蒙药材东北齿缘草的质量标准研究

Study on the quality standard of Mongolian medicinal herb Eritrichium mandshu‍⁃ricum M. Pop.

摘要

目的 建立东北齿缘草药材的质量标准，为东北齿缘草质量控制和评价提供参考。 方法 参照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则相关方法，对东北齿缘草的水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物进行测定。用高效液相色谱法，以Hypersil ODS（300 mm×4.6 mm，2.5 µm）为色谱柱，以4 mL·L^-1磷酸水-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速为1.0 mL· min^-1，柱温为35 ℃，检测波长为360 nm，建立东北齿缘草中绿原酸、芦丁和异槲皮苷的定量分析方法。 结果 东北齿缘草中水分、总灰分和酸不溶性灰分不得超过10.0%、7.0%、2.0%，浸出物不得低于20%。在HPLC条件下，绿原酸、芦丁和异槲皮苷质量浓度分别在1.42~4.25、0.80~2.40 、0.14~0.42 μg·mL^-1范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为96.33%、95.50%、95.63%，RSD值分别为1.7%、0.9%、1.4%。 结论 建立的东北齿缘草定量方法重复性好、灵敏度高、专属性强，可用于蒙药材东北齿缘草的质量控制。

Abstract

Objective To establish the quality standard of Eritrichiummandshuricum M. Pop.and provide reference for quality control and evaluation of E. mandshuricum M. Pop. . Methods The moisture， total ash， acid-insoluble ash and extracts of E. mandshuricum M. Pop. were determined by referring to the relevant methods compiled in Volume 4， General Chapters in the Chinese Pharmacopoeia （2020 edition）. A method for the quantitative analysis of chlorogenic acid， rutin and isoquercitrin in E. mandshuricum M. Pop. was established by high performance liquid chromatography（HPLC）. The separation was performed by gradient elution， using Hypersil ODS （300 mm×4.6 mm， 2.5 µm） as the column at 35 ℃， at a flow rate of 1.0 mL· min^-1，with 4 mL∙L^-1 phosphoric acid-acetonitrile as the mobile phase， with a detection wavelength at 360 nm. Results The moisture content， total ash content and acid insoluble ash content of E. mandshuricum M. Pop. should not exceed 10.0%， 7.0% and 2.0%， respectively， and the extract should not be less than 20%. The mass concentration of chlorogenic acid， rutin and isoquercitrin showed good linear relationship in the range of 1.42~4.25 μg·mL^-1， 0.80~2.40 μg·mL^-1 and 0.14~0.42 μg·mL^-1， respectively. The average recovery rates were 96.33%， 95.50% and 95.63%， and RSD were 1.7%， 0.9% and 1.4%， respectively. Conclusion The established quantitative method has good repeatability， high sensitivity and specificity， and can be used for the quality control of Mongolian medicinal herb E. mandshuricum M. Pop..

Graphical abstract

关键词

蒙药材 / 东北齿缘草 / 绿原酸 / 芦丁 / 异槲皮苷 / 质量标准

Key words

Mongolian medicinal herb / Eritrichium mandshuricum M. Pop. / chlorogenic acid / rutin / isoquercitrin / quality standard

东北齿缘草（Eritrichium mandshuricum M. Pop.）为紫草科齿缘草属植物东北齿缘草的干燥全草，别名为细叶蓝梅，蒙名音译“曼哲-巴特哈”^［1］，又名额布森-德瓦、奥·德瓦^［2］。为常用蒙药材石生齿缘草的代用品，蒙、中医用其全草杀粘、清热、解毒，主治瘟疫瘟热^［3-4］，产于内蒙古（昭盟、锡盟、呼盟、哲盟）、黑龙江、河北东北部等地^［5］。东北齿缘草广泛用于蒙药复方如德瓦-5、德瓦-10等方剂中^［6］。有研究发现，石生齿缘草的化学成分主要包括黄酮苷、有机酸、甾醇、黄酮、木脂素类等成分^［7-9］，也有研究者用原子吸收光谱法、原子荧光光度法、高效液相色谱法测定了石生齿缘草中金属元素、槲皮素和山柰素的含量^［10-12］。目前对东北齿缘草化学成分及抗炎活性进行初步研究后发现，东北齿缘草石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取物具有一定的抗炎活性，从东北齿缘草的有效部位中分离得到9个化合物^［13-15］。本文结合以上研究结果，参照2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）要求，对东北齿缘草进行鉴别、检查、浸出物、含量测定研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

恒温干燥箱（DHG-9070型，上海景宏仪器制造有限公司）；电子天平（SQP型，赛多利斯科学仪器有限公司）；恒温水浴锅（HH-S26S型，江苏荣华仪器制造有限公司）；电子天平（AUY120型）、高效液相色谱仪（LC-20AT、SPD-20A）均购自日本岛津公司；超纯水机（Milli-Q Academic，美国密理博公司）。

1.2 试药

对照品：绿原酸（批号110753-201716，质量分数为96.1%），芦丁（批号10080-201811，质量分数为91.7%），异槲皮苷（批号111809-201804，质量分数为97.2%），均购自中国食品药品检定研究院；色谱级乙腈（批号20180409）、分析级甲醇（批号20180522）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司）；磷酸（批号20090402，天津市德恩化学试剂有限公司）。

9批次东北齿缘草均采集于内蒙古，经内蒙古民族大学红艳副教授鉴定为东北齿缘草（Eritrichium mandshuricum M. Pop.）的干燥全草，其来源见表1，原植物图见图1。东北齿缘草标本（No.20170725）保存于内蒙古民族大学蒙医药大楼315室。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

2.1.1 粉末显微观察

取东北齿缘草药材粉末少许，置于载玻片上，滴加水合氯醛加热透化后，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。结果显示，上表皮细胞呈长方形，细胞壁较厚，有较多非腺毛脱落后的疤痕；下表皮呈气孔类圆形及不规则形，直径为10~20 μm，长约10~22 µm，副卫细胞3~5个，不等式；非腺毛极多，均为单细胞，分长短2种，表面具有细小颗粒状雕纹；纤维成束存在，呈无色或淡黄色；导管为螺纹导管或网纹导管，直径为30~50 µm；花粉粒呈圆球形，表面光滑，表面附着颗粒状的物质；木栓细胞为红棕色，类多角形。此外还有草酸钙簇晶和淀粉粒。见图2。

2.1.2 根的横切面

木栓层和皮层都较窄；韧皮部较宽，韧皮部连接成环，韧皮射线不明显；形成层明显，薄壁细胞1列，呈弯曲状；木质部发达，导管类圆形，众多且明显，但其排列呈无序状。见图3A。

2.1.3 茎的横切面

表皮细胞1列，内、外平周壁增厚外被角质层，表皮上多生有非腺毛；皮层细胞6~8列，外侧1~2列为板状厚角细胞，内侧为薄壁细胞；表皮细胞1层类圆形皮层由6~8层薄壁细胞组成，有裂隙。韧皮部窄，韧皮射线不明显，韧皮部连接成环；形成层不明显。木质部导管类圆形，多分布于木质部内侧。木质部细胞壁均木化，内含少量砂晶，外侧导管数个成束，靠近髓部成群；髓部薄壁细胞较小，中空。见图3B。

2.1.4 叶的横切面

叶表皮层有非腺毛。叶片的上下表皮细胞1列，类方形，外壁较厚的角质层，上、下表皮多生有非腺毛；栅栏组织由1~2列细胞构成；海绵组织3~5列，排列疏松，细胞椭圆形或类圆形；主脉维管束为1个，呈圆形，有明显的木质部和韧皮部。见图3C。

2.2 薄层鉴别

取本品粉末2 g，加体积分数为80%的甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芦丁和异槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg对照品的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（通则0502）实验，吸取供试品溶液10 μL、对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（10∶1.1∶1.1∶2.6）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置处显相同颜色的斑点。见图4。

2.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物的测定

参照2020年版《中国药典》四部通则方法对东北齿缘草药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物进行测定，结果见表2。根据测定结果，暂定水分不得超过10.0%，总灰分不得超过7.0%，酸不溶性灰分不得超过2.0%，70%乙醇热浸出物不得低于20.0%。

2.4 HPLC含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备

取样品粉末约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为70%的甲醇20 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用体积分数为70%的甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.2 对照品溶液的制备

分别精密称定绿原酸对照品、芦丁对照品和异槲皮苷对照品8.67、7.15、4.02 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度使其充分溶解，最后制成每1 mL分别含绿原酸、芦丁和异槲皮苷0.283、0.160、0.028 mg的混合对照品溶液。

2.4.3 色谱条件与系统适应性实验

以Hypersil ODS（300 mm×4.6 mm，2.5 µm）为色谱柱；以4 mL∙L^-1磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0.01~10 min，15%~15% B；10~20 min，15%~22 % B）；检测波长为360 nm；柱温为35 ℃；流速为1 mL·min^－1；进样量为10 μL。对照品及供试品溶液的HPLC图见图5。

2.4.4 线性关系的考察

分别精密吸取混合对照品溶液5.0、7.5、10、12.5、15 μL，按照2.4.3项下色谱条件进行HPLC分析，以对照品质量浓度为横坐标（x），以样品峰面积为纵坐标（y），得标准曲线。绿原酸、芦丁和异槲皮苷的回归方程分别为y₁ = 513.25x₁+225 658 （r = 0.999 8）、y₂= 1 494.6x₂+46 798（r = 0.999 6）、y₃= 2 108.4x₃+ 7 529.6（r = 0.999 7），结果表明绿原酸、芦丁和异槲皮检测质量浓度分别在1.42~4.25、0.80~2.40、0.14~0.42 μg·mL^-1内线性关系良好。

2.4.5 精密度实验

取X1样品，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，按照2.4.3项下色谱条件连续进样6次进行测定，记录峰面积。结果显示绿原酸、芦丁和异槲皮苷峰面积的RSD值分别为0.92%、1.46%、0.77%。表明精密度良好。

2.4.6 重复性实验

取X1样品，按照2.4.1项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.3.3项下色谱条件进行HPLC分析，进样体积为10 μL，计算百分含量，测得绿原酸的平均含量为0.59%，RSD值为1.3%；芦丁的平均含量为0.43%，RSD值为1.0%；异槲皮苷的平均含量为0.05%，RSD值为1.2%。

2.4.7 稳定性实验

取X1样品，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录峰面积。结果显示绿原酸、芦丁和异槲皮苷峰面积的RSD值分别为0.88%、0.74%、1.25%。结果表明样品在24 h内稳定。

2.4.8 加样回收率实验

取已准确进行含量测定的X1样品粉末约0.5 g，9份，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，将高、中、低质量浓度对照品加入量与所取供试品中待测成分量之比控制在0.5∶1、1∶1、1.5∶1，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，按照2.4.3色谱条件进行测定，计算得绿原酸的平均回收率为96.36%，RSD值为1.01%；芦丁平均回收率为95.50%，RSD值为1.33%；异槲皮苷的平均回收率为95.63%，RSD值为0.96%。表明本实验所用的测定方法准确、可靠，可用于东北齿缘草的含量测定。

2.4.9 样品测定

分别取9批东北齿缘草粉末约1.0 g，精密称定，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，按照2.4.3项下色谱条件进行HPLC分析，进样体积为10 μL，计算百分含量。东北齿缘草含量测定结果（按干燥品计算）见表3。

2.4.10 含量限度的拟定

含量测定结果表明，东北齿缘草9批样品中绿原酸、芦丁和异槲皮苷的平均含量约为0.451%、0.365%、0.054%，各批含量离散程度较小，分别在0.306%~0.690%、0.261%~0.543%、0.031%~0.082%之间。综合分析测定结果，考虑到本品产地、采集、加工、批次、贮运及季节气候等影响因素，其含量限度不宜拟定过高，暂定本品按干燥品计，含绿原酸不得少于0.3%、芦丁不得少于0.25%、异槲皮苷不得少于0.03%。

3 讨论

3.1 薄层鉴别制备供试品溶液的提取溶剂

分别考察了甲醇、体积分数为80%的甲醇和体积分数为50%的甲醇，结果显示，以体积分数为80%的甲醇为提取溶剂时供试品溶液斑点清晰，故选择以体积分数为80%的甲醇为提取溶剂；以芦丁和异槲皮苷为对照品分别考察了乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶2）、正丁醇-丁酮-甲酸-水（10∶5∶1∶2）和乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（10∶1.1∶1.1∶2.6）3种展开系统，于紫外光灯（254 nm）下检视。结果显示，以芦丁和异槲皮苷为对照品，乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸-水（10∶1.1∶1.1∶2.6）为展开系统所得薄层色谱斑点清晰，分离度高、重复性好。

3.2 重金属、砷盐限度检查

取本品内容物1.0 g，按照《中国药典》2020年版四部（通则0821）重金属检查法第二法操作检查。结果显示，每批样品中每1 g中的重金属含量均少于10 μg，即均低于百万分之十。取本品4.0 g，按照《中国药典》2020年版四部（通则0822）砷盐检查法第一法操作检查。结果显示，每批样品中每1 g中的砷盐含量均少于2 μg，即均低于百万分之二。

3.3 检测波长与流动相的选择

实验中参考了2020年版《中国药典》一枝黄花含量测定项下芦丁的检测波长为360 nm^［16］，茵陈含量测定项下绿原酸的检测波长为327 nm^［17］，在经紫外扫描绿原酸的最大吸收波长为327 nm，芦丁和异槲皮苷的最大波长为360 nm，故本实验选择了360 nm为检测波长。流动相的选择首先用4 mL∙L^-1磷酸水溶液（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0.01~10 min，23% B；10~20 min，23%~35 % B），绿原酸分离度小于1.5，不符合要求：用4 mL∙L^－1磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，供试品中各成分能达到有效分离。故本实验选择4 mL∙L^-1磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相。

参考文献

[1] 朱亚民. 内蒙古植物志［M］. 呼和浩特：内蒙古人民出版社，1992：172-173.

[2] 柳巴乙拉. 蒙药正典［M］. 北京：民族出版社，2006：227-228.

[3] 中国大兴安岭蒙中药植物资源志编撰委员会. 中国大兴安岭蒙中药植物资源志［M］. 赤峰：内蒙古科学技术出版社，2011：339-340.

[4] 春玲，红艳，李桂花，等. 蒙药额布森-德瓦的本草考证［J］. 中国民族医药杂志，2019，25（4）：74-76.

[5] 中国科学院中国植物志编辑委员会编. 中国植物志［M］. 北京：科学出版社，1978.

[6] 罗布森. 蒙药学［M］. 赤峰：内蒙古科技出版社，2011：325-326.

[7] 刘清华，杨峻山. 石生齿缘草的化学成分［J］. 中国天然药物，2005，3（3）：178-180.

[8] 刘清华. 1.毒根斑鸠菊根的化学成分研究 2.阿尔泰狗娃花化学成分研究 3.石生齿缘草的化学成分［D］. 北京：中国协和医科大学，2005.

[9] 索茂荣. 向日葵，毒根斑鸠菊和石生齿缘草化学成分研究［D］. 北京：中国协和医科大学，2006.

[10] 田吉，王文全. 蒙药齿缘草中金属元素含量测定［J］. 中国民族医药杂志，2013，19（2）：62-63.

[11] 巴俊杰，布仁，马丽娟，等. 高效液相色谱法同时测定蒙药齿缘草中槲皮素和山奈素的含量［J］. 内蒙古医科大学学报，2013，35（2）：132-135.

[12] 马丽娟，巴俊杰，布仁，等. 齿缘草的质量标准研究［J］. 中药材，2012，35（4）：563-565.

[13] 春玲. 东北齿缘草抗炎活性部位化学成分分离及质量标准研究［D］. 通辽：内蒙古民族大学，2019.

[14] 李桂花，春玲，辛颖. 蒙药材齿缘草的抗炎作用及化学成分研究［J］. 内蒙古民族大学学报：蒙医药学版，2020，30（2）：38-44.

[15] 阿如汗，李桂花，辛颖. 东北齿缘草乙酸乙酯萃取物的抗炎作用研究［J］. 内蒙古民族大学学报：蒙医药学版，2021，31（1）：32-38.

[16] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2020年版：一部 ［S］. 北京：中国医药科技出版社，2020：3.

[17] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2020年版：一部 ［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：251. （修订日期：2023-08-24）

基金资助

国家重点研发计划课题资助项目(2019YFC1712303)