助阳通痹颗粒抑制肺间质纤维化模型大鼠肺组织凋亡的机制研究

Study on the mechanisms of Zhuyang Tongbi Granules on inhibiting lung tissue apoptosis in rats with pulmonary interstitial fibrosis

摘要

目的 探讨助阳通痹颗粒对博来霉素诱导的大鼠肺间质纤维化（PIF）的防治作用及其潜在机制。 方法 SPF级Wistar大鼠60只随机分为假手术组、模型组、醋酸泼尼松组（5 mg/kg）及助阳通痹颗粒低、中、高剂量组（2.7 g/kg、5.4 g/kg、10.8 g/kg），除假手术组气管注入等量生理盐水外，其余各组气管注入博来霉素（5 mg/kg）建立PIF模型，自次日起灌胃相应药物28 d。末次给药后采用HE染色观察肺组织形态；ELISA测定血清TNF-α、TGF-β、HMGB1；Western blot和qPCR检测肺组织Caspase-3、Fas、FasL的蛋白和 mRNA表达。 结果 与假手术组相比，模型组肺泡结构破坏严重，炎性细胞浸润及纤维结缔组织增生显著；血清TNF-α、TGF-β、HMGB1升高（P＜0.05），Caspase-3、Fas、FasL蛋白及mRNA表达上调（P＜0.01）。与模型组相比，醋酸泼尼松组及助阳通痹颗粒高、中剂量组显著改善肺组织病理损伤，TNF-α、TGF-β、HMGB1水平含量降低（P＜0.05；P＜0.01），Caspase-3、Fas、FasL蛋白及mRNA表达降低（P＜0.05；P＜0.01），且呈剂量依赖性；低剂量组仅表现出部分指标下降趋势。 结论 助阳通痹颗粒可通过抑制炎性因子释放、下调Fas/FasL介导的细胞凋亡通路，减轻博来霉素诱导的大鼠肺间质纤维化，为其临床防治PIF提供依据。

Abstract

Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of Zhuyang Tongbi Granules on bleomycin-induced pulmonary interstitial fibrosis (PIF) in rats, and to explore its potential mechanisms via inflammatory factors and the Fas/FasL-mediated apoptosis pathway. Methods Sixty SPF-grade Wistar rats were randomly divided into six groups: sham-operated group, model group, prednisone acetate group (5 mg/kg), and Zhuyang Tongbi Granules low- (2.7 g/kg), medium- (5.4 g/kg), and high-dose groups (10.8 g/kg). Except that the sham group received an intratracheal injection of normal saline, all other groups were administered bleomycin (5 mg/kg) intratracheally to establish a PIF model. From the next day, the respective drugs were administered by gavage for 28 days. After the final administration, the lung tissue morphology was observed using HE staining; the serum levels of TNF-α, TGF-β, and HMGB1 were measured by ELISA; the protein and mRNA expressions of Caspase-3, Fas, and FasL in lung tissue were detected by Western blot and PCR. A statistical analysis was performed using SPSS 25.0. Results Compared with the sham group, the model group exhibited a severe destruction of alveolar structure, significant infiltration of inflammatory cells, and proliferation of fibrous connective tissue, while the serum levels of TNF-α, TGF-β, and HMGB1 were significantly increased (P<0.05), and the protein and mRNA expression levels of Caspase-3, Fas, and FasL were significantly upregulated (P<0.01). Compared with the model group, the prednisone acetate and high- and medium-dose Zhuyang Tongbi Granules groups showed a significant improvement in the lung tissue pathology damage, decreased levels of TNF-α, TGF-β, and HMGB1 (P<0.05 or P<0.01), and a suppressed protein and mRNA expression of Caspase-3, Fas, and FasL (P<0.05 or P<0.01) in a dose-dependent manner, while the low-dose group showed only a downward trend in some indicators. Conclusion Zhuyang Tongbi Granules can alleviate bleomycin-induced pulmonary interstitial fibrosis in rats by inhibiting the inflammatory cytokine release and downregulating the Fas/FasL-mediated apoptosis pathway, providing experimental evidence for its clinical application in PIF prevention and treatment.

Graphical abstract

关键词

肺间质纤维化 / 助阳通痹颗粒 / 细胞凋亡 / 炎症

Key words

pulmonary interstitial fibrosis / Zhuyang Tongbi Granules / apoptosis / inflammation

肺间质纤维化（pulmonary interstitial fibrosis，PIF）是一种以肺组织结构破坏、炎性细胞浸润及纤维结缔组织异常增生为特征的慢性进行性肺部疾病^[1]。其病理过程涉及多种细胞因子和信号通路的异常调控，最终导致肺功能不可逆下降，严重影响患者生活质量，甚至危及生命^[2]。近年来，研究发现Fas/FasL信号通路在PIF的发生发展中起着关键作用。Fas是一种细胞表面受体，FasL是其配体，二者结合后可激活细胞内凋亡信号传导途径，导致细胞凋亡^[3]。在PIF过程中，肺泡上皮细胞持续受到损伤刺激，Fas/FasL信号通路过度激活，使肺泡上皮细胞凋亡增加。凋亡的肺泡上皮细胞释放多种细胞因子和趋化因子，招募炎性细胞和纤维母细胞，促进细胞外基质的合成和沉积，最终导致肺间质纤维化的形成^[4]。中医药在治疗PIF方面具有独特优势，助阳通痹颗粒是根据王檀所创立的助阳通痹汤改进而成，药物由熟地黄、鹿茸、肉桂、炙麻黄、炮姜、人参、炙甘草、桃仁、红花、豨莶草等组成，由长春中医药大学附属医院制剂中心根据配方精制成颗粒，诸多中药共用可层层宣通，布阳气，化阴凝，促使阴血环流，畅通水津流通全身，从而促使肺痹指征获得有效治疗^[5]。前期研究^[6-7]表明，助阳通痹颗粒在调节免疫功能、抗炎和抗纤维化方面具有潜在作用，但其具体机制尚不明确。本研究旨在探讨助阳通痹颗粒对博来霉素诱导的大鼠PIF模型的防治作用，重点关注其是否通过调控Fas/FasL信号通路发挥作用。通过动物实验，观察助阳通痹颗粒对肺组织形态、炎性因子水平及Fas/FasL通路相关蛋白和基因表达的影响，旨在为其临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

本研究中所有涉及动物的实验操作均按照长春中医药大学的动物伦理委员会制定的标准和指南进行，并获得了该委员会的批准（批准文号：2022574）。实验动物饲养符合标准的环境中。本实验选用SPF级Wistar大鼠60只，体质量在200～220 g之间。动物购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号为SCXK（辽）2020-0001。

1.2 药品与试剂

助阳通痹颗粒（20230301，长春中医药大学附属医院制剂中心）；醋酸泼尼松片（H12020689，天津天药药业股份有限公司）；注射用盐酸博来霉素（H20055883，瀚晖制药有限公司）；注射用青霉素钠（H13020655，华北制药股份有限公司）；RIPA裂解液（中）（P0013C，碧云天）；蛋白酶抑制剂混合物（P1005，碧云天）；BCA蛋白浓度测定kit（MD913053，MDL）；SDS-PAGE预制胶套装kit（MD911919，MDL）；三色预染蛋白质宽域分子量标准品（10-180kDa）（中生奥邦）；HRP-山羊抗小鼠二抗（C030205，塞尔维）；HRP-兔抗大鼠IgG（C030226，塞尔维）；HRP-山羊抗兔IgG（C030212，塞尔维）；β-actin抗体（AF7018，Affinity）；FasL抗体（AF5333，Affinity）；TRIZOL（RN0102，艾德莱公司）；无水乙醇（E809056，麦克林公司）；异丙醇（I811925，麦克林公司）；DEPC（MD911875，MDL公司）；UltraPure Agarose（SH441-01，博迈德生物公司）；SuperScript III RT 逆转录kit（A502，EXONGEN公司）；Sybr qPCR mix（4472920，ABI-Invitrogen公司）。

1.3 实验仪器

研磨机（型号 N.9548）购自中国北京赫德公司；超声波细胞破碎仪（型号XC-CD）购自中国先倡公司；金属浴（型号H203-H）购自中国COYOTE公司；NC膜（型号ISEQ00010，孔径0.22 μm）购自美国GVS公司；3MM滤纸（型号 3030861）购自英国Whatman公司；摇床（型号TS-8）购自中国其林贝尔公司；电泳电源（型号LF-2000）购自中国龙方公司；转模槽（型号JY-ZY6）购自中国君意东方公司；低温离心机（型号CF1524R）购自中国SEILOGEX公司；SDS-PAGE电泳系统（型号MiniProGel™）购自中国碧云天公司；化学发光成像仪（型号ChemiScope6100）购自中国CLINX勤翔科学仪器有限公司。台式高速冷冻离心机（型号CF1524R）购自中国LABGIC公司；分光光度计（型号Unano-1000）购自中国优米仪器公司；荧光定量PCR仪（型号Q2000B）购自中国 Longgene公司；电泳仪（型号EPS300）购自美国 Bio-Rad公司；凝胶成像仪（型号JY02S）购自中国北京东方君意公司。

2 方法

2.1 动物饲养与分组

分笼饲养，饲养条件（室温22℃～26℃，空气湿度45%～65%，光照/黑暗12 h循环），自由食水。将60只大鼠随机分为假手术组10只和造模组50只，假手术组注入生理盐水，造模组注入博来霉素生理盐水溶液，造模后将大鼠随机分为模型组，高、中、低剂量组和醋酸泼尼松组，每组10只。

2.2 动物造模

术前通过灭菌舱传递所有手术器械，使用1%戊巴比妥钠3 mL/kg腹腔注射对大鼠进行麻醉。在实验结束后的第28天，各组大鼠在末次灌胃给药后，首先进行体质量测量。随后，采用3%戊巴比妥钠（30  mg/kg）腹腔注射进行麻醉，确保大鼠处于深度麻醉状态。大鼠仰卧固定于手术台上，进行颈部剪毛和碘伏消毒。通过颈部正中切口，分离并暴露气管。使用微量注射器经气管软骨环间隙向心端刺入，缓慢注入博来霉素溶液（5 mg/kg，0.2  mL），注射完成后，将大鼠直立并轻轻旋转，使药液在肺内均匀分布。随后，缝合皮肤并进行术后护理。假手术组操作相同，但气管内注入等量生理盐水。各组大鼠自建模后第2天起每天灌胃给药1次，造模后第28天麻醉取血及肺组织进行相关指标检测。

2.3 动物给药

确认PIF模型成功构建后开始进行给药处理。依据等效剂量换算规则，大鼠每日等效剂量为人类的6.3倍。将助阳通痹颗粒换算为大鼠等效剂量后，高、中、低剂量分别为10.8 g/kg、5.4 g/kg、2.7 g/kg，醋酸泼尼松组灌胃剂量为5 mg/kg，空白组和模型对照则给予等量的无菌蒸馏水。为保证药物浓度的稳定性，将不同剂量药物溶解配制成2 mL溶液，每日1次，连续12周通过灌胃给药（根据大鼠体质量变化动态调整剂量）。为尽量减少药物浓度误差，每周定期称重大鼠体质量。造模后第28天麻醉取血及肺组织进行相关指标检测。

2.4 动物取材

在采血阶段，采用心脏穿刺法进行。触摸心脏搏动最明显处作为进针点，局部消毒后，以70°角刺入皮肤，直至血液回流。待采血针随心脏搏动同步跳动时，确认已成功进入心脏腔内，随后连接负压采血管完成采血，过程中避免剧烈晃动以防止溶血。采血结束后，采血管于4 ℃静置4  h，再以3 000  rpm离心15 min，收集上层血清并转移至冻存管，储存于-80 ℃冰箱备用。采血后，采用颈椎脱臼法处死大鼠。迅速剖腹，暴露肺组织。取出肺组织进行处理。用于病理学分析，固定于4%多聚甲醛溶液中，进行HE染色；用于分子生物学分析，置于液氮中速冻后，转存于-80 ℃冰箱中备用。

2.5 ELISA检测

将之前保存的血清样本从冰箱取出，置于室温下复温。使用试剂盒法检测大鼠TNF-α、TGF-β和HMGB 1的血清浓度。实验按各指标检测的试剂盒说明书中的步骤要求操作。

2.6 HE染色观察

进行HE染色观察肺组织病理形态学变化。取肺组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后，依次进行脱蜡、苏木精染色、盐酸酒精分化、伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封片等步骤，在显微镜下观察并拍照记录。

2.7 Western blot检测

选取肺组织样本，研磨后加入RIPA裂解液，冰浴裂解，离心取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白样本加上样缓冲液变性处理后进行SDS-PAGE电泳，目标蛋白分离后转移至PVDF膜。膜经5%脱脂奶粉封闭后，加入稀释一抗，于4℃孵育过夜。一抗稀释浓度（β-actin 1:3 000，Fasl 1:1 000，Caspase-3 1:1 000，Fas 1:1 000）。次日洗膜后加入HRP标记二抗，室温孵育1 h。ECL显色并拍摄条带图像，使用ImageJ进行灰度分析。

2.8 qPCR检测

Trizol法提取总RNA，于20 μL反应体系中逆转录合成cDNA，采用SYBR Green法进行qPCR扩增，扩增条件为94℃变性5  min，随后94℃ 0.5 min、60℃退火15 s、72℃延伸10  s，共40个循环，最终72℃延伸10 min。扩增结束后进行熔解曲线分析：设定95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 1 s，以验证扩增特异性。每组实验重复3次，以β-actin为内参，采用2^–ΔΔCt法进行相对定量分析。扩增所用引物序列见表1。

2.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计数据分析，以均数±标准差（\overline{x}±s）表述计量资料，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验；以［n（%）］表述计数资料，行χ²检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肺组织TNF-α、TGF-β及HMGB 1含量的比较

见表2。

3.2 HE染色病理特征

如图1所示，假手术组肺组织切片显示肺泡结构完整，肺泡壁薄且清晰，无明显炎性细胞浸润，肺组织结构正常。模型组肺组织可见肺泡结构严重破坏，大量纤维结缔组织增生，广泛分布于肺间质，肺泡腔变小甚至闭塞，同时伴有大量炎性细胞浸润，符合典型的肺间质纤维化病理特征，表明造模成功。醋酸泼尼松组肺组织病理损伤程度较模型组有明显改善，纤维结缔组织增生减少，炎性细胞浸润程度减轻，肺泡结构有所恢复。助阳通痹颗粒高剂量组肺组织病理变化与醋酸泼尼松组相似，纤维结缔组织增生进一步减少，肺泡结构相对完整，炎性细胞浸润显著减轻；中剂量组和低剂量组也表现出不同程度的改善，随着剂量降低，改善程度有所减弱，但仍能观察到纤维结缔组织增生的减少和炎性细胞浸润的减轻。

3.3 各组大鼠肺组织凋亡相关蛋白表达的比较

见表3，如图2。

3.4 各组大鼠肺组织凋亡相关mRNA表达水平比较

见表4。

4 讨论

PIF的核心病理是“炎症放大-上皮损伤-纤维沉积”恶性循环^[8]。实验结果表明，助阳通痹颗粒可在这一链条的多个关键节点发挥作用：高、中剂量显著减轻肺泡结构破坏和胶原增生，下调血清炎症-纤维化因子TNF-α、TGF-β、HMGB1，并同步抑制凋亡通路Fas、FasL、Caspase-3的蛋白和mRNA表达，且总体效应与醋酸泼尼松相当。TNF-α是急性炎症的“点火”因子，可驱动中性粒细胞和巨噬细胞聚集，并间接促进纤维母细胞活化^[9]；模型组显著升高，高、中剂量颗粒及醋酸泼尼松均将其压低至接近正常水平，而低剂量仅轻度下调，提示需足量药物才能有效遏制炎症瀑布。TGF-β能诱导成纤维细胞大量产生胶原^[10]；模型组升高明显，高、中剂量组干预可显著下调，低剂量仅呈下降趋势，HE染色中纤维沉积减少与TGF-β的回落相呼应。HMGB1作为损伤相关分子模式，可通过TLR4/RAGE途径放大炎症并上调TGF-β；模型组高度升高，助阳通痹颗粒3个剂量均能抑制，其中高剂量最为显著，说明助阳通痹颗粒对炎症的放大同样具有拮抗作用。

Fas/FasL是典型死亡受体-配体对，过度激活可触发肺泡上皮细胞外源性凋亡并破坏屏障^[11]；模型组蛋白及mRNA均显著上调，高、中剂量组显著下调，低剂量抑制效果最弱，提示药物保护上皮完整性的剂量依赖性。Caspase-3作为Fas/FasL下游执行酶，其活化直接表征细胞凋亡水平^[12]；模型组大幅升高，高、中剂量组显著抑制，低剂量组仍残留较高水平，进一步印证足量给药的重要性。炎症因子的回落与凋亡指标的下降同步，说明助阳通痹颗粒可能通过“抗炎-抗凋亡”双重路径，最终阻断纤维化进程。

尽管本研究初步揭示了助阳通痹颗粒干预肺间质纤维化的作用机制与剂量效应关系，但仍存在诸多局限性需在后续研究中完善：其一，模型选择存在单一性，本研究仅采用博来霉素诱导的肺间质纤维化模型，该模型虽能快速模拟炎症驱动的纤维化早期病理改变，但临床中肺间质纤维化患者多呈现慢性进展特征，且常涉及环境暴露、自身免疫异常、反复感染等多因素协同作用，因此药物在慢性模型或多因素复合模型中的疗效稳定性尚未得到验证；其二，纤维化评价指标不够全面，本研究主要通过组织病理学观察及炎症、凋亡相关因子检测间接反映纤维化程度，缺乏羟脯氨酸含量测定（肺组织胶原合成的直接量化指标）、基质金属蛋白酶（MMP）/组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）平衡（调控细胞外基质代谢的核心通路）等直接表征纤维化进程的关键指标，难以更精准地量化药物的抗纤维化效应强度；其三，复方药物的物质基础与药代动力学特征尚未明确，助阳通痹颗粒作为中药复方，其所含的有效成分群、关键活性成分的结构鉴定，以及活性成分在体内的吸收、分布、代谢、排泄规律仍不清晰，这极大限制了对其作用机制的深度解析及临床剂量的精准优化；其四，观察周期有限，本研究仅关注药物干预期间的即时效应，未设置停药后随访周期，无法评估药物的持续作用效果，且缺乏长期给药对肝肾功能、血液系统等的安全性数据，这对临床应用的安全性保障构成重要挑战；其五，研究结果仍停留在动物实验水平，动物模型与人体病理生理状态存在固有差异，药物在人体中的疗效转化效率、剂量调整幅度、不良反应谱等均需进一步验证，临床转化过程需保持严谨谨慎的态度。因此，后续实验将借助转录组、蛋白质组、代谢组等多组学联合策略，明确其关键分子靶点及相互作用机制，为中医药防治肺间质纤维化提供高质量循证依据。

参考文献

[1] GENG J, LIU Y, DAI H P, et al. Fatty acid metabolism and idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Frontiers in Physiology, 2022, 12:794629.

[2] O'CALLAGHAN M, TARLING E J, BRIDGES J P, et al. Reexamining the role of pulmonary lipids in the pathoge-nesis of pulmonary fibrosis[J]. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 2024, 71(4):407-419.

[3] BURGY O, LORIOD S, BELTRAMO G, et al. Extracellular lipids in the lung and their role in pulmonary fibrosis[J]. Cells, 2022, 11(7):1209.

[4] MA X Y, JIANG M N, JI W Q, et al. The role and regulation of SIRT1 in pulmonary fibrosis[J]. Molecular Biology Reports, 2024, 51(1):338.

[5] 王檀,赵东凯.助阳通痹颗粒治疗间质肺疾病40例临床观察[J].中国卫生标准管理, 2015, 6(15):156-157.

[6] 王檀,仕丽.助阳通痹颗粒对博莱霉素致肺纤维化模型大鼠肺组织MMP-9和MMP-13活性的影响[J].长春中医药大学学报, 2015, 31(4):686-687.

[7] 袁成波,王檀,仕丽,等.助阳通痹颗粒治疗脾肾阳虚、肺络痹阻型间质性肺疾病[J].长春中医药大学学报, 2018, 34(4):728-730.

[8] SAVIN I A, ZENKOVA M A, SEN'KOVA A V. Pulmonary fibrosis as a result of acute lung inflammation: molecular mechanisms, relevant in vivo models, prognostic and therapeutic approaches[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(23):14959.

[9] SHAO S Q, QU Z Y, LIANG Y W, et al. Iguratimod decreases bleomycin-induced pulmonary fibrosis in association with inhibition of TNF-α in mice[J]. International Immunopharmacology, 2021, 99:107936.

[10] INUI N, SAKAI S, KITAGAWA M. Molecular pathogenesis of pulmonary fibrosis, with focus on pathways related to TGF-β and the ubiquitin-proteasome pathway[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(11):6107.

[11] FLORES-MENDOZA G, RODRÍGUEZ-RODRÍGUEZ N, RUBIO R M, et al. Fas/FasL signaling regulates CD8 expression during exposure to self-antigens[J]. Frontiers in Immunology, 2021, 12:635862.

[12] ASADI M, TAGHIZADEH S, KAVIANI E, et al. Caspase‐3: Structure, function, and biotechnological aspects[J]. Bio‐technology and Applied Biochemistry, 2022, 69(4):1633-1645.

基金资助

吉林省科技厅自然科学基金面上项目(YDZJ202301ZYTS201)