中药远志薄层色谱及超高效液相色谱特征图谱的研究

Study on thin-layer and ultra-high performance liquid characteristic chromatograms of Polygalae radix

摘要

目的 建立远志薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）及超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）特征图谱，并分析远志全根、根皮和木心间化学成分差异，为远志质量评价提供参考。 方法 以3，6’-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A和远志皂苷B为指标成分建立TLC图谱；用UHPLC法建立远志特征图谱，结合热图聚类分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）评价多批远志全根、根皮和木心之间的差异性。 结果 TLC图谱斑点清晰、分离度较好；UHPLC特征图谱共标定28个共有峰，指认了其中的7个特征峰，13批次远志特征图谱与对照图谱相似度均大于0.9，批次间质量较为稳定；TLC和UHPLC特征图谱显示远志全根、根皮和木心化学组成一致，未发现特异成分，热图聚类分析和PCA显示远志全根与根皮中各成分峰面积接近，OPLS-DA筛选出10个变量投影重要性（variable important in projection，VIP）值大于1的差异性成分。 结论 所建立的TLC及UHPLC特征图谱简便、准确、稳定，展开系统和提取溶剂均使用低毒试剂，符合绿色化学理念，适用于远志的质量评价，从化学分析角度说明木心的存在对远志整体化学成分影响较小。

Abstract

Objective To establish thin layer chromatography （TLC） and ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC） characteristic chromatograms of Polygalae radix， to analyze the differences in chemical constituents among roots， cortexes and heartwoods， and to provide reference for the quality evaluation of Polygalae radix. Methods TLC characteristic chromatogram was established by using 3，6’-disinapoyl sucrose， tenuifoliside A and onjisaponin B as reference standards. UHPLC was used to establish the characteristic chromatogram of Polygalae radix， and combined with heat map cluster analysis， principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） to evaluate the differences among roots， cortexes and heartwoods from various batches of Polygalae radix. Results The spots in TLC chromatogram were clear and well-separated. A total of 28 common peaks were demarcated from the characteristic chromatograms of Polygalae radix， and 7 characteristic peaks of which were identified. The similarities between the characteristic chromatograms of 13 batches of Polygalae radix and the reference chromatogram were all more than 0.9， indicating more stable in quality. Both TLC and UHPLC characteristic chromatograms showed that the chemical constituents of roots， cortexes and heartwoods of Polygalae radix were consistent， without any specific constituent. Heat map cluster analysis and PCA showed that the roots of Polygalae radix were similar in the peak area of each component to the cortexes， and OPLS-DA screened out 10 differential components via variable important in projection （VIP） values more than 1. Conclusion The established TLC and UHPLC characteristic chromatograms are simple， accurate and stable. The development system and extraction solvents used are low toxic， consistent with the concept of green chemistry. The methods are suitable for the quality evaluation of Polygalae radix. The chemical analysis indicates that heartwoods have few effects on the overall chemical composition of Polygalae radix.

Graphical abstract

关键词

远志 / 薄层色谱 / 超高效液相色谱 / 特征图谱 / 质量评价 / 去心 / 化学模式识别

Key words

Polygalae radix / TLC / UHPLC / characteristic chromatogram / quality evaluation / removal of heartwoods / chemical pa⁃ttern recognition

远志为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根，具有安神益智、交通心肾等功效^［1］，最早记载于汉代的《神农本草经》^［2-3］，临床应用较为广泛，是经典名方“开心散”“地黄饮子”和“固阴煎”的重要组成药材。

远志的主要药效成分为三萜皂苷类、𠮿酮类以及寡糖酯类^［4］，具有保护神经^［5-6］、改善认知障碍^［7-8］、抗抑郁^［8］、抗焦虑^［9］、抗氧化^［10］、抗炎^［11］等作用。现行《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）的薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）鉴别项使用2种方法，操作较为繁琐，展开剂中含有毒性试剂氯仿。远志化学成分特别是皂苷类成分结构相似且繁多，分离难度大，文献报道的指纹图谱^［12-15］多存在分析时间长、皂苷类成分分离度差无法指认等问题，《中国药典》尚未收载远志的超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC）特征图谱。

远志加工过程是否去心一直存在争议。《雷公炮炙论》记载：“远志凡使，先须去心，若不去心，服之令人闷。”“地黄饮子”组方及1963年版和1985年版《中国药典》规定远志需要去心，开心散组方中对远志的记载也多为去心后以酒或甘草汤煎煮，认为可以消除其“戟人咽喉”的不良反应^［16］。但抽取木心需要将药材润湿，且抽心工序繁杂，对药材造成二次伤害，易招霉菌感染导致黄曲霉毒素超标^［17］，因此自1975年起，陆续有学者用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）或超高效液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS/MS）对远志根皮和木心成分进行了比较^［18-20］，但目前2020年版《中国药典》仍保留炮制去心处理，然而去心的合理性尚未明确。本研究从绿色化学理念出发，选择低毒试剂作为展开剂和提取溶剂，通过优化TLC鉴别方法和UHPLC色谱条件建立远志特征图谱，结合热图聚类分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二法乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）比较远志全根、根皮和木心化学成分的差异性，探讨远志去心的合理性，以期为远志质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

薄层色谱自动点样仪（Automatic TLC Sampler 4）、薄层色谱自动展开仪（Automatic Developing Chamber 2）、薄层色谱摄像仪（TLC Visualizer）、薄层色谱加热器（TLC Plate Heater Ⅲ）、双槽展开缸（Twin troughchamber）、分析软件（vision CATS HPTLC analysis software）均购自瑞士CAMAG公司；超高效液相色谱仪（Agilent 1290 Infinity Ⅱ，安捷伦科技有限公司）；万分之一分析天平（METTLER AE200，梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；超声波清洗器（BRANSON 5800，美国Branson公司）；离心机（SF-TGL-16，上海菲恰尔分析仪器有限公司）；Milli-Q纯水仪（MILLIPORE，美国Millipore公司）。

1.2 试药

二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、冰醋酸、甲酸（体积分数为98%）、硫酸均为分析级，色谱级乙腈、色谱级甲酸均购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水（用Milli-Q纯水仪制备）。

对照品：西伯利亚远志糖A5（批号JZ17101803，质量分数为98%）、西伯利亚远志糖A6（批号JZ17081502，质量分数为98%）均购自南京景竹生物科技有限公司；远志𠮿酮Ⅲ（批号8076，质量分数为98%）、3，6’-二芥子酰基蔗糖（批号022GB165126，质量分数为98%）、细叶远志苷A（批号P16A9F58918，质量分数为98%）、远志糖苷C（批号M06D10S105020，质量分数为98%）、远志皂苷B（批号P17M9L56136，质量分数为98%），均购自上海源叶生物科技有限公司。

海洋GF₂₅₄硅胶预制薄层板（批号20191126，青岛海洋化工有限公司）；银龙GF₂₅₄硅胶预制薄层板（批号20191225，烟台市化学工业研究所）；黄海HSGF₂₅₄高效硅胶预制薄层板（批号20181117，烟台江友硅胶开发有限公司）；MN DC-Fertigplatten DURASIL-25硅胶预制薄层板（批号505133，Macherey-Nagel公司）；Merck TLC Silica gel 60 F₂₅₄硅胶预制薄层板（批号HX01557929）、Merck HPTLC Silica gel 60 F₂₅₄高效硅胶预制薄层板（批号HX13161042）均购自Merck公司；色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSS C₁₈ （150 mm×2.1 mm， 1.8 μm，沃特世科技有限公司）。

远志经上海中医药大学中药研究所吴立宏研究员鉴定为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，其信息见表1。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别特征图谱

2.1.1 对照品溶液的制备

取细叶远志苷A对照品、3，6’-二芥子酰基蔗糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度均为0.2 mg·mL^-1的混合对照品溶液Ⅰ，取远志皂苷B对照品适量，加甲醇制成质量浓度为0.4 mg·mL^-1的对照品溶液Ⅱ，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品粉末0.5 g，加体积分数为70%乙醇5 mL，超声处理（功率为160 W，频率为40 kHz）10 min，以8 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.3 TLC实验

按照2020年版《中国药典》薄层色谱法（通则0502）实验，分别吸取2.1.1项下混合对照品溶液Ⅰ 2 μL、对照品溶液Ⅱ 8 μL和2.1.2项下远志供试品溶液2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为二氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸（2∶4∶2.5∶1∶0.5），展开后取出，晾干，在365 nm下检视，供试品图谱中，在与混合对照品Ⅰ相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，见图1A；将该薄层板在105 ℃预热2 min后喷以20 mg·mL^-1香草醛硫酸-乙醇（1→10）试液，继续以105 ℃加热至斑点清晰，在可见光下检视，供试品图谱中，在与远志皂苷B相应的位置上显相同颜色斑点，见图1B。

2.1.4 远志全根、根皮和木心的TLC比较

对3批远志全根（YZ-11~13）进行剥皮抽心处理，对所得根皮（GP-11~13）和木心（MX-11~13）分别称定质量，结果显示MX-11和MX-12相较于全根的质量分数约为23%，MX-13相较于全根的质量分数约为14%，按照0.5 g × 木心和根皮质量分数称样，分别按照2.1.2和2.1.3项下方法进行提取和鉴别。结果显示，远志全根、根皮、木心化学成分较为一致，但是木心TLC斑点较浅，见图2，未发现特异性成分，表明远志的药材成分可能主要来源于根皮。

2.2 UHPLC特征图谱

2.2.1 对照品溶液的制备

取对照品西伯利亚远志糖A5、西伯利亚远志糖A6、远志𠮿酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖、细叶远志苷A、远志糖苷C和远志皂苷B适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加入体积分数为70%乙醇，制成质量浓度分别为0.020、0.019、0.021、0.032、0.027、0.029、0.025 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的乙醇25 mL，称定质量，超声处理（功率为160 W，频率为40 kHz）1 h，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，以10 000 r·min^-1离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.2.3 色谱条件

用Waters ACQUITY UPLC HSS C₁₈色谱柱（150 mm×2.1 mm， 1.8 μm），流动相为乙腈（A）-1 mL·L^-1甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~5 min，8%~18%A；5~7.5 min，18%A；7.5~12 min，18%~20%A；12~18 min，20%~30%A；18~25 min，30%~35%A；25~26 min，35%~39%A；26~36 min，39%A；36~45 min，39%~60%A）；流速为0.3 mL·min^-1，柱温为40 ℃，检测波长为320 nm，进样量为1 μL。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度实验

取远志粉末（YZ-09）适量，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件连续进样测定6次，以3，6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算得28个特征峰的相对保留时间的相对标准偏差（RSD）值为0.008 2%~0.170 0%，相对峰面积的RSD值为0.63%~2.54%，表明特征图谱中色谱峰的表达基本一致，仪器的精密度良好。

2.2.4.2 重复性实验

取远志粉末（YZ-09）适量，按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件进样测定，以3，6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算得28个特征峰的相对保留时间的RSD值为0.003 3%~0.130 0%，相对峰面积的RSD值为0.73%~4.65%，表明该方法的重复性良好。

2.2.4.3 稳定性实验

取远志粉末（YZ-09）适量，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件于不同时间（0、4、8、12、24、48 h）进样测定，以3，6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算得28个特征峰的相对保留时间的RSD值为0.008 4%~0.410 0%，相对峰面积的RSD值为0.52%~3.31%，表明远志供试品溶液至少在48 h内稳定。

2.2.4.4 专属性考察

取远志粉末（YZ-01）适量，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件依次测定空白溶液、混合对照品溶液和远志供试品溶液，结果见图3。由图3可见，供试品溶液色谱图中含有与各对照品保留时间及紫外吸收光谱一致的特征峰，其中峰1为西伯利亚远志糖A5，峰2为西伯利亚远志糖A6，峰5为远志𠮿酮Ⅲ，峰6为3，6’-二芥子酰基蔗糖，峰8为细叶远志苷A，峰11为远志糖苷C，峰22为远志皂苷B，空白溶液对远志供试品溶液无干扰，该方法的专属性良好。

2.2.5 特征图谱的建立与相似度分析

取13批远志粉末，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2.3项下色谱条件进样测定，将结果导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，设S1样品的图谱为参照图谱，以中位数法生成对照图谱与13批远志特征图谱的叠加图，见图4。在特征图谱中标定28个共有峰，计算各特征图谱之间的相似度，结果见表2。13批远志样品的特征图谱与对照图谱相似度为0.948~0.994，表明各批次样品的化学成分稳定性较好，符合特征图谱要求。

2.2.6 远志全根、根皮和木心的UHPLC分析

按照1 g ×木心和根皮的质量分数进行称样，分别按照2.2.2和2.2.3项下方法进行提取和测定，将同一批次远志全根、根皮和木心图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”计算相似度，结果见表3，同批次间全根、根皮和木心与对照图谱的相似度均大于0.9。以3，6’-二芥子酰基蔗糖为参照峰，计算得各批次木心、根皮、全根中28个共有峰的相对保留时间的RSD值为0.008 7%~0.110 0%，见图5A，表明木心、根皮和全根之间在化学成分种类上高度一致。从色谱峰总峰面积分析，根皮与全根总峰面积接近，木心总峰面积约占全根的5.30%~7.52%，见图5B、表4，表明远志木心中各成分含量与远志根皮相比极低。

2.2.7 化学模式识别分析

2.2.7.1 热图聚类分析

以峰6（3，6’-二芥子酰基蔗糖）为参照峰，以计算出28个特征峰的相对峰面积为变量，用平均数法，以欧式距离为度量标准，用HemI 2.0^［21］在线对13批远志根皮（YZ-01~10、GP-11~13）、3批远志木心（MX-11~13）和3批远志全根（YZ-11~13）的UHPLC特征图谱进行热图聚类分析，结果见图6。由图6可见，19批样品可聚为4类，YZ-01~03聚为一类，YZ-05~08、11~12聚为一类，GP-13和MX-11~13聚为一类，YZ-04、09~10、13和GP-11~12聚为一类，表明不同来源样品的质量存在一定差异，远志全根、根皮和木心三者之间化学组成无显著性差异。

2.2.7.2 PCA

将远志根皮、木心和全根中28个特征峰的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件进行主成分分析，结果见图7A，主成分1（PC1）的方差贡献率为97.7%，主成分2（PC2）的方差贡献率为0.873%，模型解释率R²X（cum）值为0.986，预测率Q²（cum）值为0.977，表明提取的2个主成分能较好地反映各批次远志特征图谱的信息，其中载荷较高的特征峰主要为峰24、峰8（细叶远志苷A）、峰18、峰26、峰27、峰11（远志糖苷C）和峰22（远志皂苷B），表明这7个特征峰对PC1的贡献相对较大，见图7B。PCA结果显示，远志全根和根皮聚集成簇，而木心则相距较远，表明远志全根的峰面积与根皮差异较小，而与木心差异较大，表明远志木心的存在对远志全根整体化学成分影响可能较小。

2.2.7.3 OPLS-DA

将远志根皮、木心和全根中28个特征峰的峰面积矩阵导入SIMCA 14.1软件进行OPLS-DA，模型解释率R²X（cum）为0.989，模型稳定性参数R²Y（cum）为0.771，模型预测率Q²为0.528，均大于0.5，表明该模型可靠且预测性较好^［22］。为了验证该模型有无过拟合，进行随机分组200次的置换检验，结果见图8A，R²拟合在y轴的截距为0.295（应小于0.3），Q²拟合在y轴的截距为-0.584（应小于0.05），且斜率均为正，表明所建立的模型不存在过拟合现象^［23］。以变量投影重要性（VIP）值大于1为提取标准，得出峰5（远志𠮿酮III）、峰2（西伯利亚远志糖A6）、峰12、峰6（3，6’-二芥子酰基蔗糖）、峰3、峰25、峰16、峰4、峰14、峰9是影响不同批次远志质量的关键成分，见图8B。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

3.1.1 供试品溶液制备方法的考察

考察了不同提取溶剂（甲醇、体积分数为70%的甲醇、乙醇、体积分数为70%的乙醇），结果显示，乙醇提取液斑点相对较浅，提取不够完全，其余3种溶剂中体积分数为70%的乙醇毒性相对较小，且薄层板前沿处的杂质较少，故选其作为提取溶剂；考察了不同提取时间（10、15、30 min）和不同溶剂用量（5、10、15 mL），结果显示差异较小，故提取时间选10 min，提取溶剂用量选5 mL。

3.1.2 薄层色谱条件的考察

考察了6种不同展开系统：二氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸（2∶4∶2.5∶1∶0.5）、氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）、乙酸乙酯-冰醋酸-水（55∶13∶13）、氯仿-甲醇-水-冰醋酸（7∶3∶1∶0.5）下层溶液、水饱和正丁醇-氯仿-甲醇（5∶2∶2.2）、乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸（6∶2.5∶1∶0.5），结果显示，选择二氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇-水-甲酸（2∶4∶2.5∶1∶0.5）为展开系统时，斑点成点性，分离度均较好，比移（R_f）值适中；考察了100 g∙L^-1的硫酸乙醇试液、20 mg·mL^-1香草醛硫酸试液、20 mg·mL^-1香草醛硫酸-乙醇（1→10）试液、天然产物显色剂及10 mg·mL^-1三氯化铝乙醇试液5种显色剂，结果显示，20 mg·mL^-1香草醛硫酸-乙醇（1→10）试液显色后远志皂苷B斑点最为清晰；考察了不同点样量和点样宽度，结果显示，对照品溶液Ⅰ为2 μL、对照品溶液Ⅱ为8 μL、远志供试品溶液为2~4 μL时斑点较为清晰，点样宽度6~12 mm时斑点均较为清晰，选择CAMAG点样仪默认点样宽度为8 mm。

3.1.3 耐用性考察

考察了不同湿度（35%、50%、75%）对色谱条件的影响，结果显示，湿度对展开效果影响较小，展开效果稳定；考察了不同温度（4、16、25 ℃）对色谱条件的影响，结果显示，各斑点随着温度的升高R_f值逐渐升高，相比之下25 ℃时斑点分离效果更好；考察了海洋GF₂₅₄、银龙GF₂₅₄、黄海HSGF₂₅₄、MN DC-Fertigplatten DURASIL-25、Merck TLC Silica gel 60 F₂₅₄和Merck HPTLC Silica gel 60 F₂₅₄ 6种薄层板，结果显示，Merck HPTLC Silica gel 60 F₂₅₄、Merck TLC Silica gel 60 F₂₅₄、黄海HSGF₂₅₄和银龙GF₂₅₄ 4种薄层板分离度均较好，但是银龙GF₂₅₄薄层板展开图谱斑点略不平行，其余2种薄层板分离效果较差，不适用于本方法。

3.2 UHPLC特征图谱

3.2.1 供试品溶液制备方法的考察

考察了不同提取溶剂（水、体积分数为50%的甲醇、体积分数为70%的甲醇、甲醇、体积分数为50%的乙醇、体积分数为70%的乙醇、乙醇），结果从单位总峰面积来看，体积分数为70%的甲醇、体积分数为50%的乙醇、体积分数为70%的乙醇均能较完全提取远志化学成分，综合考虑绿色化学理念，选择以体积分数为70%的乙醇为提取溶剂；考察了不同提取时间（15、30、45、60、90 min），60 min可将样品基本提取完全，故选择60 min；考察了不同溶剂用量（10、25、50 mL），结果表明，提取溶剂用量为10 mL时可将样品提取完全，但是进样1 μL时3，6’-二芥子酰基蔗糖峰面积即可达到3 800 mAU·min，考虑到保护色谱柱，故提取溶剂用量选择25 mL。

3.2.2 波长的选择

取远志粉末，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪，在190~400 nm的紫外区进行在线检测，结果显示，28个特征峰主要在308~330 nm处有最大吸收，综合比较选择320 nm作为远志粉末UHPLC特征图谱的检测波长。

3.2.3 耐用性考察

考察了不同流速（0.28、0.30、0.32 mL·min^-1），结果随着流速增加各色谱峰保留时间变小，而色谱峰峰形、出峰个数及分离度相差不大，表明流速对检测结果影响较小；考察了不同柱温（30、35、40 ℃），结果随着温度增加各色谱峰保留时间变小，峰形不变，出峰个数和分离度有所增加，40 ℃最佳；考察了不同流动相甲酸浓度（0.5、1、1.5 mL·L^-1甲酸水溶液），结果随着酸浓度增加各色谱峰峰形、出峰个数及分离度变化较小，表明酸浓度对检测结果影响较小。综上所述，本方法耐用性较好。

4 结论

本实验以细叶远志苷A、3，6’-二芥子酰基蔗糖和远志皂苷B为指标成分建立了TLC特征图谱，实现了用一张薄层板对远志寡糖酯类成分和三萜皂苷类成分的同时鉴别，相较于《中国药典》原有TLC鉴别项，方法和试剂使用秉持操作简便和绿色化学理念，展开剂中避免使用有毒试剂氯仿。用UHPLC法建立了远志的特征图谱，标定28个共有峰，鉴定出7个特征峰，在现有研究基础上增加了远志皂苷B的指认，该方法简便、准确且稳定性良好，可用于远志的质量评价。

TLC和UHPLC特征图谱均显示远志全根、根皮和木心的化学组成一致，木心中不存在特异性成分，从总峰面积角度分析，木心中化学成分含量仅占全根的5.30%~7.52%，热图聚类分析和PCA均显示远志根皮和全根质量相近，OPLS-DA筛选出10个影响不同批次远志全根、根皮和木心间差异的关键成分。从化学分析角度分析，远志全根的化学成分主要来源于根皮，木心的存在对其影响较小，但木心的存在是否会导致服用者烦闷尚不明确，后续可研究远志木心对全根的药效、毒理影响，如果影响同样较小则建议远志不做去心处理。

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基金资助

上海市自然基金项目(19ZR1457200)