6-姜酚基于PKB/KIF14信号通路对大鼠口腔黏膜愈合的作用

6-Gingerol promoting the oral mucosal healing in rats based on PKB/KIF14 signaling pathway

摘要

目的 探讨生姜提取物6-姜酚对实验性口腔溃疡大鼠黏膜愈合的促进作用，及其对蛋白激酶B（PKB）/驱动蛋白家族成员14（KIF14）信号通路的调节作用。 方法 将50只大鼠随机分为正常组、模型组、6-姜酚组、信号通路抑制剂（LY294002）组和LY294002联合6-姜酚组，每组10只，除正常组外，其余组大鼠用冰醋酸烧灼法建立口腔溃疡模型，6-姜酚组大鼠尾静脉注射6-姜酚6 mg·kg^-1，LY294002组大鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg·kg^-1，LY294002联合6-姜酚组大鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg·kg^-1，30 min后，尾静脉注射6-姜酚6 mg·kg^-1；每日1次，连续7 d。计算溃疡面积，HE染色观察病理学变化，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）水平，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）水平，蛋白印迹法（Western blotting）检测磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、PKB和KIF14蛋白的相对表达量。 结果 模型组大量炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞坏死脱落，无新生成纤维细胞；6-姜酚组黏膜上皮覆盖，溃疡趋于愈合；LY294002组大量炎性细胞浸润，上皮结构被破坏，黏膜上皮细胞脱落坏死；LY294002联合6-姜酚组炎性细胞浸润减少，病变较6-姜酚组减轻。与模型组比较，6-姜酚组大鼠溃疡面积减小，IL-6、TNF-α、IL-1β水平及MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量降低，p-PI3K、p-PKB以及KIF14的相对表达量升高；LY294002组溃疡面积增加，IL-6、TNF-α、IL-1β水平以及MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量升高，p-PI3K、p-PKB及KIF14的相对表达量降低（P<0.05）；与LY294002联合6-姜酚组比较，6-姜酚组大鼠溃疡面积减小，IL-6、TNF-α、IL-1β水平及MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量降低，p-PI3K、p-PKB及KIF14的相对表达量升高；LY294002组溃疡面积增加，IL-6、TNF-α、IL-1β水平及MMP-2、MMP-9 mRNA相对表达量升高，p-PI3K、p-PKB及KIF14的相对表达量降低（P<0.05）。 结论 生姜提取物6-姜酚可促进口腔溃疡大鼠创面愈合，其可能是通过激活蛋白激酶B/驱动蛋白家族成员14信号通路发挥作用的。

Abstract

Objective To explore the promoting effect of 6-gingerol extract on mucosal healing in experimental oral ulcer rats and the regulation of protein kinase B （PKB）/driver protein family member 14 （KIF14） signaling pathway. Methods Fifty rats were randomly divided into normal group， model group， 6-gingerol group， LY294002 group and LY294002 combined with 6-gingerol group. Except for the normal group， the other groups were used to establish oral ulcer model by glacial acetic acid cauterization. Rats in the 6-gingerol group were injected with 6-gingerol 6 mg·kg^-1， rats in the LY294002 group were injected with LY294002 0.3 mg·kg^-1， rats in the LY294002 combined with 6-gingerol group were injected with LY294002 0.3 mg·kg^-1， and rats in the 6-gingerol combined with 6-gingerol group were injected with LY294002 0.3 mg·kg^-1 for 30 minutes， then tail vein injection of 6-gingerol 6 mg·kg^-1， once a day， for 7 consecutive days. The ulcer area was calculated， the pathological changes were observed by HE staining， the interleukin 6 （IL-6）， interleukin 1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）， and the matrix metalloproteinase 2 （MMP-2） and MMP-9 were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The relative expression levels of phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）， PKB and KIF14 proteins were detected by Western blotting. Results In the model group， a large number of inflammatory cells infiltrated the mucosa and the epithelial cells were necrotic and shed， and no new fibrocytes were formed. In 6-gingerol group， mucosal epithelium was covered and ulcer tended to heal. In LY294002 group， a large number of inflammatory cells were infiltrated， the epithelial structure was destroyed， and the mucosal epithelial cells were shed and necrotic. The inflammatory cell infiltration in LY294002 combined with 6-gingerol group was reduced， and the pathological changes were reduced in 6-gingerol group. Compared with model group， the ulcer area in 6-gingerol group was decreased， the levels of IL-6， TNF-α and IL-1β， the relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 mRNA decreased， the relative expression levels of p-PI3K， p-PKB and KIF14 increased， and the ulcer area in LY294002 group increased. The levels of IL-6， TNF-α and IL-1β were increased， the relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 mRNA increased， and the relative expression levels of p-PI3K， p-PKB and KIF14 decreased （P<0.05）. Compared with LY294002 combined with 6-gingerol group， the ulcer area of 6-gingerol group was decreased， the levels of IL-6， TNF-α and IL-1β， the relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 mRNA decreased， the relative expression levels of p-PI3K， p-PKB and KIF14 increased， and the ulcer area of LY294002 group increased. The levels of IL-6， TNF-α and IL-1β were increased， the relative expression levels of MMP-2 and MMP-9 mRNA increased， and the relative expression levels of p-PI3K， p-PKB and KIF14 decreased （P<0.05）. Conclusion 6-Gingerol， a ginger extract， can promote wound healing in rats with oral ulcer， possibly through activating PKB/KIF14 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

6-姜酚（生姜提取物） / 口腔溃疡 / 蛋白激酶B/驱动蛋白家族成员14信号通路

Key words

6-gingerol （a ginger extract） / oral ulcer / PKB/KIF14 signaling pathway

口腔溃疡是常见的口腔黏膜疾病，目前尚不明确其发病具体机制。研究表明，6-姜酚（生姜提取物）可促进皮肤创面生长因子表达，从而加快创面愈合过程^［1］。6-姜酚通过阻滞细胞周期诱导胃癌HGC-27细胞凋亡，从而发挥抗癌作用^［2］。6-姜酚具有预防癌症、抗炎、抗氧化、改善胃动力障碍等多种药理作用^［3-4］。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路在调节细胞周期中发挥重要作用，与细胞增殖、分化密切相关，驱动蛋白家族成员14（kinesin family member 14，KIF14）为此通路的下游蛋白，PKB磷酸化可诱导KIF14表达增高^［5］。研究发现PI3K/Akt信号通路参与复发性口腔溃疡^［6］。本研究旨在探讨6-姜酚是否能通过调节PI3K/PKB/KIF14促进口腔溃疡创面愈合。

1 仪器与材料

1.1 仪器

酶标仪（美国BD公司）；IX71倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

6-姜酚（质量分数>95%，美国Sigma公司）；冰醋酸（天津新通精细化工有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-1β 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）和基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）引物序列均购自广州锐博生物科技有限公司；PI3K抑制剂LY294002（美国Santa Cruz公司）；兔抗鼠PI3K、p-PI3K、PKB、p-PKB和KIF14抗体均购自美国Abcam公司。

1.3 动物

健康清洁级雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量为300~320 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2019-0009。

2 方法

2.1 造模与分组

将50只大鼠随机分为正常组、模型组、6-姜酚组、LY294002组和LY294002联合6-姜酚组，每组10只。除正常组外，其余各组大鼠腹腔麻醉，固定于鼠板上，将直径为3 mm的冰醋酸滤纸片放置于大鼠两侧颊黏膜处1 min，24 h后大鼠左侧颊黏膜处形成圆形白色损伤面，即为烧灼成功。从第2天开始，6-姜酚组大鼠尾静脉注射6-姜酚6 mg·kg^-1，LY294002组大鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg·kg^-1，LY294002联合6-姜酚组大鼠尾静脉注射LY294002 0.3 mg·kg^-1 30 min后，尾静脉注射6-姜酚6 mg·kg^-1，每日1次，连续7 d，正常组和模型组大鼠尾静脉注射生理盐水^［7］。第7天末次给药后，用游标卡尺测量溃疡直径并计算溃疡面积。

2.2 HE染色

颈椎脱臼法处死大鼠，切取左侧溃疡组织，并分成2份，将其中1份置于-20 ℃保存。另1份用多聚甲醛固定，脱水，包埋，制成石蜡切片，根据HE试剂盒的说明书进行染色，观察溃疡组织病理变化。

2.3 ELISA

将-20 ℃保存的溃疡组织取出，研磨，离心，取上清液。稀释标准品，酶标板设置空白孔、标准孔和样品孔，标准孔加入稀释后的标准品50 μL，样品孔加入稀释液40 μL后再加入样品10 μL，37 ℃水浴锅孵育，洗涤，拍干，除空白孔外，其余孔加入HRP标记的链霉亲和素50 μL，再加入四甲基联苯胺50 μL，在450 nm波长处测定吸光度（A）值，根据标准曲线，计算样品体积浓度。

2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

切取大鼠右侧溃疡组织100 mg，加入Trizol试剂1 mL 提取组织中的总RNA，取总RNA 5 μg置于无核酶离心管中，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，以得到的cDNA为模板，加入引物序列，Taq酶和SYBR荧光染料，进行实时荧光定量PCR。反应条件为：95 ℃预变性3 min，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，循环40次。用2^-△△CT法计算MMP-2和MMP-9 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

2.5 蛋白印迹法（Western blotting）

切取大鼠右侧溃疡组织100 mg，剪碎，匀浆，裂解，离心，收集上清液，根据BCA试剂盒说明书测定蛋白质量浓度，煮沸变性。蛋白样品上样20 μL，恒压120 V电泳2 h，0.3 A恒流湿转2 h，TBST洗膜，封闭，p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB和KIF14抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗膜，ECL法显色，Image J分析灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2.6 统计学方法

用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料均以（\overline{x}±s）表示，多样本计量资料比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 溃疡面积计算结果

溃疡面积组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，6-姜酚组大鼠溃疡面积减小，LY294002组溃疡面积增大（P<0.05）；与LY294002联合6-姜酚组比较，6-姜酚组大鼠溃疡面积减小，LY294002组大鼠溃疡面积增大（P<0.05）。见表2。

3.2 HE染色结果

正常组黏膜上皮完全覆盖，固有层清晰，未见炎性细胞浸润；模型组大量炎性细胞浸润黏膜上皮，细胞坏死、脱落，无新生成纤维细胞；6-姜酚组黏膜上皮覆盖，溃疡趋于愈合；LY294002组大量炎性细胞浸润，上皮结构被破坏，黏膜上皮细胞脱落、坏死；LY2940026联合6-姜酚组炎性细胞浸润减少，病变较6-姜酚组减轻。见图1。

3.3 ELISA检测结果

各组IL-6、TNF-α和IL-1β水平比较差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较，模型组IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高（P<0.05）；与模型组比较，6-姜酚组IL-6、TNF-α和IL-1β水平降低，LY294002组IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高（P<0.05）；与LY294002联合6-姜酚组比较，6-姜酚组IL-6、TNF-α和IL-1β水平降低，LY294002组IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高（P<0.05）。见表3。

3.4 qRT-PCR检测结果

各组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较，模型组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量升高（P<0.05）；与模型组比较，6-姜酚组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量降低，LY294002组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量升高（P<0.05）；与LY294002联合6-姜酚组比较，6-姜酚组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量降低，LY294002组MMP-2和MMP-9 mRNA相对表达量升高（P<0.05）。见表4。

3.5 Western blotting检测结果

各组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较，模型组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量降低（P<0.05）；与模型组比较，6-姜酚组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量升高，LY294002组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量降低（P<0.05）；与LY294002联合6-姜酚组比较，6-姜酚组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量升高，LY294002组p-PI3K、p-PKB以及KIF14相对表达量降低（P<0.05）。PI3K和PKB蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表5、图2。

4 讨论

口腔溃疡常不定期或是周期性地出现在口腔黏膜任何部位，孤立或多发性出现，其发病机制复杂，包括免疫功能失常、维生素缺乏、内分泌失调以及代谢障碍等，多数学者认为T淋巴细胞失衡导致的炎症反应和免疫功能紊乱是导致口腔溃疡发生的主要因素。

6-姜酚具有清热解毒、抗炎抗氧化等生物活性。SHENG Y等^［8］研究发现，6-姜酚可减轻葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的炎症反应，减轻结肠组织病理损伤。SONG S等^［9］研究表明，6-姜酚可降低炎症因子表达，改善高脂饮食加链脲佐菌素引起的糖尿病肾脏损伤。本研究以冰醋酸烧灼法建立口腔溃疡大鼠模型，给予6-姜酚治疗，结果显示，模型组大量炎性细胞浸润黏膜上皮，细胞坏死、脱落，无新生成纤维细胞；6-姜酚组黏膜上皮覆盖，溃疡趋于愈合；LY294002组大量炎性细胞浸润，上皮结构被破坏，黏膜上皮细胞脱落坏死；LY294002联合6-姜酚组炎性细胞浸润减少，病变较6-姜酚组减轻，且6-姜酚治疗后溃疡面积减小。炎症反应参与溃疡性疾病的形成过程，IL-6由单核巨噬细胞产生，当机体受到外界刺激时，IL-6具有广泛促炎作用^［10］。研究表明，口腔溃疡患者血清炎症因子明显升高^［11］。发生溃疡性结肠炎时IL-6和TNF-α等促炎因子表达水平显著上升^［12-13］。本研究中模型组大鼠炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平显著升高，6-姜酚组大鼠炎症因子水平降低。MMPs参与多种生理过程，如胚胎发育、伤口愈合、溃疡以及肿瘤细胞侵袭和转移等，MMP-2和MMP-9主要降解Ⅳ型胶原和层黏连蛋白，作为屏障起到阻止炎症细胞浸润和炎症扩散的作用，研究发现MMP-2和MMP-9与溃疡性疾病的发生有关^［14-15］。本研究中模型组大鼠MMP-2和MMP-9的表达水平升高，表明发生溃疡时，炎症细胞浸润使基质金属蛋白酶增加，进一步促进和释放炎症介质，用6-姜酚治疗后MMP-2和MMP-9的表达水平降低。以上结果表明，6-姜酚可降低口腔溃疡大鼠炎症因子表达，促进溃疡面积愈合。

PI3K/Akt信号通路在细胞的增殖分化过程中具有重要作用^［16］，研究报道，鹿茸多肽-脂肪干细胞微球可促进慢性皮肤溃疡小鼠创面愈合，其主要通过激活PI3K/Akt信号通路降低炎症反应，促进脂肪干细胞增殖分化以及血管形成发挥作用^［17］。谷氨酰胺治疗可改善葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎，主要是通过激活PI3K/Akt信号通路降低氧化应激反应发挥作用^［18］。KIF14是PI3K/Akt信号通路的下游靶蛋白，KIF14是一种微管运动蛋白，通过与分裂蛋白调节酶1 相互作用靶向中心纺锤体，进而促进细胞质分裂，此外通过调节细胞周期发挥促进细胞生长作用^［19］。而研究报道，PI3K/Akt信号通路激活可上调KIF14的表达^［20］。本研究通过PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K/Akt信号通路后，探讨6-姜酚是否能通过激活该信号通路改善口腔溃疡。结果表明，与LY294002组比较，LY294002联合6-姜酚组大鼠p-PI3K、p-Akt和KIF14蛋白表达升高。表明6-姜酚可激活PI3K/Akt/KIF14信号通路。

综上所述，6-姜酚可改善冰醋酸诱导的口腔溃疡，其可能是通过激活PI3K/Akt/KIF14信号通路降低炎症反应发挥作用，可为临床治疗口腔溃疡提供理论依据。

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基金资助

河南省医学科技攻关计划项目(LHCJ20191151)