散结通脉方调控巨噬细胞脂质代谢和M1/M2极化治疗动脉粥样硬化的机制研究

A mechanistic study of Sanjie Tongmai Formula in the treatment of atherosclerosis through modulation of macrophage lipid metabolism and M1/M2 polarization

摘要

目的 探讨散结通脉方对动脉粥样硬化（AS）巨噬细胞脂质代谢、M1/M2极化的影响及其潜在机制。 方法 采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导巨噬细胞建立AS体外模型，分为空白组、模型组、散结通脉方低剂量组和散结通脉方高剂量组。通过CCK-8、油红O染色、EdU、Transwell、生化试剂盒、RT-qPCR测序检测细胞活力、脂质沉积、增殖迁移、脂质代谢、巨噬细胞极化及转录组变化。 结果 散结通脉方最佳干预浓度为20 µg/mL，与空白组相比，模型组巨噬细胞增殖、迁移及总胆固醇含量升高，游离胆固醇含量降低，脂质代谢相关基因ACAT1、CD36、SR-AI、LOX-1的表达上调，nCEH、ABCA1、ABCG1的表达下调，M1标志物iNOS、TNF-α、IL-1β表达升高，M2标志物Arg-1、CD163、IL-10表达降低；与模型组相比，散结通脉方可显著逆转上述变化，且高剂量作用更明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。转录组分析显示，散结通脉方主要调控炎症反应、氧化还原酶活性及Wnt、MAPK、IL-17、JAK-STAT等信号通路。 结论 散结通脉方可改善AS巨噬细胞脂质代谢紊乱，促进M2极化并抑制M1极化，其作用可能与调控Wnt、MAPK、IL-17和JAK-STAT信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effects of Sanjie Tongmai Formula (SJTMF) on lipid metabolism and M1/M2 polarization in macrophages under atherosclerotic conditions, and to explore its underlying mechanisms. Methods An in vitro atherosclerosis (AS) model was established in macrophages induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL). The macrophages were assigned to 4 groups: control, model, low-dose SJTMF, and high-dose SJTMF. The cell viability, lipid accumulation, proliferation, migration, lipid metabolic activity, macrophage polarization, and transcriptomic alterations were evaluated by CCK-8 assay, Oil Red O staining, EdU, Transwell assay, biochemical assay kits, RT-qPCR, and RNA sequencing. Results The optimal intervention concentration of Sanjie Tongmai Formula was 20 μg/mL. Compared with the control group, macrophages in the model group exhibited significantly increased proliferation, migration, and total cholesterol content, but reduced free cholesterol levels. The expression of lipid metabolism-related genes, including ACAT1, CD36, SR-AI, and LOX-1, was markedly upregulated, whereas nCEH, ABCA1, and ABCG1 was downregulated. In parallel, the expression of M1 polarization markers (iNOS, TNF- α, and IL-1β) was increased, whereas that of M2 markers (Arg-1, CD163, and IL-10) was decreased. The treatment with SJTMF significantly reversed these changes, with the high-dose group showing stronger effects than the low-dose group (P<0.05). The transcriptomic analyses further revealed that SJTMF primarily regulated genes involved in inflammatory responses, oxidoreductase activity, and multiple signaling pathways, including the Wnt, MAPK, IL-17, and JAK-STAT pathways. Conclusion SJTMF ameliorates lipid metabolic dysfunction in AS macrophages, promotes M2 polarization, and suppresses M1 polarization. These effects may be mediated through the regulation of Wnt, MAPK, IL-17, and JAK-STAT signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

散结通脉方 / 动脉粥样硬化 / 巨噬细胞 / 脂质代谢

Key words

Sanjie Tongmai Formula / atherosclerosis / macrophage / lipid metabolism

心血管疾病目前已成为我国重大的公共卫生问题，给居民和社会带来的经济负担日渐加重^[1]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种主要影响大动脉和中动脉的慢性炎症，是心血管疾病的主要病理基础^[2]。巨噬细胞是炎症反应的关键介质。既往研究表明，巨噬细胞参与AS发展和进展，被认为是AS重要的治疗靶点^[3-4]。散结通脉方是基于首届全国名中医黄永生提出的“瘀能化水”理论，以“化瘀清痰利水”为核心治法研发的治疗AS的中药新复方。课题组前期临床研究^[5-6]显示，散结通脉方可有效改善AS患者脂质代谢紊乱，逆转动脉粥样斑块。课题组前期动物研究^[7-8]发现，散结通脉方可有效改善ApoE^-/-小鼠AS。然而，目前关于散结通脉方治疗AS的潜在机制还不是十分明确，这限制了散结通脉方在临床上的进一步推广。因此，本研究通过观察散结通脉方对AS巨噬细胞脂质代谢和极化的影响，运用RNA测序（RNA-seq）技术，探究散结通脉方治疗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞

Raw264.7细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司（货号CL-0190）。

1.2 主要试剂

氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）购自上海源叶生物科技有限公司（货号S24879），总胆固醇（TC）含量检测试剂盒（货号BC1985）、游离胆固醇（FC）含量检测试剂盒（货号BC1895）和改良油红O染色试剂盒（货号G1261）购自北京索莱宝科技有限公司，细胞计数试剂盒（CCK-8）（货号C0037）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EDU）检测试剂盒（货号C0071S）购自上海碧云天生物技术有限公司，SYBR Green PCR试剂盒（货号AQ131）购自北京全式金生物技术有限公司，Transwell细胞培养小室购自美国Falcon公司（货号353097）。

1.3 药物

散结通脉方由丹参、水蛭、三七、煅花蕊石、茵陈、茯苓、泽泻、砂仁、檀香、僵蚕、蝉蜕、枳壳、陈皮和竹茹组成，组成该方的药材均由长春中医药大学附属医院实验研究中心提供^[8-9]。药材浸泡后煎煮2遍，将煎煮的药液合并，过滤后用真空旋转蒸发仪将散结通脉方水提液浓缩至2 g/mL，4℃保存。

1.4 CCK-8

Raw264.7细胞以1×10⁴个/孔铺在96孔板里培养。对于散结通脉方对巨噬细胞活力影响的实验，Raw264.7细胞在培养12 h后，加入不同浓度的散结通脉方干预24 h。对于散结通脉方对AS巨噬细胞活力影响的实验，Raw264.7细胞在培养12 h后，利用不同浓度的散结通脉方干预Raw264.7细胞24 h，再使用25 μg/mL的ox-LDL干预24 h。ox-LDL干预巨噬细胞的最佳浓度参考课题组前期预实验。

1.5 油红O染色

Raw264.7细胞以2×10⁵个/孔接种在24孔板中，后续按照实验方案进行处理。

1.6 EdU染色

Raw264.7细胞以1×10⁵个/孔接种于24孔板中，后续按照实验方案进行处理。

1.7 Transwell

使用无血清培养基将Raw 264.7细胞浓度调整到2×10⁵个/mL，随后将200 μL含细胞的培养液加入置有Transwell小室的24孔板中，后续按照实验方案进行处理。

1.8 生化检测

按照试剂盒说明书检测细胞上清中TC和FC含量。

1.9 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

使用Trizol法分离提取Raw264.7细胞总RNA，将RNA逆转录成cDNA后使用PCR仪检测目的基因的表达。以GAPDH作为内部对照，采用2^-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并提供。引物见表1。

1.10 RNA-seq

RNA-seq由武汉灵思生物技术有限公司完成。差异表达基因筛选条件为|FoldChange|≥2且pval≤0.05。差异表达基因进行基因本体论（GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.1软件进行数据处理。数据用均数±标准差（\overline{x}±s）表示，组间差异比较使用非配对学生t检验，3组及3组以上差异比较使用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey's事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 散结通脉方干预剂量筛选

根据油红O染色，散结通脉方干预计量为20 µg/mL时，对减少AS巨噬细胞中脂滴沉积效果最显著。见表2和表3，如图1。

2.2 散结通脉方对AS巨噬细胞增殖和迁移的影响

散结通脉方可以减少AS巨噬细胞的增殖和迁移。如图2和图3，见表4和表5。

2.3 各组巨噬细胞上清中TC和FC含量比较

见表6。

2.4 各组巨噬细胞中脂质代谢基因ACAT1、nCEH、ABCA1、ABCG1、CD36、SR-AI和LOX-1相对表达量比较

见表7。

2.5 各组巨噬细胞中M1/M2极化基因iNOS、TNF-α、IL-1β、Arg-1、CD163、IL-10相对表达量比较

见表8。

2.6 散结通脉方对AS巨噬细胞转录组的影响

主成分分析显示，3组巨噬细胞的基因表达存在明显差异。与空白对照组相比，模型对照组巨噬细胞中有361个基因的表达发生显著改变，其中205个基因的表达显著下调，156个基因的表达显著上调；与模型对照组相比，散结通脉方高剂量组巨噬细胞中有534个基因的表达发生显著改变，其中400个基因的表达显著上调，134个基因的表达显著下调。韦恩图结果显示，两个比较组共有129个差异表达基因。如图4。

GO分析结果显示，空白对照组与模型对照组差异表达基因主要与酰基辅酶a代谢过程等生物过程（BP）相关，与肌动蛋白肌球蛋白复合体等细胞组分（CC）相关，与跨膜转运蛋白活性等分子功能（MF）相关；模型对照组与散结通脉方高剂量组差异表达基因主要与炎症反应等BP相关，与核小体和异三聚体G蛋白复合物等CC相关，与趋化因子受体活性等CC相关。

KEGG分析结果显示，空白对照组与模型对照组差异表达基因主要与MAPK信号通路、IL-17信号通路、脂肪的消化与吸收、Toll样受体信号通路、α-亚麻酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成等通路相关；模型对照组与散结通脉方高剂量组差异表达基因主要与Wnt信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路和不饱和脂肪酸的生物合成等通路相关。如图5。

3 讨论

AS的一个典型病理特征是冠状动脉中促炎M1型巨噬细胞积聚^[10]。与具有脂质处理和组织修复能力的M2型巨噬细胞不同，M1型巨噬细胞在胆固醇外排和脂质降解方面存在明显缺陷，难以有效处理吞噬进入细胞内的ox-LDL。过量的胆固醇在细胞内以胆固醇酯形式沉积于脂滴中，最终促使巨噬细胞转化为泡沫细胞。泡沫细胞的持续积聚不仅构成了动脉粥样硬化斑块的核心成分，还通过分泌多种炎症介质和趋化因子，进一步招募单核细胞并放大局部炎症反应，从而形成脂质沉积与炎症激活相互促进的恶性循环。随着病程进展，泡沫细胞凋亡和坏死会导致坏死核心扩大和纤维帽变薄，显著增加斑块破裂和急性冠脉事件发生的风险。因此，调控巨噬细胞极化状态、改善其脂质代谢能力并抑制泡沫细胞形成，被认为是防治AS的重要策略。

本研究发现，散结通脉方减少了AS巨噬细胞中脂滴沉积、抑制细胞增殖和迁移。此外，散结通脉方减少了AS巨噬细胞中TC含量、增加FC含量。同时，散结通脉方下调了AS巨噬细胞中ACAT1、CD36、SR-AI和LOX-1基因的表达、上调了nCEH、ABCA1和ABCG1基因的表达。前人研究^[11]表明，胆固醇酯化反应关键酶ACAT1表达增加、胆固醇外排转运蛋白ABCA1和ABCG1表达降低将增加ox-LDL干预的巨噬细胞胆固醇吞噬和积累，促进泡沫细胞形成。巨噬细胞中清道夫受体CD36、SR-AI和LOX-1表达水平升高将会促进巨噬细胞脂质摄取^[12]。nCEH可通过水解脂滴中的胆固醇酯进而释放胆固醇，是胆固醇再利用/清除的关键限速步骤之一。下调nCEH表达将促进ox-LDL诱导的骨髓间充质干细胞脂质沉积^[13]。此外，散结通脉方显著降低了AS巨噬细胞中iNOS、TNF-α和IL-1β表达，增加Arg-1、CD163和IL-10表达。促炎M1型巨噬细胞通常表现为iNOS、TNF-α和IL-1β表达的上调，而抗炎M2型巨噬细胞通常表现为Arg-1、CD163和IL-10表达的上调。因此，散结通脉方可以促进AS巨噬细胞中脂质代谢，进而减少脂质沉积，其机制可能与散结通脉方促进AS巨噬细胞M2极化、抑制M1极化相关。

RNA-seq结果显示，散结通脉方改变了AS巨噬细胞中与炎症反应和氧化还原酶活性等功能相关的基因表达。此外，散结通脉方也改变了AS巨噬细胞中与Wnt信号通路、酪氨酸代谢、MAPK信号通路、IL-17信号通路、JAK-STAT信号通路和不饱和脂肪酸的生物合成等通路相关的基因表达。人类遗传学数据^[14]表明，Wnt功能缺失突变与AS早发有关。增强巨噬细胞中Wnt信号通路可以促进斑块消退。抑制MAPK信号通路可以缓解ox-LDL诱导的Raw264.7巨噬细胞泡沫化^[15]。糖尿病急性心肌梗死患者体内IL-17的表达水平显著升高^[16]。进一步研究表明，IL-17信号通路的激活可以显著加剧冠状动脉粥样硬化的复杂性。抑制JAK/STAT可以显著减少泡沫细胞的数量以及细胞内的脂质含量，从而减轻动脉粥样硬化病变^[17]。因此，散结通脉方可能通过调节Wnt信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路和JAK-STAT信号减少泡沫细胞的数量以及细胞内的脂质含量。

综上所述，本研究揭示，散结通脉方可以促进AS巨噬细胞脂质代谢，进而减少脂质沉积，这可能与散结通脉方促进AS巨噬细胞M2极化、抑制M1极化相关。本研究结果为散结通脉方在临床上治疗AS提供了坚实的理论基础，为后续的机制探索提供了具有价值的研究方向。

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基金资助

吉林省发展和改革委员会基金项目(2018C048-1)