HPLC波长切换法同时测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏的含量

Simultaneous determination of acetaminophen and chlorphenamine maleate in Compound Paracetamol and Chlorphenamine Tablets for Infant by HPLC wavelength switching method

摘要

目的 建立同时测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的高效液相色谱法，为提高该药品的质量标准提供依据。 方法 用HPLC多波长切换法。色谱柱为Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.025 mol·L^-1磷酸盐缓冲液（pH 3.0）-甲醇乙腈（1∶1）溶液（梯度洗脱）。流速为1.0 mL·min^-1。检测波长：310 nm（对乙酰氨基酚）、225 nm（氯苯那敏）。柱温为30 ℃。进样量为10 μL。 结果 对乙酰氨基酚与氯苯那敏的分离度良好，溶剂和辅料均不产生干扰。对乙酰氨基酚在0.58~1.73 mg·mL^-1、氯苯那敏在2.50~7.49 μg·mL^-1范围内与峰面积呈良好线性关系（r ≥ 0.999 7）；精密度、重复性、稳定性（24 h）实验的RSD值均小于2.0% （n = 6）；加样回收率分别为98.14%~101.74%、98.00%~101.54%，RSD值均小于2.0% （n = 9）；耐用性考察符合要求。 结论 建立的HPLC多波长切换法操作简便、专属性强、稳定性好，可同时测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和氯苯那敏的含量。

Abstract

Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of acetaminophen and chlorphenamine maleate in Compound Paracetamol and Chlorphenamine Tablets for Infant， to provide a reference to improve the quality standard of the preparation. Methods HPLC wavelength switching method was used. The analysis was performed on a Shim-pack VP-ODS column （ 150 mm × 4.6 mm， 5 μm ）. The mobile phase was 0.025 mol·L^-1 phosphate buffer （pH 3.0） - methanol acetonitrile （1∶1） in a linear gradient mode. The flow rate was 1.0 mL·min^-1. The detection wavelengths were set at 310 nm for acetaminophen， 225 nm for chlorphenamine maleate. The column temperature was 30℃， and the injection volume was 10 μL. Results The separation of the 2 components was good. Solvents and excipients do not cause interference. Acetaminophen and chlorphenamine maleate were showed good linear relationships within the ranges of 0.58-1.73 mg·mL^-1 and 2.50-7.49 μg·mL^-1， respectively （r ≥ 0.999 7）. The RSDs of precision， repeatability， and stability （24 hours） tests were all less than 2.0% （ n = 6 ）. The average recoveries were within the ranges of 98.14%-101.74% and 98.00%-101.54%， respectively， and the RSDs were less than 2.0% （n = 9）. Robust test of the method was passed. Conclusion This method is simple， specifical and stable， which can be used to simultaneously determine acetaminophen and chlorphenamine maleate in Compound Paracetamol and Chlorphenamine Tablets for Infant.

Graphical abstract

关键词

小儿氨酚那敏片 / 含量测定 / 高效液相色谱法 / 多波长切换

Key words

Compound Paracetamol and Chlorphenamine Tablets for Infant / content determination / high performance liquid chromatography / multi wavelength switching

小儿氨酚那敏片（Compound Paracetamol and Chlorphenamine Tablets for Infant）是由对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏组成的复方制剂，适用于缓解由儿童普通感冒及流行性感冒引起的发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞等症状^［1］。对乙酰氨基酚为解热镇痛药，通过抑制中枢神经系统环氧合酶-3合成前列腺素发挥作用^［2］，马来酸氯苯那敏为抗过敏药，通过拮抗H₁受体发挥抗变态作用^［3］。小儿氨酚那敏片规格为每片含对乙酰氨基酚120 mg和马来酸氯苯那敏0.5 mg，本品为甲类非处方药，不属于国家基本药物（2018版），国内外药典均未收载。

在日常检验工作中发现，目前该品种的法定标准为国家药品标准WS-10001-（HD-0212-2002） ^［4］，用高效液相色谱法测定对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏的含量，以甲醇-0.05mol·L^-1磷酸二氢钾溶液-三乙胺（10∶90∶0.02）（用磷酸调节pH值至3.4）为流动相，由于有机相甲醇比例过低，导致氯苯那敏峰在长达120 min时间内检测不到。了解到相关企业常常将马来酸峰认定为马来酸氯苯那敏峰，并以此峰面积来进行含量和含量均匀度的测定，使得测定结果的可靠性存在疑问^［5］。此外，按照现行标准，含量测定项下对照品溶液和供试品溶液中对乙酰氨基酚质量浓度高达4.8 mg·mL^-1，在高效液相色谱仪上表现为过载，超过了紫外检测器的线性响应范围，在这种情况下进行定量分析，测定结果的准确性也存在疑问。

针对以上问题，本实验建立了HPLC波长切换法同时测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和氯苯那敏的含量，此方法灵敏度高、准确性好，适用于小儿氨酚那敏片的含量测定和含量均匀度检查，有效地弥补了原法定标准的不足，有助于提高儿童用药的安全性^［6］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000型HPLC，配备Chromeleon工作站（美国赛默飞世尔公司）；岛津LC-20AD型高效液相色谱仪，配备Chemstation工作站（日本岛津公司）；Waters e2695-2998型高效液相色谱仪，配备Empower工作站（美国Waters公司）；Shim-pack VP-ODS（150 mm ×4.6 mm， 5 μm）色谱柱（日本岛津公司）；Waters Symmtry C₁₈ （150 mm × 4.6 mm， 5 μm）色谱柱（美国沃特世公司）；Agilent 120 EC-C₁₈ （150 mm ×4.6 mm， 5 μm）色谱柱（美国安捷伦公司）；Sevenmulti pH计（瑞士Mettler Toledo公司）；XSE205DU型电子天平（感量为 0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；Millipore超纯水仪（美国密理博公司）。

1.2 试药

对照品：对乙酰氨基酚（批号100018-202111，质量分数为100%）、马来酸氯苯那敏（批号100047-202008，质量分数为99.7%）、马来酸（批号190015-202003，质量分数为99.6%），均购自中国食品药品检定研究院。A、B 2个企业生产的共22批小儿氨酚那敏片样品来自我中心2022年药品抽检计划。其中，A企业编号1~8号（批号210901）、9~15号（批号220101）；B企业编号16号（批号200402）、17~18号（批号211001）、19~21号（批号211002）、22号（批号220102）。A、B 2个企业所使用的辅料见表1。磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾为分析纯；磷酸为优级纯；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm， 5 μm）色谱柱；以0.025 mol·L^-1磷酸盐缓冲液（称取磷酸二氢钾3.40 g和磷酸氢二钾4.35 g，加水稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH值至3.0）为流动相A，以甲醇-乙腈（1∶1）为流动相B，进行梯度洗脱（0~10 min，85%~55%A；10~14 min，55%A；14~15 min，55%~85%A；15~16 min，85%A）。用波长切换模式，检测波长为310 nm（0~9 min，检测对乙酰氨基酚）、225 nm（9~16 min，检测氯苯那敏），柱温为30 ℃，流速为1.0 mL·min^-1，进样量为10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 溶剂空白溶液的制备

以2.1项下的流动相A-流动相B（85∶15）为溶剂空白，并作为稀释剂。

2.2.2 辅料空白溶液的制备

按照表3的处方配比分别称取各辅料适量，置于100 mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为2个制剂厂家辅料空白溶液。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密称取马来酸氯苯那敏对照品575.80 mg，置于50 mL量瓶中，用稀释剂［（流动相A-流动相B（85∶15）］溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对乙酰氨基酚储备液。另精密称取马来酸氯苯那敏对照品20.02 mg，置于20 mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为马来酸氯苯那敏储备液。精密量取马来酸氯苯那敏储备液1 mL，置于20 mL量瓶中，用对乙酰氨基酚储备液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏质量浓度分别为11 516.00、49.90 μg·mL^-1。取混合对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备

取本品1片，置于100 mL量瓶中，加稀释剂适量，超声处理10 min，放冷，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性实验

将溶剂空白溶液、辅料空白溶液、对照品溶液、供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果见图1。由图1可知，溶剂和辅料对主成分测定无干扰。在该色谱条件下，马来酸保留时间约为2.1 min，对乙酰氨基酚保留时间约为4.1 min，氯苯那敏保留时间约为11.5 min。对乙酰氨基酚与氯苯那敏2个成分的分离度大于30，理论板数均大于5 000。表明方法的专属性符合要求。

2.3.2 线性关系考察

精密量取2.2.3项下混合对照品储备液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，分别置于10 mL量瓶中，用稀释剂定容至刻度，依法测定，以质量浓度为横坐标（x，对乙酰氨基酚mg·mL^-1、氯苯那敏μg·mL^-1），以峰面积为纵坐标 （y） 进行线性回归，得标准曲线，相关系数均大于0.999，对乙酰氨基酚在0.58~1.73 mg·mL^-1、氯苯那敏在2.50~7.49 μg·mL^-1范围内与其峰面积线性关系良好，方法的线性符合要求。结果见表2。

2.3.3 检测限与定量限

分别精密量取2.2.3项下对照品溶液适量，用稀释剂配制成一定质量浓度进样检测，以信噪比S/N ≥ 3确定检测限，以信噪比S/N ≥ 10确定定量限。对乙酰氨基酚的检测限溶液和定量限溶液主峰的信噪比分别为8.6、18.8，检测限为1.381 9 μg·mL^-1［相当于供试品溶液质量浓度（1.2 mg·mL^-1）的0.12%］，定量限为4.606 4 μg·mL^-1［相当于供试品溶液质量浓度（1.2 mg·mL^-1）的0.4%］。氯苯那敏的检测限溶液和定量限溶液主峰的信噪比分别为4.1、13.8，检测限为0.07 μg·mL^-1［相当于供试品溶液浓度（5 μg·mL^-1）的5%］，定量限为0.25 μg·mL^-1［相当于供试品溶液浓度（5 μg·mL^-1）的1.5%］，能满足分析要求。

2.3.4 精密度实验

取供试品溶液（样品7），按照2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，对乙酰氨基酚及氯苯那敏的含量RSD值（n=6）分别为0.08%、0.15%，均小于2.0%，表明仪器的精密度良好，满足要求。

2.3.5 重复性实验

取同一批号样品（样品7），按照2.2.4供试品溶液制备方法平行制成6份，按照2.1项下色谱条件进样测定，对乙酰氨基酚及氯苯那敏含量的RSD值为0.10%、0.20%，均小于2.0%，表明方法的重复性良好，满足要求。

2.3.6 稳定性实验

取同一供试品溶液（样品7），分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，对乙酰氨基酚及氯苯那敏含量的RSD值为0.19%、0.39%，小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.7 回收率实验

精密量取2.2.3项下混合对照品储备液0.5、1.0、1.5 mL，用标准加入法，用空白辅料溶液将其稀释成标示量的50%、100%、150% 3个浓度共9份溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，测定回收率，将测得量和加入量的比值作为对乙酰氨基酚和氯苯那敏的回收率（%），以回收率结果评估方法的准确度。2个企业9份样品对乙酰氨基酚回收率均在98.14%~101.74%之间，平均回收率分别为100.44%、99.15%，RSD值分别为1.40%、1.35%，均小于2.0%，氯苯那敏回收率均在98.00%~101.54%之间，平均回收率分别为99.49%、99.29%，RSD值分别为1.19%、1.13%，均小于2.0%，准确度结果符合要求。准确度实验结果见表3。

2.3.8 耐用性实验

2.3.8.1 柱温变化的影响

以样品7为例，考察了不同柱温（27、30、33 ℃）对对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的影响。不同柱温下2个主成分的平均含量变化较小，含量均匀度检查符合要求，表明柱温小范围波动对该方法影响较小，满足耐用性要求。实验结果见表4。

2.3.8.2 流速变化的影响

以样品7为例，考察了不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min^-1）对对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的影响。不同流速下2个主成分的平均含量变化较小，含量均匀度检查符合要求，表明流速小范围波动对该方法影响较小，满足耐用性要求。实验结果见表4。

2.3.8.3 pH值变化的影响

以样品7为例，考察了不同流动相pH值（2.8、3.0、3.2）对对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的影响。不同pH值下2个主成分的平均含量变化较小，含量均匀度检查符合要求，表明pH值小范围波动对该方法影响较小，满足耐用性要求。实验结果见表4。

2.3.8.4 色谱柱变化的影响

以样品7为例，考察了不同色谱柱［Shim-pack VP-ODS（150 mm × 4.6 mm，5 μm ）、Waters Symmtry C₁₈（150 mm × 4.6 mm，5 μm ）、Agilent 120 EC-C₁₈（150 mm × 4.6 mm，5 μm ）］对对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的影响。不同色谱柱下2个主成分的平均含量变化较小，含量均匀度检查符合要求，表明该方法对色谱柱无特异性要求，满足耐用性要求。实验结果见表4。

2.3.8.5 高效液相色谱仪变化的影响

以样品7为例，考察了不同高效液相色谱仪（Thermo Ultimate 3000、岛津LC-20AD、Waters e2695-2998）对对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量的影响。在不同品牌、型号的液相色谱仪上2个主成分的平均含量变化较小，含量均匀度检查符合要求，表明该方法对液相色谱仪的品牌、型号无特异性要求，满足耐用性要求。实验结果见表4。

2.4 样品测定

取22个批次的样品，每批10片，分别置于100 mL量瓶中，按照2.2.4项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算每片的含量，并计算10片的平均含量。实验结果见表5、图2。可知各批次2种主成分的含量及含量均匀度良好，所有样品对乙酰氨基酚及氯苯那敏含量按平均装量计算均在90.0%~110.0%之间，A+2.2S均小于15.0，符合现行标准限度及《中国药典》通则的要求。B企业4个批次的对乙酰氨基酚及氯苯那敏含量均优于A企业2个批次。2个企业各批次氯苯那敏的A+2.2S显著大于对乙酰氨基酚，表明可能是在制片工艺中投料较小的氯苯那敏的均匀性不够。

对各批次中对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量比值进行了分析，22批样品双组分含量比的平均值均在0.97~1.02以内，总体波动较小。每批10片样品的RSD值能很好地反映样品2个组分的混合比例均匀情况，A企业大部分样品双组分含量比RSD超过2.0%，表明该厂家样品中对乙酰氨基酚与氯苯那敏混合均匀性可能欠佳，导致同批次制片工艺中，片与片的差别较大。相比之下，B企业批次的双组分含量、含量均匀度及组分之间相关性均较好，表明该厂生产工艺较为稳定。

不同批次含量分布图见图3，由图3可知，本次抽验样品含量测定结果均分布在标示含量的94.0%~102.0%区间内。对乙酰氨基酚与氯苯那敏含量结果分布图见图4，由图4可知，22批样品共计测定220个供试品含量，对乙酰氨基酚和氯苯那敏含量结果总体分布为正态分布，2个组分的正态分布的中心点偏离到100%的左侧。造成这种现象的原因可能是，在生产时，对乙酰氨基酚和氯苯那敏投料量可能未达到100%；或是对乙酰氨基酚和氯苯那敏在生产、储存等环节中容易降解，造成了所测含量低于100%。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本实验建立了HPLC波长切换法测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和马来酸氯苯那敏的含量。在原有标准用体积分数10%甲醇洗脱的基础上，考察了增加甲醇体积分数至30%，氯苯那敏峰保留时间也需32 min，分析时间仍较长，因此，用甲醇-乙腈（1∶1）作为有机相^［7］，梯度洗脱，能够在较短时间内分离对乙酰氨基酚和氯苯那敏。由于氯苯那敏的进样质量浓度（5 μg·mL^-1）较低^［8］，根据其紫外吸收光谱，优先确定氯苯那敏检测波长为225 nm（图1 K）^［9］；考虑到对乙酰氨基酚（1.2 mg·mL^-1）进样质量浓度较大，在其最大吸收波长245 nm（图1 J）处的响应值易造成信号过载，因此用低吸收波长310 nm作为其检测波长^［10］。因此本研究综合流动相选择和色谱响应值，建立了适合双组分测定的波长切换液相色谱法^［11-16］。

3.2 结果分析

根据药品质量标准分析方法验证指导原则^［17］对该方法进行了考察，结果表明建立的HPLC波长切换法操作简便、专属性强、稳定性好，可同时测定小儿氨酚那敏片中对乙酰氨基酚和氯苯那敏的含量。结果表明，抽验的22批样品，按此法检验，含量、含量均匀度均在标示量的90.0%~110.0%之内；两组分含量比例基本上在0.97~1.02以内。表明目前市售药品中两组分的配比总体是均匀的，质量控制尚可。

3.3 标准问题

对于双组分样品，含量测定前处理方法按现行标准“取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于对乙酰氨基酚对照品约120 mg）置于25 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得，测定结果可能会平行性较差，其原因多为样品中两组分比例相差悬殊时，较难混合均匀，如本品中对乙酰氨基酚与马来酸氯苯那敏配比高达240∶1。用含量均匀度整片取样制备供试品溶液，则能全面客观地反映产品的质量情况，减少了实验中人为的误差，因此建议在标准中修订含量测定供试品溶液制备方法，并增加双组分含量均匀度检查，并将含量均匀度平均值作为含量测定结果。目前我国该制剂生产企业已有几十家，而在产的数量非常少^［18］，原料仅有数家生产，部分原料仍需进口。企业对于对乙酰氨基酚和氯苯那敏投料倾向于高于100%投料^［19］，也是避免承受随着时间延长含量自然降低而带来的不合格风险。由于本次抽样涉及的厂家和批次较少，数据收集量还不足，今后将扩大样本量，深入研究，以期提高儿童用药的安全性^［20］。

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基金资助

国家药品抽检计划项目(国药监药管［2022］1 号)