑黑质TH表达、Western blot法检测α-syn、Bcl-2和Bax蛋白表达。 结果 经14 d参鹿抑颤颗粒连续治疗后，参鹿抑颤颗粒可有效改善PD小鼠肢体协调能力（P＜0.01）。TH阳性细胞数回升显著、α-syn表达被有效抑制（P＜0.001）、小鼠Bcl-2/Bax显著升高，抑制了细胞凋亡（P＜0.001）。 结论 参鹿抑颤颗粒可能通过抑制PD小鼠的细胞凋亡，达到“补髓御毒，形神共治”的效果，为帕金森病的预防和治疗提供更多的思路与方法。

Abstract

Objective To investigate the effects of Shenlu Yichan Granules on apoptosis in a mouse model of Parkinson's disease (PD). Methods This study simulated the pathological process of Parkinson's disease. A mouse model was established by intraperitoneal injection of MPTP (1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine) once daily for 5 consecutive days. Two hours after the last MPTP injection, each group with varying dosages was given the corresponding concentrations of Shenlu Yichan solution by gavage for 14 consecutive days. After the intervention, the neurobehavioral changes in mice were observed. Following the 14-day gavage treatment, the substantia nigra and striatum tissue were collected. The TH expression in the substantia nigra was detected by immunohistochemistry, while the protein expression levels of α-syn, Bcl-2, and Bax were detected by Western blot. Results After 14 days of continuous treatment, Shenlu Yichan Granules effectively improved limb coordination in PD mice (P<0.01). The number of TH-positive cells significantly recovered, and the α-syn expression was effectively inhibited (P<0.001), while the Bax protein expression was decreased, and the increased Bcl-2 protein expression inhibited apoptosis (P<0.001). Conclusion Shenlu Yichan Granules may achieve the effect of "nourishing the marrow to counteract toxins, and co-regulating the body and spirit" by inhibiting apoptosis in PD mice, providing new ideas and methods for the prevention and treatment of Parkinson's disease.

Graphical abstract

关键词

帕金森病 / 参鹿抑颤颗粒 / 细胞凋亡

Key words

Parkinson's disease / Shenlu Yichan Granules / apoptosis

帕金森病（Parkinson's disease，PD）作为中老年群体高发的神经退行性疾病^[1]，其核心病理特征表现为中脑黑质区多巴胺能神经元的进行性丢失，并伴随α-突触核蛋白（α-syn）异常聚集形成特征性路易小体结构。上述病理改变直接导致纹状体多巴胺递质水平显著降低，进而引发运动迟缓、静止性震颤、肌张力增高及姿势反射障碍等典型运动功能障碍，最终对患者的日常生活能力造成严重损害^[2]。目前，作为一线治疗方案的左旋多巴制剂与多巴胺受体激动剂类药物，虽能够在病程管理中部分缓解帕金森病运动障碍，但长期使用会导致胃肠功能障碍、精神及运动并发症等，且无法阻断病程^[3]。中医药在治疗PD上有显著优势，其通过多通路、多靶点的特点，减少神经元变性，有效延缓PD进展^[4-5]。

在中医学中，帕金森病被归类为“颤证”，其发病的主要原因与肝肾虚弱、气血不足以及痰瘀阻塞经络等因素密切相关。国医大师任继学完善并发展了“脑髓”理论，且提出了“髓虚毒损”的病机观，认为PD以脑髓亏虚为本，风痰瘀毒为标^[4]。脑髓为“元神之府”，赖肾精化生、气血濡养，髓虚则神机失用，筋脉失主，发为震颤、僵直；毒损则络脉瘀阻，阴阳失衡，致使PD的发病和加重，继发一系列并发症。在“脑髓”理论的指导下，任继学形成了“益髓填精”的治则，并根据多年临床经验形成自拟方——参鹿抑颤方^[4-6]，本团队将参鹿抑颤方结合现代科技研制成中药复方制剂，由鹿茸3 g，龟甲20 g，枸杞子15 g，人参10 g，天麻15 g，菊花15 g，全蝎5 g，僵蚕15 g，伸筋草18 g，豨莶草18 g，鸡血藤20 g，山茱萸18 g，乌梅15 g，黄芪30 g组成，具有益精填髓，通络祛邪，平调阴阳的功效。PD黑质多巴胺能神经元缺失的主要发生机制是细胞凋亡，这是PD发病过程中的共同通路。这种凋亡主要由线粒体通路介导。在此通路中，Bax起着关键的启动作用，它能增加线粒体膜通透性，导致细胞色素C（CytC）释放，并激活下游的Caspase蛋白酶执行凋亡程序；而抗凋亡蛋白Bcl-2则能稳定线粒体膜，抑制CytC释放^[7-8]，因此决定多巴胺能神经元凋亡命运的关键因素是Bax与Bcl-2的比率^[7]。鉴于Bcl-2显著的抗凋亡作用，靶向调控Bcl-2/Bax平衡展现出治疗PD的潜在优势。本研究的目的是研究参鹿抑颤颗粒对PD小鼠细胞程序性死亡的影响及其作用机制，以便为其在临床上的应用提供理论支持。

1 材料

1.1 实验动物

实验选择7周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠共50只，体质量均为18～20 g，分成5组，即低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、空白组，每组10只。实验小鼠采用鼠维持用强化颗粒饲料喂养，实验小鼠及饲料由长春亿斯实验动物技术有限公司供应，实验动物合格许可证号：SYXK（吉）2018-0007。实验小鼠在实验开始前1周进行适应性饲养。实验动物均于长春中医药大学实验动物中心饲养，环境温度控制在24℃～26℃，采用自然节律光，实验动物房每日为小鼠提供自由取食、饮水等条件。实验动物垫料每日更换，饮水每日更换。本实验遵守长春中医药大学实验动物福利与伦理规定，伦理批准编号为2022206。

1.2 实验药物

参鹿抑颤颗粒：主要由人参、鹿角、龟甲、生黄芪、枸杞子、山茱萸、天麻、全蝎、僵蚕、伸筋草、豨莶草、鸡血藤、菊花、乌梅组成，由长春中医药大学附属医院提供药材。另采用多巴丝肼片（商品名：美多芭，生产厂家：山东新华制药股份有限公司，批号：10930198），每片含左旋多巴200 mg与苄丝肼50 mg[（相当于盐酸苄丝肼57 mg），每盒40片]，以临床维持剂量为参考，根据人与实验动物药物等效剂量换算方法^[9]，得出小鼠每日所需多巴丝肼剂量为97.5 mg/kg。

1.3 试剂及耗材

本实验所需的试剂和材料包括：兔抗小鼠Bcl-2、Bax多克隆抗体（万类生物科技公司）、PVDF膜（0.45 μm）（美国Roche公司）、甘氨酸（BioFroxx公司）、双染预染蛋白Marker（Proteintech公司）、牛血清白蛋白（美国Sigma-Aldrich公司）、RIPA裂解液（Proteintech公司）、脱脂奶粉（BioFroxx公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司）、MPTP（Apexbio公司）、过硫酸铵（美国Sigma公司）、十二烷基硫酸钠（BioFroxx公司）、吐温20（北京索莱宝生物科技有限公司）、三羟甲基氨基甲烷（BioFroxx公司）、甲醇（广东光华科技有限公司）、无水乙醇（北京化工厂有限责任公司）、TEMED（美国Sigma公司）、30%丙烯酰胺溶液（北京索莱宝生物科技有限公司）、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（碧云天生物技术有限公司）、1.5M Tris-HCl，pH8.8（Proteintech公司）、1M Tris-HCl，pH6.8（Proteintech公司）、氯化钠（北京化工厂）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（Proteintech公司）。

1.4 仪器及设备

Morris水迷宫（北京众实迪创科技发展有限责任公司）、高速组织研磨仪（塞维尔生物科技有限公司）、微量高速离心机（美国Thermo公司）、石蜡包埋机（德国Leica公司）、Western blot电泳仪（Bio-Rad公司）、-80℃低温冰箱（美国ThermoForma公司）、多标记微孔板检测仪（瑞士Tecan公司）、转棒式疲劳仪（YLS-4C）（济南益延科技发展有限公司）、动物麻醉机（美国Matrx公司）、AUW220D电子分析天平（日本岛津公司）、纯水仪（浙江森涛科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组及造模方案

实验采用随机数字表法，将适应性喂养后的50只C57BL/6小鼠均分为5组处理：空白组、模型组和高、中、低剂量组（参鹿抑颤颗粒高、中、低剂量组）。实验全程保证动物自由摄食及饮水。造模与干预方案，空白组：实验首日即启动给药程序，采用每日定时腹腔注射生理盐水的方式，给药体积按照0.01 mL/g体质量计算，单次给药，实验周期维持5 d。模型组：于实验首日启动造模程序，通过每日腹腔注射MPTP（剂量30 mg/kg）建立模型，给药体积仍按0.01 mL/g体质量计算，单次给药，连续处理5 d。

高、中、低剂量组：自实验第1天开始，每日1次，定时腹腔注射MPTP（30 mg/kg），单次给药体积为0.01 m/g，连续处理5 d；对各剂量组小鼠，在末次MPTP给药后2 h，分别给出相应浓度的参鹿抑颤溶液，并灌胃给药（高、中、低剂量：38 g/kg、19 g/kg、9.5 g/kg），连续干预14 d。

2.2 检测指标及方法

在用药干预结束后进行旷场实验测试，转棒实验测试及爬杆实验测试；在灌胃14 d实验结束后取材，Western blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达。

2.2.1 旷场实验测试

采用方形观察箱，规格为47 cm×47 cm×40 cm。测试开始前，使用75%乙醇彻底擦拭箱体内壁和底部，避免动物遗留信息干扰实验结果^[10]。提前将小鼠放置在测试室内适应环境30 min^[11]。实验开始时，将小鼠轻柔地置于箱体中心，让其自由活动，启动软件，连续记录小鼠自主活动10 min。通过Tracking Master软件（版本V3.0，赛维特生物科技有限公司，中国上海）计算并提取小鼠的运动持续时间、活动位移及运动速率等行为学参数，判断其运动能力。

2.2.2 转棒实验测试

将小鼠置于转棒测试仪的旋转杆上，启动程序控制转速由4 r/min逐步加速至最大速度40 r/min，持续5 min。记录小鼠首次从杆上掉落的时间，若超过300 s仍未掉落，则默认终止测试。

2.2.3 爬杆实验测试

正式测试前3天，每天进行2次爬杆预实验^[12]。采用一根长50 cm直径1 cm的木杆，固定在小鼠的笼盒中，倾斜45°放置，在小木杆顶端固定直径25 mm的软木球，并用医用胶布包裹球体与杆体，增加摩擦防滑。将小鼠头部朝下置于球面，任其自主攀爬至杆底，记录下爬杆时间^[13]。

2.2.4 免疫组化法检测大脑黑质TH表达

将固定4%多聚甲醛中的脑组织经石蜡包埋、切片及常规预处理后，先后与一抗和二抗进行孵育、冲洗，DAB显色后再次水洗、复染、脱水、透明及封片，以累积吸光度值为统计指标，利用Image J软件对TH表达强度进行定量分析^[14]。

2.2.5 Western blot检测蛋白表达水平

小鼠黑质组织加入适量RIPA裂解液，经冰上充分匀浆后，以12 000×g于4℃离心15 min，分离上清液用于后续分析。采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度^[15]。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE分离，随后转膜至PVDF膜上并用5%脱脂奶粉室温封闭2 h^[16]；加入一抗α-syn（1:1 000稀释）、Bcl-2（1:1 000稀释）、Bax（1:1 000稀释），4℃孵育过夜；次日以TBST缓冲液洗涤后，加入HRP标记的相应二抗（1:2 000稀释），室温孵育1 h，再次TBST洗涤。最后采用ECL化学发光法显影，并以Image J软件分别分析经GAPDH校正的α-syn相对表达量与Bcl-2与Bax条带灰度比值^[17]。

2.3 统计学分析

采用SPSS 26.0进行数据分析，数据以均数±标准差（\overline{x}±s）表示，多组差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间多重比较使用LSD法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组小鼠神经行为学检测结果

参鹿抑颤颗粒对帕金森病小鼠行为学检测结果表明（图1A～C），在旷场实验中，模型组与空白组小鼠的各项行为学参数具有明显差异（P＜0.05），与模型组相比，高、中、低剂量组小鼠运动能力和空间探索能力得到明显提升，高剂量组改善更为明显（P＜0.01）。在转棒实验（图1-D）中，约半数空白组小鼠可在设备上维持至最长300 s，而模型组小鼠运动耐力显著减退（P＜0.01），提示造模有效；经参鹿抑颤颗粒干预后，小鼠滞留时长较模型组显著增加（P＜0.01）。爬杆实验（图1-E）显示，动物底部抵达耗时与肢体协调性呈正相关，时间延长代表运动功能受损。模型组动物完成时间较空白组显著延长（P＜0.01）；与模型组相比，高、中、低剂量组小鼠爬杆时间明显缩短（P＜0.01）。说明参鹿抑颤颗粒可改善PD小鼠肢体协调能力，其中高剂量组效果显著。

3.2 参鹿抑颤方改善了MPTP诱导的PD 小鼠病理学变化

酪氨酸羟化酶（TH）作为多巴胺（DA）合成过程中的关键限速酶，是多巴胺能神经元的重要标志性蛋白。在MPTP所诱导的帕金森病（PD）模型小鼠的黑质致密部中，TH阳性神经元的数量可反映多巴胺能神经元受损的程度。为探讨参鹿抑颤颗粒对MPTP所致多巴胺能神经元损伤是否具有保护作用，采用免疫组化（IHC）方法检测了黑质区域TH的表达（如图2）。IHC结果显示，模型组小鼠黑质中TH阳性细胞数显著降低，而经参鹿抑颤颗粒干预后，该指标出现回升，其中高剂量组的改善效果尤为显著。α-syn是PD主要的病理产物之一，其错误折叠聚集会导致路易小体的形成。Western blot结果显示，MPTP显著上调α-syn表达，而经参鹿抑颤颗粒干预后，其表达被有效抑制，高剂量组效果更为明显。

3.3 各组小鼠Bcl-2/Bax蛋白表达含量的比较

如图3。

4 讨论

帕金森病（PD）属中医“颤证”“痉证”范畴^[18]。任继学认为帕金森病的发生主要是“髓虚毒损”和“伏邪”作用的结果。首先，“髓虚”是帕金森病的核心病机之一。脑髓由肾精化生，赖气血濡养；肾精若亏损，则髓海空虚，脑失所养而功能受损，表现为震颤、拘挛、行动缓慢等症状。脑髓亏虚导致“五神失摄”，即魂、魄、意、志、神等功能失调，进一步引发肢体震颤、肌肉僵硬等症状^[4，19]。其次，“毒损”是指风痰瘀毒阻滞经络，影响神机的正常运作，五神失摄，则表现为震颤、肌肉僵硬等症状。此外，“伏邪理论”也为帕金森病的发病机制提供了重要解释。伏邪是指潜伏在人体内的邪气，包括外感六淫、内伤七情、饮食失节等因素。尤其是内伤伏邪，如痰饮、瘀血等有形实邪，这些邪气久藏于机体，遇诱因则发作，导致气机升降失常，脏腑功能失调，进而引发肢体震颤、肌肉僵硬等症状，使疾病进一步发生和发展^[20]。

任继学的“脑髓理论”和“伏邪理论”为帕金森病的治疗提供了重要的理论基石，通过补肾填精充髓海、益气养血调神机、熄风通络祛毒邪，实现“补髓御毒，形神共治”，为帕金森病的中医治疗提供了理论深化与临床参考。其中鹿茸、人参为君药，任继学认为，脑髓的生成依赖于肾精的化生，肾精充足则髓海充盈，脑功能得以正常发挥。鹿茸作为血肉有情之品，直入下焦，填补肾精，改善脑髓亏虚，促进黑质区多巴胺能神经元再生，改善脑髓精质体（中太极）功能；同时强调，脑髓依赖于气血的濡养，气血旺盛则脑髓得养，神机得畅^[21]。人参可以改善脑髓的防御体系和营养体系功能，增强气血通利，推动气血上荣于脑，濡养白质体（防御体系），缓解运动迟缓、气短乏力。体现“先天后天互资”之妙。二者共为君药，一温一补，阴阳相济，共奏充髓海、壮元神之功。

龟甲、枸杞子、山茱萸为臣药，能够滋补肝肾。龟甲性寒，滋阴潜阳，滋填任脉，与鹿茸形成“阳生阴长”之势，阴阳并补，填补肾精，充养髓海，改善脑髓亏虚。枸杞益精明目，能够增强肝肾精气，助君药完成“肾-髓-脑”精血转化。山茱萸固精缩尿，具有滋补肝肾、固摄精气的作用，调节髓血转化，减少神经元凋亡。龟甲修复阴血亏虚所致虚风内动，枸杞子濡养脑髓微太极（神经细胞），协同君药改善腰膝酸软、头晕耳鸣；山茱萸固精以防耗散，任继学的琼室津充理论认为阴精与三焦的协同作用，可以使津液充盛且输布有序，维持“气-精-液”的动态平衡。此三药合用，精妙之处就在于此。

佐药有黄芪、天麻、全蝎、僵蚕，起到补气升阳，熄风通络的作用。黄芪助人参强化气血运行，推动气血上荣于脑，改善脑髓的防御体系和营养体系功能，增强脑中血海灌注，改善面色苍白。任继学指出，肝风内动是帕金森病的重要病机之一，天麻具有平肝熄风、通络止痉的作用。全蝎、僵蚕具有祛风通络、搜剔络毒的作用，防止毒损进一步耗髓。三者合用以制肝阳化风，清除瘀毒，调和脏腑、畅通气机，使五神“归位统御”，充分针对了任继学提出的“五神失统”病机^[22]。

伸筋草、豨莶草、鸡血藤、乌梅、菊花共为使药以调和营卫。任继学指出，脑髓的防御体系涵盖卫气、津液，伸筋草、豨莶草、鸡血藤三药祛风湿、通血络，助营卫调和，改善腠理开张与肌肉收缩失衡，修复脑髓细络（小太极通道），促进神机传导。乌梅具有敛肺生津、安神止痉的作用，调节脑髓阴阳气化，抑制虚风内旋，改善口干、肌肉震颤等症状^[23]。菊花清肝明目，疏散风热。乌梅酸敛生津固髓（静），菊花清肝疏风（动），体现任继学以“阴阳互根、动静相宜”为核心的“太极动静”观。

参鹿抑颤颗粒以任继学脑髓理论为纲，通过鹿茸、人参为君，峻补精血、益气生髓，协同臣佐诸药熄风通络、调和阴阳。方中鹿茸与人参相须为用，先天后天并重，气血精髓同调，为帕金森病的中医治疗提供创新思路。综上，参鹿抑颤颗粒改善了MPTP诱导的帕金森病小鼠病理学变化，对帕金森病小鼠的神经行为学障碍具有显著改善作用。其潜在机制可抑制帕金森病小鼠的细胞凋亡反应，进而达成“补髓御毒，形神共治”。

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基金资助

2022年度吉林省发展与改革委员会课题(2022C041-2)

2022年度吉林省科学技术厅课题(20220204006YY)