茯苓多糖对自身免疫性炎性肌病大鼠的作用

Effect of Poria cocos polysaccharides on autoimmune inflammatory myopathy in rats

摘要

目的 探讨茯苓多糖（Poria cocos polysaccharide，PCP）对自身免疫性炎性肌病（autoimmune inflammatory myopathy，IIM）大鼠免疫系统的影响及其可能的作用机制。 方法 将造模成功的40只IIM模型大鼠随机分为模型组及PCP低、中、高剂量组，各10只，另设对照组10只。PCP低、中、高剂量组大鼠分别灌胃75、150、300 mg·kg^-1 PCP溶液（用蒸馏水配制），对照组及模型组给予等量蒸馏水。观察各组大鼠一般情况并记录体质量；观察各组大鼠肌电图变化；用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平；称取各组大鼠脾脏、胸腺质量并计算脾脏指数、胸腺指数；用HE染色观察骨骼肌病理学变化；评定大鼠骨骼肌病理损伤情况；用反转录∙聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白印迹法（Western blotting）分别检测大鼠骨骼肌干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF-3）、干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7，IRF-7）mRNA和蛋白表达情况。 结果 与模型组比较，PCP低剂量组、PCP中剂量组和PCP高剂量组大鼠体质量、运动单位时限、波幅、脾脏指数、胸腺指数、IRF-3与IRF-7 mRNA和蛋白表达水平升高，多项波、CK、LDH、AST和骨骼肌病理评分降低（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中剂量组和PCP高剂量组大鼠体质量、运动单位时限、波幅、脾脏指数、胸腺指数、IRF-3与IRF-7 mRNA和蛋白表达水平升高，多项波、CK、LDH、AST和骨骼肌病理评分均降低（P<0.05），高剂量组诸项指数水平变化比中剂量组更显著（P<0.05）。 结论 PCP能够调节IIM大鼠免疫功能，改善大鼠肌损伤，可能是通过激活IRF-3、IRF-7表达发挥作用的。

Abstract

Objective To investigate the effect of Poria cocos polysaccharide （PCP） on the immune system of autoimmune inflammatory myopathy （IIM） of rats and its possible mechanism. Methods A total of 40 IIM model rats were randomly divided into model group， PCP low-dose， PCP medium-dose and PCP high-dose groups， 10 rats in each group， and also a control group （10 rats） was set up. Rats in low， medium and high dosage of PCP groups were administered by gavage with 75， 150 and 300 mg·kg^-1 PCP solution （prepared with distilled water）， and the control group and model group were given the same amount of distilled water. The general conditions of rats in each group were observed and their body mass was recorded. The changes of electromyography were observed. The levels of serum creatine kinase （CK）， lactate dehydrogenase （LDH） and aspartate aminotransferase （AST） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The weights of spleen and thymus of rats in each group were weighed， and the spleen index and thymus index were calculated. The pathological changes of skeletal muscle were observed by HE staining. The pathological injury of rat skeletal muscle was evaluated. The mRNA and protein expressions of interferon regulatory factor 3 （IRF-3） and interferon regulatory factor 7 （IRF-7） in rat skeletal muscle were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blotting. Results Compared with the model group， the body mass， exercise unit time limit， wave amplitude， spleen index， thymus index， IRF-3 and IRF-7 mRNA and protein expression levels were increased， and the pathological scores of multiple waves， CK， LDH， AST and skeletal muscle of rats in low， medium and high dosage of PCP groups were decreased （P<0.05）. Compared with the low dose of PCP group， the body mass， exercise unit time limit， wave amplitude， spleen index， thymus index， IRF-3 and IRF-7 mRNA and protein expression levels were increased， and the pathological scores of multiple waves， CK， LDH， AST and skeletal muscle of rats in medium and high dose of PCP groups were decreased （P<0.05）. The changes of various indexes in the high dose group were more significant than those in the medium dose group （P<0.05）. Conclusion PCP can regulate immune function and improve muscle injury in IIM rats， which may play a role by activating the expression of IRF-3 and IRF-7.

Graphical abstract

关键词

茯苓多糖 / 自身免疫性炎性肌病 / 干扰素调节因子3 / 干扰素调节因子7 / 免疫系统

Key words

Poria cocos polysaccharide / autoimmune inflammatory myopathy / interferon regulatory factor 3 / interferon regulatory factor 7 / immune system

自身免疫性炎性肌病（immune inflammatory myo⁃pathy， IIM）是一类以骨骼肌损伤为主的异质性免疫疾病，其2种常见的临床类型分别为皮肌炎（dermatomyositis， DM）和多发性肌炎（polymyositis， PM），约占70%^［1］。IIM的临床表现多为肌无力、肌痛等肌肉损伤，还伴有心脏、肺等脏器受累^［2］。茯苓的主要活性物质包括茯苓多糖（poria cocos polysaccharide， PCP）、三萜类化合物等，其中PCP约占75%，分为水溶性多糖与碱溶性多糖2类^［3］。PCP具有抗癌、抗菌和提高机体免疫力等作用^［4］。PCP能有效治疗免疫低下，调节免疫系统，治疗免疫疾病^［5］。本研究旨在建立IIM大鼠模型，探讨PCP对IIM大鼠免疫系统的影响及其可能的作用机制，为PCP的应用及免疫性肌炎临床治疗提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV2600A型紫外可见光光度计（武汉华威科创科技有限公司）；MK2肌电图仪（丹麦丹迪公司）。

1.2 试药

PCP（质量分数为80%，批号S25272，上海源叶生物有限公司）；弗氏完全佐剂（complete freund’s adjuvant， CFA，批号344289-1SET，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；肌酸激酶（creatine kinase， CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase， AST）ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；兔抗β-actin多克隆抗体、干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3， IRF-3）、干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7， IRF-7）多克隆抗体和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G（immunoglobulin，IgG）均购自深圳海思安生物技术有限公司。

1.3 实验动物

7周龄SPF级雌性Lewis大鼠55只，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，合格证号为SCXK（京）2019-0011，体质量为180~220 g。SPF级雌性新西兰兔1只，购自北京隆安实验动物养殖中心，合格证号为SCXK（京）2019-0006，体质量为4.21 kg。大鼠饲养于相同环境7 d（温度为22~24 ℃，相对湿度为55%~65 %），自由饮水和摄食，定期更换垫料，保持良好通风。

2 方法

2.1 IIM大鼠模型的建立

将新西兰兔腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，固定于手术台上，分离新鲜兔骨骼肌，冰浴条件下剔除骨骼肌内神经与筋膜等组织，用预冷的PBS缓冲液冲洗，剪碎加入RIPA裂解液，BCA蛋白定量法检测蛋白质量浓度，制备成20 mg·kg^-1骨骼肌匀浆蛋白，与CFA按1∶1混合充分乳化后使用。45只造模大鼠背部皮下注射兔骨骼肌匀浆蛋白10 mg·kg^-1，每周1次，连续注射4周。另外10只大鼠给予等量生理盐水与CFA混合液，作为对照组。免疫4周后，大鼠出现严重肌无力症状，呼吸困难、肌肉萎缩和行走震颤等临床表现，对照组与造模大鼠各抽取3只检测血清CK水平。与对照组比较，造模大鼠CK水平成倍升高即判定大鼠造模成功^［6］，共造模成功40只。

2.2 分组与给药

将造模成功大鼠随机分为模型组及PCP低、中、高剂量组，各10只。参照文献^［7-8］，PCP低、中、高剂量组分别灌胃75、150、300 mg·kg^－1 PCP溶液（用蒸馏水配制），对照组及模型组于相同时间给予等量蒸馏水。各组给药每日1次，连续给药21 d。

2.3 检测指标

2.3.1 标本采集

各组大鼠给药前和末次给药后称定质量，禁食24 h，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，眼眶取外周血0.5 mL，静置至少30 min，于4 ℃下以3 000 r·min^-1离心15 min，分离血清，-20 ℃保存备用。取血后大鼠脱颈处死，摘取大鼠脾脏和胸腺称取质量，剥离大鼠骨骼肌，剔除骨骼肌周围神经与筋膜，用预冷的生理盐水冲洗组织表面，滤纸吸附多余液体后，剪取部分组织，置于4 g·mL^-1多聚甲醛液中固定24 h，其余骨骼肌组织置于无菌冻存管内，于-80 ℃保存备用。

2.3.2 一般情况观察

给药期间观察并比较各组大鼠精神状态、反应程度和毛色等情况，并于给药前1 d和末次给药后称取各组大鼠体质量。

2.3.3 肌电图变化

于给药前1 d和末次给药后用肌电图仪检测各组大鼠运动单位时限、波幅和多项波等指标。用镊子刺激大鼠足部促使其收缩，将同心圆针电极插入大鼠胫前肌肌腹，肌电图仪扫描速度为5 ms·D^-1，波幅为0.1 mV·D^-1，低频滤波为20 Hz，高频滤波为10 kHz，检测各项指标的变化。

2.3.4 血清CK、LDH和AST水平的检测

取出ELISA试剂盒，室温静置30 min，按照说明书操作，用固相夹心法检测大鼠血清中CK、LDH和AST的水平，确定所需板条数，备好复孔，将按照1∶1稀释后的标本50 μL加入反应孔中（各组大鼠血清样本），再加入稀释后的标准品50 μL，立即于各孔加入生物素标记抗体，盖好膜板，振荡均匀使充分反应，37 ℃温育60 min，甩去孔内液体，加入洗涤剂清洗并拍干，重复3次。再加入亲和链酶素HRP 80 μL，37 ℃温育30 min，弃液清洗。依次加入显色液、终止液各50 μL，于450 nm波长处检测各孔吸光度值，计算各指标的水平。

2.3.5 脏器指数的计算

用PBS缓冲液反复冲洗摘取的脾脏和胸腺组织，去除表面血污，滤纸吸干组织表面水分，称取脏器质量并计算脾脏指数、胸腺指数。脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g）；胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）。

2.3.6 骨骼肌组织HE染色

取出多聚甲醛固定后的骨骼肌组织，经脱水、透明后石蜡包埋，制成5 μm厚的切片，切片置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10 min，在无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ，体积分数分别为95%、90%、80%、70%的乙醇及蒸馏水中各浸泡5 min，用苏木素液染色5 min，用自来水冲洗5 min，用盐酸酒精分化10 s，经氨水返蓝后用流水冲洗，用伊红染液染色3 min，用自来水冲洗，再次脱水、透明，用中性树胶封片。于光学显微镜下观察骨骼肌组织病理变化。

2.3.7 骨骼肌病理评分

根据光学显微镜下观察的骨骼肌病理变化情况，按照Kohyama肌肉组织病理学分级标准对骨骼肌病变程度进行分级评定：正常肌纤维组织，未见炎症损伤评定为0级；发现单个或不超过5个肌纤维受损评定为1级；发现超过5个但少于30个肌纤维受损评定为2级；发现肌束整体病变评定为3级；发现不止1个肌束病变，肌肉组织呈弥散性病变评定为4级。评分位于居中级别时可评定0.5分。

2.3.8 IRF-3、IRF-7 mRNA的表达水平

Trizol法提取骨骼肌组织总RNA，检测RNA质量浓度及纯度后。用反转录试剂盒合成cDNA，配制反转录∙聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反应体系（20 μL）：上、下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，RNase free ddH₂O 7.8 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s循环40次。读取样本与内参基因CT值，以2^-△△CT计算各样本基因的相对表达量。引物序列为IRF-3：上游（5’-AACCGGAAAGAAGTGTTGCG-3’），下游（5’-CCCTGGAGTCACAAACTCATAC-3’）；IRF-7：上游（5’-TCCAGTTGATCCGCATAAGGT-3’），下游（5’-CTTCCCTATTTTCCGTGGCTG-3’）；GAPDH：上游（5’-TGACCTCAACTACATGGTC⁃TACA-3’），下游（5’-CTTCCCATTCTCGGCCTT⁃G-3’）。

2.3.9 IRF-3、IRF-7蛋白的表达量

取出骨骼肌组织，用蛋白提取试剂盒提取骨骼肌组织总蛋白，加入RIPA裂解液，冰上裂解40 min，将悬液在4 ℃下以12 000 r min^－1离心5 min，收集上清液，用BCA蛋白质量浓度试剂盒，测定蛋白质量浓度。调整蛋白上样量为40 μL，进行SDS-PAGE凝胶电泳，恒压80 V电泳30 min，恒压120 V电泳90 min。将其全部转移至PDVF膜上，加入脱脂牛奶封闭2 h，再加入1∶1 000稀释一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加入1∶3 000稀释二抗封闭2 h，TBST清洗后滴加ECL显色剂显影，以GAPDH为内参，观察并分析条带上对应蛋白表达量。

2.4 统计学方法

用SPSS 23.0统计学软件分析数据，计量数据以（\overline{x}±s）表示，用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较，LSD-t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 一般情况与体质量的比较

对照组大鼠毛色柔顺光泽，精神状态良好，反应度灵敏，进食基本未受影响。与对照组比较，模型组大鼠毛色杂乱脱落、精神状态不佳、反应迟钝、活动减少，出现肌肉萎缩，前肢屈曲和站立、进食困难。与模型组比较，PCP 3组大鼠毛色正常，精神状态好转，反应程度、进食量均有改善，偶有行走困难，肌肉萎缩情况改善。

与给药前比较，给药后对照组、PCP 3组大鼠体质量均升高（P<0.05）。与对照组比较，模型组大鼠给药后体质量降低（P<0.05）。与模型组比较，PCP 3组大鼠给药后体质量升高（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组大鼠给药后体质量均升高（P<0.05），与PCP中剂量组比较，PCP高剂量组大鼠给药后体质量升高（P<0.05）。见表1。

3.2 肌电图变化的比较

与对照组比较，模型组大鼠运动单位时限、波幅降低，多项波升高（P<0.05）。与模型组比较，PCP 3组大鼠运动单位时限、波幅升高，多项波降低（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中剂量、PCP高剂量组大鼠运动单位时限、波幅升高，多项波降低（P<0.05）。与PCP中剂量组比较，PCP高剂量组大鼠运动单位时限、波幅升高，多项波降低（P<0.05）。见表2。

3.3 血清CK、LDH和AST水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠CK、LDH和AST水平升高（P<0.05）。与模型组比较，PCP3组大鼠CK、LDH和AST水平降低（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组大鼠CK、LDH和AST水平均降低（P<0.05），PCP高剂量组诸项水平变化最显著（P<0.05）。见表3。

3.4 脏器指数的比较

与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数、胸腺指数降低（P<0.05）。与模型组比较，PCP 3组大鼠2项指数升高（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组2项指数均升高（P<0.05），PCP高剂量组2项指数，最高（P<0.05）。见表4。

3.5 骨骼肌组织HE染色结果的比较

对照组大鼠骨骼肌组织结构正常，肌纤维形态正常，细胞结构清晰，无细胞坏死、病变现象，未见炎性浸润现象，染色均匀；模型组大鼠骨骼肌组织肌纤维形态不一，大小、粗细均不相同，整体排列散乱，肌纤维萎缩，可见细胞不同程度的病变、坏死，且存在大量炎性浸润现象，染色不均。PCP 3组大鼠骨骼肌组织肌纤维萎缩现象得到明显改善，肌纤维形态逐渐恢复正常，少量细胞发生病变、坏死，炎性浸润现象也得到改善。见图1。

3.6 骨骼肌病理评分的比较

与对照组比较，模型组大鼠骨骼肌病理评分升高（P<0.05）。与模型组比较，PCP 3组大鼠骨骼肌病理评分降低（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组大鼠骨骼肌病理评分降低（P<0.05），PCP高剂量组评分降低得最明显（P<0.05）。见表5。

3.7 IRF-3、IRF-7 mRNA水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠IRF-3、IRF-7 mRNA的表达水平降低（P<0.05）。与模型组比较，PCP3组大鼠IRF-3、IRF-7 mRNA的表达水平升高（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组大鼠IRF-3、IRF-7 mRNA表达水平升高（P<0.05），PCP高剂量组表达水平最高（P<0.05）。见表6。

3.8 IRF-3、IRF-7蛋白水平的比较

与对照组比较，模型组大鼠IRF-3、IRF-7蛋白表达水平降低（P<0.05）。与模型组比较，PCP 3组大鼠IRF-3、IRF-7蛋白表达水平升高（P<0.05）。与PCP低剂量组比较，PCP中、高剂量组大鼠IRF-3、IRF-7蛋白的表达水平升高（P<0.05），PCP高剂量组表达水平最高（P<0.05）。见表7、图2。

4 讨论

IIM的发病机制至今尚未明确，可能与免疫介导、肌细胞缺氧、炎症反应、血管新生、细胞自噬和凋亡有关^［9］。且IIM每种亚型的预后与免疫治疗反应截然不同，因IIM常引起多处组织器官受累，故并发症复杂，常见肺间质病变、恶性肿瘤心肌损伤等^［10-11］。茯苓是多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾和宁心静气等疗效，是中医临床常用的利水消肿药物^［12］。在细胞免疫中，PCP可增强巨噬细胞吞噬能力，影响小鼠免疫细胞的比例^［13］。PCP还可通过非特异性免疫发挥作用，提高IgG和IgM水平，调节免疫功能^［14］。

本研究选用异种动物骨骼肌成分作为免疫诱导剂已成为建立自身免疫性肌病的经典造模方法，其病程与人类IIM相似，免疫效果较为稳定，也具备操作简单、成本较低等优势^［15］。结果显示，模型组大鼠一般状态较差，出现体质量明显减轻的症状，肌电图检查发现，模型组大鼠运动单位时限、波幅均降低，且多项波升高，表明大鼠肌纤维出现萎缩，大鼠正常活动受到影响。此外，模型组大鼠血清中CK、LDH和AST水平均升高，表明模型组大鼠其他组织器官也出现损伤，因免疫应答系统的紊乱，造成多处器官受累。最后，HE染色结果表明，模型组大鼠肌纤维损伤严重，骨骼肌损伤病理评分升高，表明模型建立成功。在给予PCP干预后均表现出一般状态与体质量恢复，运动单位时限、波幅升高，且多项波降低，血清中CK、LDH和AST水平均呈降低的趋势。观察HE染色切片也发现，肌纤维形态不一的情况得到改善，炎症细胞浸润现象减少。表明PCP在一定程度上可修复IIM大鼠的肌损伤并减少其他器官受累现象的发生。

先天性免疫作为机体抵抗病毒的第一道防线，出现异常时常会引起组织功能障碍，其中转录因子是启动机体免疫反应的关键因子^［16-17］。IRF-3最早发现于病毒感染的细胞中，其作为干扰素产生的主要因子，在免疫应答系统中发挥着重要作用^［18］。在正常生理条件下，IRF-3在细胞质中表达，当受到病原相关分子与损伤相关分子刺激，会发挥其调节T淋巴细胞的作用，减少炎症因子释放^［19］。IRF-7与IRF-3是二聚体，IRF-3以二聚化形式进入细胞核与IRF-7诱导IFN因子释放，同时IFN因子与启动子结合，正反馈促进IRF-7发挥抗病毒与调节适应性免疫反应的作用^［20］。在本研究中，PCP各剂量组大鼠IRF-3、IRF-7 mRNA和蛋白表达水平较模型组均明显升高，结合大鼠脾脏指数、胸腺指数均升高，可见IRF-3、IRF-7高表达可激活免疫应答系统，改善自身免疫性缺陷引起的肌炎，对IIM大鼠肌损伤有抑制作用。

综上所述，PCP可提高IIM大鼠血清CK水平，调节免疫力，改善大鼠肌损伤，可能是通过提高IRF-3、IRF-7表达水平发挥作用的，可为临床治疗IIM提供实验依据。

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基金资助

2021年度河北省医学科学研究课题计划项目(20211293)