基于PI3K/Akt/mTOR通路探究七氟醚麻醉对大鼠神经细胞凋亡的影响

Effect of sevoflurane anesthesia on neuronal apoptosis in rats based on PI3K/Akt/mTOR pathway

摘要

目的 探讨七氟醚麻醉对大鼠认知功能及神经细胞凋亡的影响。 方法 取96只大鼠，随机分为对照组（吸入2 L·min^-1氧气）、七氟醚低浓度组（吸入体积分数为1%的七氟醚+2 L·min^-1氧气）、七氟醚中浓度组（吸入体积分数为2%的七氟醚+2 L·min^-1氧气）、七氟醚高浓度组（吸入体积分数为4%的七氟醚+2 L·min^-1氧气），持续吸入6 h。用Morris水迷宫实验观察各组大鼠认知能力，用HE染色观察海马组织学形态，用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定海马组织中枢神经特异性蛋白（soluble protein 100β，S-100β）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，流式细胞术测定神经细胞凋亡情况，蛋白印迹法（Western blotting）测定海马组织B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphorylated serine/threonine kinase，p-Akt）和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）的水平。 结果 HE染色结果表明，对照组海马组织神经细胞结构正常，排列紧密，七氟醚各浓度组大鼠海马组织神经细胞减少，排列紊乱，分布不均匀。与对照组比较，七氟醚各浓度组大鼠逃避潜伏期时间，S100-β、NSE、IL-1β、TNF-α水平，Bax蛋白水平和神经细胞凋亡率均升高，穿越平台次数，平台停留时间，Bcl-2、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平均降低（P<0.05）；七氟醚各浓度组诸项指数水平变化规律相同，并呈剂量依赖性（P<0.05）。 结论 七氟醚麻醉可诱导大鼠神经细胞凋亡，使大鼠认知能力衰退，其可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

Abstract

Objective To investigate the effect of sevoflurane anesthesia on cognitive function and nerve cells apoptosis in rats. Methods 96 rats were randomly divided into control group （inhale 2 L·min^-1 oxygen）， low concentration of sevaflurane group （inhale volume fraction 1% sevaflurane+2 L·min^-1 oxygen）， medium concentration of sevaflurane group （inhale volume fraction 2% sevaflurane+2 L·min^-1 oxygen）， and high concentration of sevaflurane group （inhale volume fraction 4% sevaflurane+ 2 L·min^-1 oxygen）. The inhalation lasted for 6 hours. The cognitive ability of rats was observed by Morris water maze test， and the hippocampal histological morphology was observed by HE staining. The levels of soluble soluble protein 100β （S-100β）， neuron-specific enolase （NSE）， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. The neuro apoptosis was determined by flow cytometry， and the levels of B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， Bcl2-associated X protein （Bax）， phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase （p-PI3K）， phosphorylated serine/threonine kinase （p-Akt） and phosphorylated mammalian target of rapamycin （p-mTOR） proteins were determined by Western blotting. Results HE staining showed the hippocampal tissue nerve cells in control group were normal and tightly arranged， the hippocampal tissue nerve cells were reduced， disordered and poorly distributed in different concentrations of sevoflurane groups. Compared with control group， the time of escape latency， S100-β， NSE， IL-1β， TNF-α， Bax protein levels and nerve cells apoptosis rates were significantly increased in different concentrations of sevoflurane groups， and the number of times through the platform， residence time on platform， Bcl-2， p-PI3K， p-Akt and p-mTOR protein levels were significantly reduced（P<0.05）.The changes of indexes in sevoflurane groups were the same， and they were dose-dependent （P<0.05）. Conclusion Sevoflurane anesthesia induces apoptosis in nerve cells and causes cognitive decline in rats， which may be related to the regulation of PI3K‍/‍Akt/mTOR signaling.

Graphical abstract

关键词

七氟醚 / 神经细胞 / 凋亡 / 磷脂酰肌醇3-激酶 / 丝氨酸/苏氨酸激酶 / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

Key words

sevoflurane / nerve cells / apoptosis / phosphoinositide 3-kinase / serine/threonine kinase / mammalian target of rapamycin

七氟醚无色透明，无刺激性，是临床最常用的麻醉药物，被广泛用于麻醉、检查等手术中。随着七氟醚在手术中的广泛应用，其存在的不良反应也备受关注^［1］。有研究表明，在哺乳动物发育过程中，七氟醚的使用会对大脑神经细胞产生毒性，可能造成认知功能障碍^［2］，其机制可能是七氟醚诱导海马区部分基因改变导致神经细胞发生再生抑制、凋亡以及突触功能障碍^［3-4］。本研究则以大鼠吸入不同浓度七氟醚研究七氟醚对认知功能及神经细胞的影响，为七氟醚在临床应用中作用机制的研究提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Morris水迷宫系统（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；CytoFLEX流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；RM2235切片机（德国徕卡公司）；Multiskan GO酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；1658033电泳仪和CheniDoc XRS化学发光成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 试药

七氟醚（批号1612540，北京迈瑞达科技有限公司）；中枢神经特异性蛋白（soluble protein 100β，S100β）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海歌凡生物科技有限公司）；大鼠神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）ELISA试剂盒（上海慕远生物科技有限公司）；大鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒、BCA蛋白质量浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；膜联蛋白Ⅴ（annexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙碇（propionic iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗大鼠B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K）、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶（phosphorylated serine/threonine kinase，p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），均购自美国Abcam公司。

1.3 动物

96只SPF级雄性SD大鼠，8周龄，体质量为（200±20） g，由中国食品药品检定研究院提供，许可证号为SCXK（京）2017-0005，室温饲养，实验前适应性饲养5 d。

2 方法

2.1 大鼠分组及干预方法

将96只实验大鼠随机分为对照组、七氟醚低浓度组、七氟醚中浓度组、七氟醚高浓度组，每组24只。将各组大鼠放入配有麻醉气体检测仪的麻醉箱内。对照组吸入2 L·min^-1氧气；七氟醚低浓度组吸入体积分数为1%的七氟醚+2 L·min^-1氧气；七氟醚中浓度组吸入体积分数为2%的七氟醚+2 L·min^-1氧气；七氟醚高浓度组吸入6 h体积分数为4%的七氟醚+2 L·min^-1氧气，均持续吸入6 h^［5］。6 h后停止吸入，各组大鼠再继续吸入0.5 h氧气，待大鼠清醒后将其放回到恒温动物饲养房中，自由取食。

2.2 Morris水迷宫实验

七氟醚麻醉24 h后取各组8只大鼠进行水迷宫实验，包括定位航行实验和空间探索实验，实验持续5 d。定位航行实验即连续4 d将大鼠随机从4个象限入水点入水，记录每只大鼠2 min内到达隐蔽平台的时间并在平台上停留30 s（逃避潜伏期）。若2 min内未到达平台，记录潜伏期为120 s。空间探索实验即实验第5天，移走平台，将大鼠从对称象限入水，观察120 s内大鼠穿过所在象限的次数及其在平台区域的停留时间。

2.3 组织学观察

麻醉24 h后，各组取8只大鼠注射30 mg·kg^-1戊巴比妥钠进行麻醉，迅速断头处死，快速分离出海马组织，于100 mL·L^-1的中性甲醛中固定48 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制作厚度为4 μm的连续切片，随后进行常规HE染色，中性树胶封片后，在显微镜下观察结果。

2.4 S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平检测

麻醉24 h后，取各组剩余8只大鼠，注射30 mg·kg^-1戊巴比妥钠进行麻醉，无菌操作下取海马组织，液氮处理后放置在-80 ℃的冰箱中冷冻保存，取一部分海马组织加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）1 mL进行匀浆，匀浆液以8 000 r·min^-1离心10 min（离心半径为10 cm），取上清液，用ELISA按照试剂盒说明书进行检测，用酶标仪在450 nm波长处测定样品的吸光度（A）值，根据A值计算样品S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平。

2.5 流式细胞术检测神经细胞凋亡率

取一部分2.4项下冷冻保存的各组大鼠海马组织，将其研磨制成密度为5×10⁵个·mL^-1的单细胞悬液，取单细胞悬液100 μL，加入稀释好的Binding Buffer缓冲液100 μL，轻轻吸打混匀后室温避光孵育10 min，加入Annexin V-FITC染液和PI染液各5 μL，再次轻轻吹打重悬细胞，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

2.6 诸项蛋白水平的检测

取一部分2.4项下冷冻保存的各组大鼠的海马组织100 mg，置于1.5 mL无酶EP管中，加入RIPA试剂0.6 mL后充分剪碎、匀浆，摇匀、静置5 min，重复3次，于高速低温离心机离心20 min（4 ℃，13 000 r·min^-1），提取总蛋白，用BCA试剂盒进行蛋白定量，取样本20 μg与等量上样缓冲液混匀后进行SDS-PAGE电泳，100 V电转30 min，转至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，50 g·L^-1脱脂奶粉室温封闭2 h，将膜放入1∶1 000稀释的Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR和mTOR一抗中，孵育过夜（4 ℃），TBST缓冲液洗膜，再放入1∶10 000稀释的二抗中，摇床孵育1 h（室温），TBST缓冲液洗膜，将PVDF膜置于凝胶成像仪的显影区，滴加显影液，设置显影条件，于暗室中进行曝光、显影，用凝胶成像系统采集照片，用Image J软件分析条带，计算目的蛋白的相对表达水平。目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

2.7 统计学方法

用软件SPSS 24.0分析处理数据，计量资料均以（\overline{x}±s）表示，多样本计量资料比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 水迷宫实验结果的比较

与对照组比较，七氟醚各浓度组在麻醉后大鼠逃避潜伏期时间显著延长，穿越平台次数和平台停留时间显著缩短（P<0.05）。大鼠逃避潜伏期随七氟醚浓度增加而延长，穿越平台次数和平台停留时间随七氟醚浓度增加而减少（P<0.05）。见表1、表2。

3.2 组织学变化的比较

对照组海马组织神经细胞结构正常，排列紧密；七氟醚各浓度组大鼠海马组织神经细胞排列紊乱，分布不均匀，细胞核固缩、偏移明显，并随着七氟醚浓度增加而损伤加重。见图1。

3.3 各组大鼠S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平的比较

与对照组比较，七氟醚各浓度组大鼠S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平均显著升高（P<0.05）。S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平随七氟醚浓度增加而升高（P<0.05）。见表3。

3.4 各组大鼠神经细胞凋亡率的比较

与对照组比较，七氟醚各浓度组大鼠海马组织中Bax蛋白表达水平和神经元细胞凋亡率均显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。Bax蛋白水平和神经元细胞凋亡率随七氟醚浓度增加而升高，Bcl-2蛋白水平随七氟醚浓度增加而降低（P<0.05）。见表4、图2和图3。

3.5 p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平的比较

与对照组比较，七氟醚各浓度组大鼠p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平随七氟醚浓度增加而降低（P<0.05）。见图4、表5。

4 讨论

七氟醚是临床使用广泛的吸入型麻醉药物，具有麻醉效果迅速、麻醉作用强、维持时间长等优点，主要应用于儿童和老年患者全身麻醉诱导^［6-7］。七氟醚主要是通过阻碍兴奋性突触传递抑制中枢，然而麻醉苏醒延迟对认知和记忆功能会产生一定损伤^［8］。七氟醚发挥作用的同时可导致大鼠海马神经细胞凋亡和持续的空间学习障碍，降低大鼠认知功能^［9］。

Morris水迷宫实验可测定动物的认知功能，逃避潜伏期反映学习能力，穿越平台次数反映记忆能力^［10］。本研究中，七氟醚各浓度组大鼠穿越平台次数和平台停留时间均较对照组减少（缩短），HE染色结果显示也观察到七氟醚各浓度组大鼠海马组织神经细胞排列紊乱，分布不均匀，表明七氟醚会改变神经细胞形态和功能，降低大鼠认知能力，对神经系统的正常发育产生影响。S100β及NSE蛋白是检测脑损伤的敏感指标，两者在神经组织中广泛分布，大脑出现损伤时能穿过受损的血脑屏障进入血液中使S100β和NSE蛋白水平升高^［11-12］。IL-1β、TNF-α是由机体免疫细胞合成的促炎细胞因子，可促使脑缺血后脑组织炎症的发生、发展，从而加重脑损伤^［13-14］。本研究中，七氟醚各浓度组大鼠S100-β、NSE、IL-1β和TNF-α水平均较对照组升高，表明七氟醚会破坏血脑屏障，诱导炎症因子含量增加，造成脑组织神经功能损伤。

细胞凋亡是多细胞有机体在生长、发育及维持内部平衡过程中发生的由基因控制的细胞生理性死亡现象^［15］。Bcl-2家族蛋白是关键调节蛋白^［16］，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad）。Bax蛋白与Bcl-2在正常条件下形成同源或异源二聚体来调控细胞凋亡^［17］。本研究中，七氟醚各浓度组大鼠海马组织中Bax蛋白水平和神经细胞凋亡率均较对照组升高，Bcl-2蛋白水平较对照组降低，表明七氟醚可上调海马组织中Bax/Bcl-2表达，诱导大鼠神经细胞的凋亡。PI3K/Akt信号通路参与调节细胞的分裂、分化、生长、代谢以及凋亡等一系列生物学进程^［18］，mTOR是该通路的主要下游靶蛋白，PI3K‍/‍‍Akt/mTOR信号通路可调控细胞氧化应激、炎性反应及凋亡等多种生物学过程^［19］。PI3K/Akt/mTOR信号通路在神经系统发育过程中起主要调控作用，通路激活可以减轻脑组织神经炎症反应，抑制神经元凋亡^［20］。本研究中，七氟醚各浓度组大鼠p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平较对照组均降低，表明七氟醚可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导神经细胞凋亡，增加神经细胞的凋亡率。

综上所述，七氟醚可降低大鼠的认知能力，改变神经细胞形态，促进炎性反应，诱导神经细胞凋亡，其可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

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基金资助

国家自然科学基金项目(81660195)

海南省自然科学基金项目(821RC724)