牡丹果荚的质量标准研究

Study on the quality standard of the pods of Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang

摘要

目的 建立牡丹果荚的质量标准。 方法 用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定牡丹果荚中没食子酸、鞣花酸的含量；用薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）鉴别牡丹果荚中没食子酸；按照2020年版《中华人民共和国药典》中的方法测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物的含量；用生物显微镜观察法对果荚粉末进行鉴别。 结果 建立了专属性强、重复性好的药材中没食子酸的TLC鉴别方法；建立了药材中没食子酸及鞣花酸含量测定方法：没食子酸在1.30~166.70 μg·mL^-1范围内线性关系良好（r=0.999 5），平均加样回收率为96.66%，RSD值为1.95%；鞣花酸在1.00~128.26 μg·mL^-1范围内线性关系良好（r=0.999 3），平均加样回收率为98.22%，RSD值为1.15%；12批药材中没食子酸、鞣花酸、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物的质量分数分别为7.73~10.00 mg·g^-1、11.31~12.50 mg·g^-1、9.98%~11.07%、10.35%~12.35%、0.32%~0.41%、32.27%~33.55%；果荚粉末观测到簇晶、导管和非腺毛。 结论 所建立的牡丹果荚质量标准可用于该药材的质量控制。

Abstract

Objective To establish the quality standard of the pods of Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang. Methods High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the contents of gallic acid and ellagic acid in the pods of Paeonia ostii T. Hong&J. X. Zhang. Thin layer chromatography （TLC） was used to identify gallic acid. The contents of water， total ash， acid insoluble ash and water-soluble extract were determined according to Chinese Pharmacopoeia （2020 Edition）. The powders of the pods were identified by biological microscope. Results A TLC identification method of gallic acid with strong specificity and good repeatability was established. Methods for the determination of gallic acid and ellagic acid was also established. Gallic acid has a good relationship in the linear range of 1.30—166.70 μg·mL^-1 with regression coefficient r=0.999 5， and its average recovery was 96.66% with RSD 1.95%. The ellagic acid has a good relationship in the range of 1.00—128.26 μg·mL^-1 with regression coefficient r=0.999 3， and its average recovery was 98.22% with RSD 1.15%. The mass fraction of gallic acid， ellagic acid， water， total ash， acid insoluble ash and alcohol soluble extract in 14 batches of the pods were 7.73—10.00 mg·g^-1， 11.31—12.50 mg·g^-1， 9.98%—11.07%， 10.35%—12.35%， 0.32%—0.41%， and 32.27%—33.55%， respectively. Tufts， catheters and non-glandular hairs can be observed in the powder. Conclusion The established HPLC method， TLC method and microscopic method can be used for the qua⁃lity control of the pods of Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang.

Graphical abstract

关键词

牡丹 / 果荚 / 薄层色谱法 / 高效液相色谱法 / 质量标准 / 没食子酸 / 鞣花酸

Key words

Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang / pod / thin layer chromatography / high performance liquid chromatography / quality standard / gallic acid / ellagic acid

牡丹（Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang）为芍药科芍药属植物，其种类繁多，花色各异，是集观赏、药用和食用价值于一体的落叶灌木^［1］，其果实为星形，一般由4~7个豆荚组成，除去豆荚里的牡丹籽后即为果荚或种荚。研究报道，牡丹果荚中含有黄酮、多糖、木纤维等类物质^［2-4］，从中分离到没食子酸、芍药苷、芹菜素-7-葡萄糖苷等^［5-7］。芍药苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁等作用^［8-12］；在前期研究中检出鞣花酸，其具有抗疟、抗癌、抗阿尔茨海默病等作用^［13-15］；没食子酸及其衍生物有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等作用^［16-18］。我国牡丹种植基地众多，如陕西的合阳、蒲城、旬阳及安徽亳州、河南洛阳、云南等地，资源极为丰富，但作为药用牡丹的副产物被大量丢弃影响生态环境^［19-21］。尽管牡丹果荚含有有丰富的活性成分，但作为药材的用途缺乏科学的评判标准。因此，迫切需要建立一种全面、科学的牡丹果荚药材标准来评价其质量，充分利用牡丹果荚，使其变废为宝。本文用薄层色谱法、高效液相色谱法、显微鉴别法对12批来自5个不同产地的牡丹果荚进行定性、定量研究，为建立药材标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（UFLC-20AD-PDA，日本岛津公司）；ShimPack Scepter C₁₈柱［250 mm×4.6 mm，5 μm， 岛津（上海）实验器材有限公司］；梅特勒-托利多电子分析天平（XPE105型，梅特勒公司）；超声波发生器（型号KQ-5200D数控，昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈均为HPLC级，美国Fisher公司；聚酰胺薄膜（100 mm×100 mm，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂出品）；水合氯醛（AR级，批号20180611，成都市科龙化工试剂厂）；乙醇（AR级，批号20201014），石油醚（60~90 ℃，AR级，批号20201109），磷酸（AR级，批号20200911），丁酮（AR级，批号20210413），乙酸乙酯（AR级，批号2020528），三氯化铁（AR级，批号20180516），甲酸（AR级，批号2020929），均购自天津市富宇精细化工有限公司；硫酸（AR级，批号20180423，西安耀皇化工科技有限公司）；超纯水，自制；其余试剂为分析纯。对照品：没食子酸（编号HG230820，质量分数≥98%）、鞣花酸（编号HE230830，质量分数≥98%），均购自宝鸡辰光生物科技有限公司。牡丹果荚，经陕西省食品药品监督检验研究院罗定强主任药师鉴定为Paeonia ostii T. Hong & J. X. Zhang 的果荚，详细信息见表1。药材在50 ℃烘干，过4号药典筛，置于干燥器中备用。

2 方法与结果

2.1 常规物质检查与浸出物含量测定

分别按照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则0832水分测定法第二法、2302灰分测定法、2201浸出物测定法（冷浸法）测定水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物的含量^［22］。见表2。

2.2 显微鉴别

取牡丹果荚粉末（过4号筛），取少许粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛1~2滴，盖上盖玻片。在酒精灯上加热使之透化，在显微镜下进行观察。结果显示，均可观测到簇晶、导管、导管和非腺毛。见图1。

2.3 没食子酸的薄层色谱鉴别

取本品2 g，加无水乙醇100 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水30 mL使溶解，滤过，滤液用石油醚（60~90 ℃）振摇提取2次，每次30 mL，弃去石油醚液，水液再用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；同法制备阴性对照样品溶液；另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）实验，吸取上述2种溶液各10 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 g·L^-1三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点^［22-23］，阴性对照无干扰。见图2。

2.4 没食子酸与鞣花酸的含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱为ShimPack Scepter C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-1.0 g ·L^-1磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，见表3；检测波长为254 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min^-1，进样量为5 μL。 理论塔板数按鞣花酸峰计算应不低于5 000。

2.4.2 混合对照品溶液的制备

分别称取没食子酸17.01 mg、鞣花酸对照品20.45 mg，置于100 mL量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备

取本品粉碎（过4号筛），称取1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入体积分数为70%乙醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为50 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用体积分数为70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液2 mL置于10 mL量瓶中，加体积分数为70%乙醇至刻度，即得供试品溶液。

2.4.4 标准曲线及线性范围

分别精密量取储备液0.05、0.20、0.50、1.50、3.60、4.80、6.40 mL，分别置于各个10 mL量瓶中，加甲醇定容至10 mL，分别得对照品溶液1、2、3、4、5、6、7。进样测定，记录峰面积，考察对照品质量浓度（x）与其峰面积（y）的线性关系，计算回归方程，得没食子酸回归方程为y₁=9 491 x₁+1326，质量浓度范围为1.30~166.70 μg·mL^－1，相关系数r=0.999 5；鞣花酸回归方程为y₂=46 645 x₂+6 299，质量浓度范围为1.00~128.26 μg·mL^-1，相关系数r=0.999 3，说明2种成分在相应质量浓度范围内线性关系良好。

2.4.5 专属性实验

按照2.4.1项下色谱条件分别进样空白溶剂、混合对照溶液、供试品溶液，结果显示阴性对照均无干扰。见图3、图4。

2.4.6 精密度实验

取混合对照品溶液4，连续测定6次，进样测定峰面积。计算得没食子酸与鞣花酸峰面积的RSD值分别为0.53%、0.47%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 稳定性实验

取混合对照品溶液4，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算得没食子酸与鞣花酸峰面积的RSD值分别为0.62%、0.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.8 重复性实验

称取样品（样品M1）1 g，精密称定，按照2.4.3项下供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液并按照2.4.1项下测定方法测定。计算得没食子酸与鞣花酸含量的RSD值分别为1.15%、1.63%，表明仪器的重复性良好。

2.4.9 加样回收率

称取样品（样品BP1，没食子酸含量为8.022 61 mg·g^-1，鞣花酸含量为2.381 51 mg·g^-1） 0.5 g，精密称定，称取6份，分别按表4添加对照品，再按照2.4.3项下的方法制备溶液并按照2.4.1项下的测定方法测定。结果见表4，说明本方法回收率良好。

2.4.10 样品含量的测定

测定12批5个不同产地药材中2种成分的含量（mg·g^-1），按照2.4.3项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，按照2.4.1项下检测方法测定。结果见表5，表明12批次5个产地2种成分含量有差异，没食子酸差异较大。

3 讨论

3.1 定性鉴别

参照文献^［23］对没食子酸的TLC的制样方法、点样量、显色剂等进行了筛选。①制样方法：通过调整洗脱试剂与萃取试剂量，在相同点样量情况下，加大量斑点更清晰；②阴性对照实验，结果显示阴性对照无干扰，见图2A，表明专属性强；③点样量5、10、15 μL的筛选，发现10 μL时斑点清晰，而5 μL时斑点不清晰，15 μL时斑点拖尾。因此，将制样简单、斑点清晰、R_f值适中的方法（即2.3项下方法）列入质量标准。参照文献^［19］，通过TLC鉴别果荚中的芍药苷。结果显示，在与对照品色谱相应的位置上，未显示相同颜色的斑点。可能原因是果荚中芍药苷含量较低，因此未将此项列入质量标准。此外，显微鉴别12批5个产地样品的粉末鉴别，其共有结构为果荚粉末观测到簇晶、导管和非腺毛。

3.2 含量测定

通过二极管阵列在190~800 nm波长范围内扫描，没食子酸的最大吸收波长为215、272 nm，鞣花酸最大吸收波长为253、367 nm，参考文献^［23］与实验结果，确定2种成分的定量波长为254 nm。依据文献^［23］比较了不同柱温（20、25、30、35、40 ℃）、不同流速（0.5、0.8、1.0、1.2 mL·min^-1），结果显示，以1 g·L^-1磷酸-乙腈为流动相进行梯度洗脱、柱温在30 ℃、流速为1 mL·min^-1时目标物分离度良好，其他柱温与流速时没食子酸与相邻峰分离度不理想。对不同进样量（5、10、20 μL）进行考察，结果显示进样量小，峰面积小，不便于计算含量，而进样量大鞣花酸理论板数变小，所以选择10 μL较为理想。比较了3个不同品牌的反相C₁₈色谱柱（Intersil C₁₈、ShimPack Scepter C₁₈、Kromasil C₁₈柱），对色谱柱不同规格（250 mm×4.6 mm， 5 μm和150 mm ×4.6 mm， 5 μm）进行比较。结果显示，ShimPack Scepter C₁₈（250 mm×4.6 mm， 5 μm）柱效较理想。通过上述研究，建立了重复性与稳定性良好的HPLC法，并测定了12批5个产地牡丹果荚中没食子酸与鞣花酸的含量，该方法可作为标准的质控方法。

综上所述，建立了操作简便、专属性强、重复性好的没食子酸TLC鉴别方法，与具有良好重复性与稳定性的没食子酸与鞣花酸含量测定方法等，为该药材质量标准的制定及牡丹果荚资源的开发和利用提供科学依据。

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基金资助

陕西省生物医药重点实验室后补助项目(2018SZS41)

陕西省重点研发计划项目(2018SF-315)