基于网络药理学和实验研究槲皮素治疗阿尔兹海默病的机制

Study on the mechanism of quercetin in the treatment of Alzheimer’s disease based on network pharmacology and experiment verification

摘要

目的 通过网络药理学和实验验证和探究槲皮素（quercetin）治疗阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）的作用机制。 方法 通过TCMSP、Swiss Target Prediction和Uniprot数据库筛选槲皮素对应的作用靶点。通过TCMIP V2.0、TCMSP、TTD、DrugBank、CTD和DisGeNET数据库得到与AD发病机制相关的靶点，并与槲皮素作用靶点进行映射，将得到的交集靶点作为槲皮素治疗AD的靶点。通过String数据库、CytoNCA和MCODE插件对槲皮素治疗AD的靶点进行各蛋白之间的相互作用研究，作用强的靶点为槲皮素治疗AD的关键靶点。将槲皮素治疗AD的靶点通过Cytoscape 3.8.2软件的ClueGO插件和DAVID数据库进行GO和KEGG信号通路富集分析。用蛋白印迹法（Western blotting）和实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）对预测的通路进行初步验证。 结果 筛选出与槲皮素作用的靶点有230个，与442个AD疾病靶点重合的靶点有43个，该靶点涉及多个生物学过程和54条信号通路。通过聚类分析和网络拓扑参数，得到槲皮素治疗AD的6个关键靶点，包括糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 β，GSK3β）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、淀粉样βA4蛋白（amyloid βA4 protein，APP）、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位α（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit α，PIK3R1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGF2）和转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1，TGFβ1）；细胞实验结果表明，槲皮素可提高AD细胞模型中的蛋白激酶B（protein kinase B， AKT）， GSK-3βmRNA水平，与调控AKT/GSK-3β通路的磷酸化有关。 结论 槲皮素可增强损伤神经细胞的稳定性、改善细胞膜的通透性，从而稳定细胞内环境。该作用可能与槲皮素提高AD细胞模型中的AKT、GSK-3β等mRNA水平，调控AKT/GSK-3β通路的磷酸化有关。

Abstract

Objective To explore the mechanism of quercetin in the treatment of Alzheimer’s disease （AD） through network pharmacology and experimental verification. Methods The targets of quercetin was screened by TCMSP， Swiss Target Prediction and UniProt database. Then the targets related to the pathogenesis of AD were obtained through TCMIP V2.0， TCMSP， TTD， DrugBank， CTD and DiSGeNET databases. Mapped with the target of quercetin， the obtained intersection target was used as the target of quercetin in the treatment of AD. Through String database， CytoNCA and MCODE plug-ins， the protein interaction of quercetin in the treatment of AD was carried out with the strong target as the key target of quercetin in the treatment of AD. The target of quercetin for AD treatment was enriched and analyzed by the Clue GO plug-in of Cytoscape 3.8.2 software and the DAVID database for GO and KEGG signaling pathway enrichment. Western blotting and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） were used to preliminarily verify the predicted pathway. Results 230 quercetin targets were screened， 43 of which coincided with 442 AD disease targets. The targets involved multiple biological processes and 54 signal pathways. Through cluster analysis and network topology parameters， 6 key targets of quercetin in the treatment of AD were obtained， including glycogen synthase kinase-3β （GSK3β）， vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， amyloid beta A4 protein （APP）， phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha（PIK3R1）， interleukin-6 （IL6）， insulin-like growth factor Ⅱ （IGF2） and transforming growth factor beta-1 （TGFβ1）. The results of cell experiment showed that quercetin increased the levels of AKT and GSK-3β mRNA in AD cell model and regulated the phosphorylation of AKT/GSK-3β pathway. Conclusion Quercetin can enhance the stability of injured nerve cells， improve the permeability of cell membrane， and stabilize the intracellular environment. This effect may be related to quercetin increasing the mRNA levels of AKT and GSK-3β in AD cell model and regulating the phosphorylation of AKT/GSK-3β pathway.

Graphical abstract

关键词

槲皮素 / 网络药理学 / 阿尔兹海默病 / β淀粉样蛋白25-35（Aβ_25-35） / 小鼠海马神经元细胞

Key words

quercetin / network pharmacology / Alzheimer’s disease / amyloid beta peptide 25-35 （Aβ_25-35） / HT22 cells

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种以β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）沉积和神经原纤维缠结为特征的神经退行性疾病^［1］。Aβ级联假说认为，大脑内神经细胞间堆积不溶性毒性Aβ^［2］，聚集态Aβ最终会引发神经炎症，导致突触和神经元损害，诱导细胞凋亡，导致学习记忆功能障碍^［3-4］。当正常生理状态被破坏时，β-分泌裂解酶、γ-分泌裂解酶裂解淀粉样βA4蛋白（amyloid beta A4 protein，APP）产生不溶性Aβ^［5］，AD病理学主要表现为Aβ在大脑海马区过度沉积形成老年斑、微管相关蛋白tau异常磷酸化所致的神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）及神经元DNA损失引起的神经元丢失等^［6-7］。

槲皮素（quercetin）是一种激素类的黄酮类化合物，可延长AD果蝇的寿命和改善其爬坡能力，表明其在AD中的潜在治疗作用。研究表明^［8-10］，槲皮素可稳定淀粉样蛋白模型小鼠载脂蛋白E并降低脑Aβ水平。槲皮素通过抑制Cleaved-胱天蛋白酶（Caspase）-3和B细胞淋巴瘤（Bcl）-相关X蛋白（Bax）活性及激活NF-κB p65，显著降低冈田酸诱导的tau蛋白过度磷酸化和氧化应激，抑制神经元凋亡。本文用网络药理学预测槲皮素作用于AD的潜在靶点，并通过实验确证预测结果的准确性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

生物安全柜（型号为HF1200LC）、CO₂细胞培养箱（型号为Smart Cell HF-90）、台式低速离心机（型号为DK-80）均购自上海力康仪器有限公司；PCR仪（型号为ABI QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR Syste，ABI公司）；酶标仪（型号为xMarkTM，Bio-Rad公司）。

1.2 试药

槲皮素（麦克林公司）；胎牛血清（Excell Bio公司）；DMEM高糖培养基（GIBCO公司）。

1.3 实验细胞株

小鼠海马神经元细胞HT22细胞株来源于丰晖生物科技有限公司。

1.4 数据库和软件

数据分析平台和软件见表1。

2 方法

2.1 槲皮素作用靶点的来源

将“quercetin”导入TCMSP数据库，整理其相关的靶点。将靶点导入Uniprot数据库，以Filter By栏目的“reviewed”和Popular Organism栏目的“homo sapiens”为限定词，将蛋白名称转换为基因名称。用PubMed数据库，下载槲皮素规范化的三维分子结构或SMILES ID，并导入SwissTargetPrediction数据库^［11］，整理其相应的靶点，最终将2个数据库得到的活性成分作用靶点删除重复的靶点，得到槲皮素的作用靶点。

2.2 AD疾病靶点的筛选

以“Alzheimer disease”为关键词，导入TCMIP V2.0平台的疾病相关分子库模块、TCMSP数据库、TTD数据库、DrugBank数据库和CTD数据库，以“M marker/mechanism and/or T therapeutic”为限定词，结合DisGeNET数据库以“UMLS CUI：C0702166”为限定词进行已知疾病靶点的检索及筛选，去掉重复，即可得到AD发病过程已知的靶点^［12］。将疾病靶点与槲皮素的作用靶点去交集，得到槲皮素治疗AD的靶点。

2.3 药物与疾病靶标的关联性分析

将槲皮素治疗AD的靶点导入String数据库中，以“homosapiens”和“minimum Required Interaction Score”均≥0.9为筛选标准，其余参数为默认参数，分析蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI），并构建关联网络图，删除孤立节点得到初始网络。用Cytoscape软件的插件CytoNCA对初始网络节点的中介中心性（betweenness centrality， BC）、紧密中心性（closeness centrality， CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality， EC）、局部平均连通性（local average connectivity-based method， LAC）和网络中心性（network centrality，NC）等拓扑参数进行网络简化。再用MCODE插件进行筛选，以“degree cutoff≥2，node score cutoff≥0.2，k-score≥2，maximum depth=100”为默认参数，以“BC”为准，选取occurrence≥2的靶点作为槲皮素治疗AD的关键靶点。

2.4 槲皮素治疗AD潜在靶点的基因分析

药物与疾病靶点之间的交集靶点通过Clue GO插件进行本体GO富集分析（BP、MF、CC）和信号通路富集分析。将Clue GO插件的Kappa评分设为0.4，P<0.05，其余用默认参数^［13］。

2.5 细胞实验验证

2.5.1 CCK-8法检测槲皮素组干预浓度

本课题组前期研究表明，β淀粉样蛋白25-35（amyloid beta peptide 25-35，Aβ_25-35）抑制HT22细胞存活率具有浓度依赖性，IC₅₀为173.568 μmol·L^-1［14］。取生长状态良好的HT22细胞，胰酶消化后，用完全培养基制备成密度为5×10⁴ 个∙mL^-1的单细胞悬液，接种至96孔板中（每孔100 μL，即5×10³ cells），在37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养24 h贴壁后，弃去培养基，分别加入终浓度为173.568 μmol·L^-1（IC₅₀）的Aβ_25-35和不同浓度槲皮素（0、1、5、10、20、50 μmol·L^-1）的混合液100 μL，同时设置空白对照组，干预48 h后，收集上清液检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH），同时每孔加入配制好的100 g·L^-1CCK-8溶液100 μL，继续在培养箱中孵育，1 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值。结合CCK-8和LDH检测结果筛选出后续实验槲皮素的低、中、高干预浓度。

2.5.2 LDH和活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测

取生长状态良好的HT22细胞，经胰酶消化后，用完全培养基制备成密度为5×10⁴ 个·mL^-1的单细胞悬液，分别接种至96孔板（每孔100 μL，即5×10³ cells）和6孔板中（每孔2 mL，即1×10⁵ cells），在37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养24 h贴壁后，弃去培养基，按照实验分组进行干预，每组重复3次。干预完成后，弃去培养基，收集细胞进行LDH和ROS检测（荧光检测波长设置：最佳激发波长为500 nm，最佳发射波长为525 nm）。

2.5.3 实验分组

模型组（173.568 µmol ∙L^-1的Aβ_25-35干预HT22细胞48 h）；阳性对照组（173.568 µmol·L^-1的Aβ_25-35和0.5 µmol·L^-1的SB216763共同干预HT22细胞48 h）；槲皮素低剂量组（173.568 µmol·L^-1的Aβ_25-35和5 µmol·L^-1槲皮素共同干预HT22细胞48 h）；槲皮素中剂量组（173.568 µmol·L^-1的Aβ_25-35和10 µmol·L^-1槲皮素共同干预HT22细胞48 h）；槲皮素高剂量组（173.568 µmol·L^-1的Aβ_25-35和20 µmol·L^-1槲皮素共同干预HT22细胞48 h）。

2.5.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测AKT、GSK-3β基因的表达水平

取生长状态良好的HT22细胞，经胰酶消化后，用完全培养基制备成密度为5×10⁴ 个·mL^-1的单细胞悬液，接种至培养瓶中，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂细胞培养箱中培养24 h。按照实验分组进行干预，每组重复5次。干预完成后，弃去培养基，加入Trizol消化细胞1 mL，使Trizol平铺在细胞层面上，反复摇晃细胞培养瓶，直至细胞消化装入1.5 mL EP管中。后续实验按照qRT-PCR实验步骤操作。

2.5.5 蛋白印迹法（Western blotting）检测诸项蛋白的表达水平

取生长状态良好的HT22细胞，经胰酶消化后，用完全培养基制备成密度为5×10⁴ 个·mL^-1的单细胞悬液，接种至培养瓶中，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂细胞培养箱中培养24 h。按照实验分组进行干预，每组重复3次。干预完成后，弃去瓶中的培养基，加入3 mL无菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，弃去PBS缓冲液，用胰酶消化细胞，操作方法同细胞传代。离心后弃去上清液，保留细胞沉淀，用无菌PBS 5 mL洗1遍后收集细胞。后续实验按照Western blotting实验步骤操作。

2.6 数据处理方法

所有数据用（\overline{x}\pm s）表示，用SPSS 19.0软件对各组数据进行统计学分析，数据若符合正态分布，则用单因素方差分析方法统计：方差齐性，用LSD方法进行多重比较；方差不齐，用Tamhane方法进行多重比较，P<0.05为差异有统计学意义；数据若不符合正态分布，先对数据进行对数转化，使数据正态化，再按照上述单因素方差分析方法对数据进行分析。

3 结果

3.1 槲皮素作用靶点的筛选结果

在TCMSP和Swiss TargetPrediction数据库搜索槲皮素相应的靶点，删除重复的靶点，得到槲皮素的230个作用靶点。

3.2 AD疾病靶点的筛选结果

通过TCMIP、TCMSP、CTD、TTD、DrugBank和DiSGeNET分别检索到27、77、117、155、45、52个靶点，删除重复靶点，共检索到442个已知的与AD发病过程相关的靶点。

3.3 槲皮素治疗AD的作用靶点和潜在靶点

将以上得到的442个AD相关疾病靶点与槲皮素230个作用靶点进行映射得到43个交集靶点。通过String数据库分析43个靶点之间的PPI。并用CytoNCA插件的PPI网络的交叉点进行中央网络评估，BC、CC、EC、LAC和NC等拓扑参数排在前25%的靶点有6个，包括糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、APP、磷脂酰肌醇3-激酶调节亚单位α（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit α，PIK3R1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL6）、胰岛素样生长因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGF2）和转化生长因子β1（transforming growth factorβ-1，TGFβ1）。其中occurrence≥2的靶点是GSK3β，见图1。GSK3β是AD神经元氧化应激过程中信号转导通路的关键因子。其信号通路介导的Aβ沉积、神经元凋亡以及Tau蛋白过度磷酸化在AD的发生及进展中发挥着重要作用。

3.4 GO富集和KEGG通路分析

为系统地阐释槲皮素治疗AD的作用机制，用R语言（cluster profile包）对43个潜在靶点进行基因功能和信号通路富集分析。按照显著性程度，GO和KEGG分析均以FDR≤0.05表示具有统计学意义。结果见图2、图3。由图2、图3可见，槲皮素治疗AD的靶点可参与多种生物学过程和54条信号通路，表明槲皮素可通过多靶点-多通路作用于AD。

3.5 CCK-8法确定Aβ_25-35药物干预浓度

CCK-8试剂是一种应用于测定细胞增殖率的快速、高灵敏度检测试剂，在电子载体的作用下被活细胞线粒体内的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性formazan，活细胞数越多颜色越深，死细胞无该功能。CCK-8检测试剂盒能鉴别存活细胞及死细胞，用于判断细胞的活性。用CCK-8法检测Aβ_25-35对细胞活力的影响，结果见表2。由表2可知，当不同浓度Aβ_25-35诱导细胞48 h后，随着Aβ_25-35的浓度在 0~250 µnmol·L^-1范围内不断增大，Aβ_25-35对细胞生长的抑制率不断增大，且与其浓度呈正相关，表明Aβ_25-35可对HT22细胞造成损伤，细胞的增殖被显著抑制，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），见表2。用SPSS 19.0软件得出Aβ_25-35作用HT22细胞48 h的半抑制浓度（IC₅₀）为173.568 µmol·L^-1，因此选择173 µmol·L^-1的Aβ_25-35作用细胞48 h。建立AD体外细胞损伤模型，用于槲皮素对AD 的药理作用研究。

3.6 槲皮素干预浓度的筛选

结果见表3。由表3可见，与空白组比较，Aβ_25-35诱导损伤的HT22 AD细胞模型组A值显著下降（P<0.01）。表明Aβ_25-35干预小鼠海马神经元细胞HT22后细胞存活率显著下降。不同浓度的槲皮素干预Aβ_25-35诱导损伤的HT22 AD细胞模型后5、10、20 µmol·L^-1干预组的A值显著升高，细胞数量也显著增加，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.01），其中20 µmol·L^-1时A值达到最高，在50 µmol·L^-1时A值有所下降，因此选用5、10、20 µmol·L^-1进行后续实验。

为了进一步确定槲皮素对Aβ_25-35诱导损伤HT22细胞活性的影响，用LDH试剂盒测定了细胞上清液中LDH含量。实验结果显示，与空白对照组比较，Aβ_25-35诱导损伤的HT22细胞AD模型组LDH值显著升高（P<0.01）。结果表明，Aβ_25-35干预小鼠海马神经元细胞HT22后细胞活力显著下降。用不同浓度的槲皮素干预Aβ_25-35诱导损伤的HT22细胞AD模型组，当槲皮素的浓度为1 µmol·L^-1时，细胞存活率与正常对照组无显著差异，表明槲皮素的浓度在此范围内对HT22细胞无显著作用（P>0.05），见表3。5、10、20 µnmol·L^-1干预组的LDH含量显著下降，在50 µmol∙L^-1时LDH含量开始上升。因此，选取5 µmol·L^-1为槲皮素作用的低浓度，10 µmol·L^-1为槲皮素作用的中浓度，20 µmol·L^-1为槲皮素作用的高浓度进行后续实验。

3.7 LDH和ROS的检测

LDH活性（U·L^-1）=［（测定A值－对照A值）/（标准A值－空白A值）］×标准品浓度（0.2 µmol·L^-1）×1 000。

结果见表1。由表1可见，与空白对照组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组细胞培养液中的LDH含量显著上升，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型对照组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组细胞培养液中的LDH含量显著低于模型组，差异具有统计学意义（P<0.01）。与空白对照组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组细胞培养液中的ROS荧光强度显著上升，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型对照组比较，低剂量槲皮素组细胞培养液中的ROS荧光强度无显著差异，但槲皮素中剂量、槲皮素高剂量组细胞培养液中的ROS荧光强度明显低于模型组，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），见表4。综上所述，表明槲皮素可显著降低Aβ_25-35诱导损伤HT22细胞培养液上清中的LDH、ROS含量。表明槲皮素能减轻氧化应激反应，提高HT22细胞的活力。

3.8 qRT-PCR检测AKT、GSK-3β基因的表达水平

AKT、GSK-3β基因的表达水平见图4。由图4可见，分别鉴定了检测基因AKT、GSK-3β以及内参基因mouse-GAPDH的PCR产物大小，图中的PCR产物大小均符合检测基因的片段大小。

逆转录PCR（reverse transcription PCR）检测不同干预组AKT和GSK-3β mRNA的表达水平，结果见表5。由表5可知，与空白对照组比较，模型对照组的AKT和GSK-3β mRNA的水平显著降低；与模型对照组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组AKT和GSK-3β mRNA的表达水平显著升高，AKT和GSK-3β mRNA的表达水平随槲皮素浓度的增加而增加，且呈浓度依赖性。

3.9 Western blotting检测诸项蛋白表达水平

目的蛋白AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β及内参蛋白β-actin的Western blotting检测结果见图5。由图5可见，图中的条带大小符合目的蛋白的大小。不同组蛋白的表达影响分析见表6，与空白对照组比较，模型对照组的p-AKT、p-GSK-3β蛋白的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），AKT和GSK-3β表达在各组间无显著差异。阳性对照组与模型对照组比较，p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型对照组比较，槲皮素低剂量组、槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达水平显著升高，槲皮素中剂量组、槲皮素高剂量组p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达水平逐渐上升，差异有统计学意义（P<0.05），尤其是槲皮素高剂量组，蛋白表达量接近于空白对照组。

4 讨论

在槲皮素治疗AD的关键靶点中，GSK-3β作为多种代谢和细胞生长信号转导途径的交叉点，其主要参与的信号通路为PI3K-AKT信号通路，是PI3K- AKT信号通路的下游分子，与活化的AKT结合后向细胞膜转位，磷酸化N端的Ser9活性位点而使其失活，减弱其对相关转录因子活化的抑制效应^［15-16］。

为进一步研究槲皮素对Aβ_25-35所致AD的小鼠海马神经元细胞HT22的影响，在IC₅₀浓度下的Aβ干预HT22细胞后，用不同浓度的槲皮素干预，结果表明槲皮素能够抑制Aβ_25-35损伤HT22细胞。前期研究的形态学观察结果表明，槲皮素能减轻Aβ_25-35诱导的HT22细胞损伤，表明槲皮素对Aβ_25-35所致AD的小鼠海马神经元细胞HT22具有保护作用。乳酸脱氢酶（LDH）是糖酵解的指标，它能催化L-乳酸和NAD转化为丙酮酸和NADH^［17］，LDH存在于细胞内，当细胞受到损伤时，会释放到细胞外，所以细胞上清液中LDH水平与细胞损伤程度呈正比^［18］，LDH的溢出也与细胞缺氧损伤后膜通透性改变有关^［19］。本研究结果显示，槲皮素用药组上清液中LDH水平显著低于模型对照组， 表明槲皮素除了可抑制细胞损伤外，还可能改善细胞膜的通透性，减轻Aβ_25-35诱导缺氧的细胞损伤， 增强细胞贴壁存活能力。研究表明，下调LDH可诱导胃癌SGC7901细胞凋亡^［20］。总之， 槲皮素可通过降低Aβ_25-35所致AD的小鼠海马神经元细胞HT22上清液中LDH的含量，改善细胞损伤。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，预测槲皮素治疗AD的潜在靶点和主要信号通路，结果发现，槲皮素可显著降低Aβ_25-35诱导损伤HT22细胞培养液上清中的LDH、ROS含量。表明槲皮素具有保护损伤神经细胞稳定性、改善细胞膜通透性，从而稳定细胞内环境的作用。该作用可能与槲皮素提高AD细胞模型中的AKT、 GSK-3β等mRNA水平，调控AKT/GSK-3β通路的磷酸化有关。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2019D01C217)

国家自然科学基金项目(81660696)

新疆自治区“十三五”重点学科建设基金项目(2016)