HPLC法同时测定冠心安口服液中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O- β -d-葡萄糖苷的含量

Simultaneous determination of the contents of smectin, tetrahydropalmatine and 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-O- β -d- glucoside in Guanxin’an Oral Liquid by HPLC

摘要

目的 建立能同时测定冠心安口服液中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷含量的HPLC分析方法。 方法 Capcell Pak UG C₁₈色谱柱分离；蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷检测波长分别设定为334、281、320 nm；柱温为室温；进样体积为10 µL；以乙腈为流动相A，1 mL·L^-1磷酸溶液（三乙胺调节pH至6.0）为流动相B，梯度洗脱。 结果 蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的质量浓度分别在0.024 5~2.450 0、0.045 7~4.570 0、0.047 4~4.740 0 μg·mL^-1范围内线性良好；平均回收率分别为100.8%、99.9%、101.4%；精密度和重复性RSD值（n=6）均在5.0%以内；供试品溶液在24 h内稳定。 结论 此方法具有前处理简单、分析时间短和检测结果准确等优点，适用于冠心安口服液制剂的质量控制。

Abstract

To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the contents of smectin， tetrahydropalmatine and 2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside in Guanxin’an Oral Liquid. Methods Capcell Pak UG C₁₈ chromatographic column was used for separation. Acetonitrile was used as mobile phase A， and 1 mL∙L^-1 phosphoric acid solution （adjust pH to 6.0 by triethylamine） was used as mobile phase B， in a gradient elution mode. The detection wavelengths of smectin， tetrahydropalmatine and 2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside were set at 334 nm， 281 nm and 320 nm respectively. The column temperature was room temperature， and the injection volume was 10 μL. Results Smectin，tetrahydropalmatine and 2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside showed good linear relationships in the concentration ranges 0.024 5-2.450 0， 0.045 7-4.570 0 and 0.047 4-4.740 0 μg∙mL^-1， respectively. The average recoveries were 100.8%， 99.9% and 101.4% respectively. The RSDs （n=6） of precision and repeatability were within 5.0%. The test solution was stable within 24 hours. Conclusion The results show that this method has the advantages of simple pretreatment， short analysis time and accurate detection results， and is suitable for the quality control of Guanxin’an Oral Liquid.

Graphical abstract

关键词

高效液相色谱法 / 冠心安口服液 / 蒙花苷 / 延胡索乙素 / 2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷

Key words

HPLC / Guanxin’an Oral Liquid / smectin / tetrahydropalmatine / 2，3，5，4’-tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside

冠心安口服液是由野菊花、川芎、延胡索、珍珠母、茯苓、桂枝、首乌藤、牛膝、降香、三七、半夏、大枣、甘草、柴胡、冰片15味药材，通过粉碎、蒸馏提取等工艺加工制得的中药口服液体制剂，具有宽胸散结、活血行气等作用，临床经常用于治疗气滞血瘀型冠心病及心绞痛引起的胸痛、憋气、心悸、气短、乏力、心力衰竭等症状^［1-3］。在冠心安口服液的药材组成中，野菊花具有清热、解毒等作用^［4-6］，延胡索具有活血、利气、止痛等作用^［7-9］，首乌藤具有养血安神、祛风通络等作用^［10-12］。目前，随着我国人口老龄化趋势的加剧以及工作、生活等压力的不断加大，许多老年人患有冠心病、心绞痛等病症，因此冠心安口服液在临床上的应用也越来越多^［13-15］。冠心安口服液现收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第十六册，标准编号为WS3-B-3075-98，现行有效标准中规定了性状、鉴别、检查等，缺少含量测定检测项目，因此不能较好地控制冠心安口服液制剂的产品质量。实验研究了冠心安口服液的药材组成，通过控制野菊花、延胡索和首乌藤3种药材的质量情况，最终建立了能同时测定冠心安口服液中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷含量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析方法^［16-20］。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦 1290 infinity（配备G4513A型自动进样器、G1316C型柱温箱、G1315型二极管阵列检测器，美国Agilent科技公司）；梅特勒 AE200型电子天平（精度为万分之一，瑞士Mettler-Toled科技公司）；Capcell Pak UG C₁₈色谱柱（日本资生堂科技公司）；鑫欣XCD-NS-3C型多槽超声波清洗机（济宁鑫欣超声电子设备公司）。

1.2 试药

对照品：蒙花苷（批号111528-202112，CAS号480-36-4，质量分数为98.0%）、延胡索乙素（批号110726-202020，CAS号2934-97-6，质量分数为99.3%）、2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷（批号110844-202116，CAS号82373-94-2，质量分数为94.8%），均购自中国食品药品检定研究院；冠心安口服液制剂（批号：20220124、20220308、20220412，规格为10 mL∙支^－1），为北京同仁堂科技发展（唐山）有限公司生产的市售制剂；实验用水为超纯水，自制；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自天津市科密欧试剂公司；其他试剂均为分析纯，购自上海化学试剂厂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Capcell Pak UG C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温为室温；以乙腈为流动相A、1 mL∙L^-1磷酸溶液（三乙胺调节pH至6.0）为流动相B，梯度洗脱（0~5 min，13% A；5~15 min，13%~45% A；15~24 min，45%~86% A；24~30 min，86% A；30~31 min，13% A；30~35 min，13% A）。蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷检测波长分别设定为334、281、320 nm；流速为1.0 mL∙min^-1；进样量为10 µL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品储备液

取1.2项下蒙花苷对照品，精密称取一定量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL溶液中含蒙花苷24.5 μg的溶液，即得蒙花苷对照品储备液；同法制备每1 mL溶液中含延胡索乙素、2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷分别为45.7、47.4 μg的储备液，分别加甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.2 对照品溶液

取2.2.1项下蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷对照品储备液，分别精密移取1.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液

按冠心安口服液质量标准中的处方和制备方法，分别制备缺野菊花、延胡索和首乌藤药材的阴性样品，阴性样品溶液按2.2.4项下供试品溶液制备方法制备，分别制得野菊花、延胡索和首乌藤阴性对照溶液。

2.2.4 供试品溶液

取冠心安口服液供试品（批号：20220124、20220308、20220412），摇匀后，精密移取5.0 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇约40 mL，超声提取15 min（超声功率设定为250 W，频率为50 Hz），提取完毕后，在室温下放冷，加甲醇定容，摇匀，滤过（0.45 μm滤膜），续滤液即为供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 专属性研究

取2.2项下对照品、供试品和阴性对照溶液，按照2.1项下色谱条件设置，等待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述溶液，收集谱图。结果表明，在与对照品溶液谱图中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷相应的保留时间位置，供试品溶液谱图中均有相对应的吸收峰；在阴性样品溶液中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷色谱峰对应位置无干扰峰；3种待测物分离良好，理论塔板数均大于2 000。典型色谱图见图1。

2.3.2 仪器精密度研究

取2.2项下对照品溶液，按照2.1项下色谱条件设置，等待色谱仪基线稳定后，进样10 μL上述溶液，连续进样6次，收集谱图。根据谱图中收集的蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷峰面积计算相对标准偏差（RSD）。计算得蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷峰面积的RSD值分别为1.32%、0.81%、1.04%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3 重复性研究

取冠心安口服液供试品（批号20220124，规格为10 mL∙支^-1），摇匀后，精密移取5.0 mL，平行取样6份，分别置于50 mL棕色量瓶中，后续处理按2.2.4项下方法进行，平行制备6份供试品溶液；按照2.1项下色谱条件设置，待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述供试品溶液，收集谱图。根据谱图中收集的蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的峰面积，计算6份供试品中3种成分的含量，以6份供试品含量测定的结果计算得蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷含量的RSD值分别为1.89%、1.19%、2.36%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 溶液稳定性研究

取冠心安口服液供试品（批号20220124，规格为10 mL∙支^-1），后续处理按照2.2.4项下方法进行，制得供试品溶液，于常温下放置，按照2.1项下色谱条件设置，等待色谱仪基线稳定后，分别在0、2、4、8、12、24 h取样检测，收集谱图。根据谱图中收集的蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的峰面积计算RSD值。结果根据谱图中收集的蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷峰面积的RSD值分别为1.27%、1.51%、1.12%，表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.3.5 线性关系研究

取2.2.1项下蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷对照品储备液，分别准确移取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mL，再分别置于5个10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，摇匀；按照2.1项下色谱条件设置，等待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述溶液，收集谱图。分别以蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，计算曲线方程。结果见表1。

2.3.6 加标回收研究

取已测定蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷含量的冠心安口服液供试品（批号20220124，规格为10 mL∙支^-1），精密移取2.5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，平行取样6份，分别加入2.2项下对照品储备液适量，后续处理按照2.2.4项下方法进行，分别制得供试品加标溶液，按照2.1项下色谱条件设置，等待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述溶液，收集谱图，计算回收率。结果见表2。

2.4 方法应用实例

取冠心安口服液供试品（批号：20220124、20220308、20220412，规格为10 mL∙支^-1），后续处理按照2.2.4项下方法进行，每份供试品制备2份平行；按照2.1项下色谱条件设置，待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述溶液，收集谱图，计算供试品中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

实验选取冠心安口服液药材组成中的野菊花、延胡索和首乌藤3种药材，通过控制这3种药材的药效活性成分作为其质量控制的指标。取2.2.2项下蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷对照品溶液，按照2.1项下色谱条件设置，待色谱仪基线稳定后，分别进样10 μL上述溶液，设置波长扫描范围为200~600 nm，采集3种成分的光谱图。结果显示，蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷的最大吸收波长分别为334、281、320 nm，差异较大。为提高检测效率，实验用程序波长切换技术，即在0~10 min时，采集波长设定为334 nm；10~20 min时，采集波长设定为281 nm；20~30 min时，采集波长设定为320 nm，实现了在同一色谱条件下，在3种成分最大吸收波长处分别测定其含量的方法。

3.2 流动相的选择

液相色谱法常用的流动相有甲醇体系和乙腈体系，实验分别选择将水-甲醇、水-乙腈、甲醇-1 mL∙L^-1磷酸溶液和乙腈-1 mL∙L^-1磷酸溶液作为流动相体系时，观察其对蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷3种待测物出峰时间、分离效果等的影响情况。结果显示，选择甲醇体系时，3种目标物出峰时间较长，检测效率偏低；选择水-乙腈体系时，蒙花苷色谱峰发生分叉，原因可能是蒙花苷在上述状态下存在2种分子状态，这2种分子状态在该色谱条件下微弱分离，导致定量结果不准确；选择乙腈-1 mL∙L^-1磷酸溶液时，蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷分离良好，分析时间较短，且无基质干扰。故实验选择乙腈-1 mL∙L^-1磷酸溶液作为流动相体系。

3.3 前处理条件的优化

冠心安口服液由15味药材组成，药材种类较多，基质复杂，为提高检测准确度和缩短分析时间，有必要对前处理方法进行优化。取冠心安口服液供试品，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液。实验分别设置提取溶剂为甲醇、体积分数为85%的甲醇溶液和体积分数70%甲醇溶液时，考察其对蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-葡萄糖苷3种成分提取的影响，再分别考察超声功率（240、250、260 W）和提取时间（10、15 、20 min）对3种成分提取的影响，结果选择甲醇作为提取剂、超声功率设置为250 W、时间为15 min为最佳提取条件。

综上所述，实验以冠心安口服液为研究对象，选取其药材组成中的野菊花、延胡索和首乌藤的活性成分作为研究目标，建立同时测定冠心安口服液中成药中蒙花苷、延胡索乙素和2，3，5，4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-d-含量的HPLC分析方法。对建立方法的重复性、线性、回收率等进行了考察，并对前处理的条件进行了优化。结果表明，此方法具有分析速度快、灵敏度高、专属性强等优点，适用于冠心安口服液制剂的质量控制，为该产品含量测定方法的完善提供依据。

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