丹参酮ⅡA调节骨关节炎小鼠骨代谢的作用机制

Action mechanism of tanshinone ⅡA on regulating bone metabolism in osteoarthritis mice

摘要

目的 探讨丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）通过介导Yes激酶相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）、核因子-κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL） /核因子κB受体活化因子（eceptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）调节骨关节炎小鼠骨代谢的作用机制。 方法 建立骨关节炎小鼠模型，将60只小鼠随机分成假手术组、模型组、Tan ⅡA低剂量组和Tan ⅡA高剂量组，每组15只，造模成功后灌胃给药，连续4周。HE和番红O 固绿染色观察软骨组织病理损伤并进行Mankin评分。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨钙素（osteocalcin，OC）、Ⅰ型胶原交联羧基末端肽（C-telopeptide of type Ⅰ collagen，CTX）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。蛋白质印迹法（Western blotting）检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、YAP、RANK、RANKL和OPG蛋白。 结果 Tan ⅡA可改善小鼠软骨组织病理变化并降低Mankin评分。与假手术组比较，模型组BALP、OC水平下降，CTX、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MMP1、MMP3和MMP13水平升高（P<0.05）。与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组BALP、OC水平升高，CTX、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、MMP1、MMP3和MMP13水平降低（P<0.05）。与假手术组比较，模型组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平下降，RANKL蛋白水平升高（P<0.05）；与模型组比较，Tan ⅡA 2组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平上升，RANKL蛋白水平下降（P<0.05）。 结论 Tan ⅡA可能通过介导YAP、RANK/RANKL/OPG信号通路调控骨关节炎。

Abstract

Objective To explore the action mechanism of tanshinone ⅡA （Tan ⅡA） on regulating bone metabolism in osteoarthritis mice by mediating Yes-associated protein （YAP） and receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL）/receptor activator of nuclear factor-κB （RANK）/osteoprotegerin （OPG）. Methods The osteoarthritis models of mice were prepared. A total of 60 mice were randomly divided into sham operation group， model group， low-dose and high-dose Tan ⅡA groups， 15 cases in each group. After successful modeling， they were given intragastric administration for 4 weeks. The pathological damage of cartilage tissues was observed by HE and Safranin O fast green staining， and Mankin scoring was conducted. The levels of serum bone alkaline phosphatase （BALP）， osteocalcin （OC）， C-telopeptide of type Ⅰ collagen （CTX）， interleukin （IL）-1β， IL-6， IL-8 and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expressions of matrix metalloproteinases （MMPs）， YAP， RANK， RANKL and OPG were detected by Western blotting. Results Tan ⅡA could improve pathological changes of cartilage tissues and decrease Mankin score. Compared with sham operation group， the levels of BALP and OC were decreased in model group， while the levels of CTX， TNF-α， IL-6， IL-1β， IL-8， MMP1， MMP3 and MMP13 were increased （P<0.05）. Compared with model group， the levels of BALP and OC were increased in low-dose and high-dose Tan ⅡA groups， while the levels of CTX， TNF-α， IL-6， IL-1β， IL-8， MMP1， MMP3 and MMP13 were decreased （P<0.05）. Compared with sham operation group， the levels of YAP， OPG and RANK in cartilage tissues were decreased， while the RANKL level was increased in model group （P<0.05）. Compared with model group， the levels of YAP， OPG and RANK in cartilage tissues were increased， while the RANKL level was decreased in low-dose and high-dose Tan ⅡA groups （P<0.05）. Conclusion Tan ⅡA may regulate osteoarthritis by mediating YAP and RANK/RANKL/OPG signaling pathways.

Graphical abstract

关键词

丹参酮ⅡA / 骨关节炎 / Yes激酶相关蛋白 / 核因子-κB受体活化因子配基 / 核因子κB受体活化因子 / 骨保护蛋白

Key words

tanshinone ⅡA / osteoarthritis / Yes-associated protein / receptor activator of nuclear factor-κB ligand / receptor activator of nuclear factor-κB / osteoprotegerin

骨关节炎是一种退行性病变，通常由劳损、关节畸形引起关节软骨退化损伤和软骨峡谷反应性增生^［1］。有研究证实，减少基质金属蛋白酶和一些炎症因子的分泌可抑制骨关节炎的炎症反应^［2-3］。丹参酮ⅡA（Tan ⅡA）是丹参酮的主要活性成分，可抑制软骨细胞炎症及软骨基质降解，改善骨关节炎大鼠病情^［4］。Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）是调控细胞增殖、生长和分化的重要转录因子，可调节下游相关蛋白，影响疾病发展^［5］。核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）可与位于破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）结合，进而激活破骨细胞的分化、成熟，促进骨吸收^［6］。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）是由成骨细胞表达、分泌的RANKL诱导受体，与RANK竞争性地结合RANKL，抑制破骨细胞活化，从而发挥保护骨骼的作用^［7］。研究发现^［8］，RANK/RANKL/OPG信号通路是破骨细胞分化过程中的一个重要信号转导通路，是成骨细胞和破骨细胞之间相互作用，共同调节骨形成的重要途径。本研究用Tan ⅡA作用于骨关节炎模型小鼠，观察Tan ⅡA对小鼠骨代谢的影响，并初步探讨其可能的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

尼康光学显微镜E100（上海普赫生物科技有限公司）；高速离心机（武汉益普生物科技有限公司）。

1.2 试药

丹参酮ⅡA（西安四季生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）蛋白质量浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒均购自北京伊塔生物科技有限公司；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒和RIPA裂解液均购自北京索莱宝生物公司；番红O固绿染液（北京索莱宝科技有限公司）；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（江西艾博因生物科技有限公司）；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、MMP3、MMP13、YAP、RANK、RANKL和OPG多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗均购自上海科敏生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级小鼠60只，雄性，6~8周龄，体质量为18~22 g，购自广东至远生物医药科技有限公司，许可证号为SCXK（粤）2021-0057；在标准环境中饲养，并自由采食、饮水。适应性喂养1周后，用随机数字表法分为假手术组、模型组、Tan ⅡA低剂量组和Tan ⅡA高剂量组，每组15只。

2 方法

2.1 模型建立和给药

除假手术组外，其余组小鼠用10 g·L^-1戊巴比妥钠溶液3 mL·kg^-1经腹腔注射对小鼠进行麻醉，进行固定消毒。无菌环境下于膝关节内侧约1 cm做纵行切口，打开关节腔，切断前交叉韧带，逐层缝合伤口。假手术组进行相同手术，但不进行切断。术中避免损伤关节软骨，术后每日检查伤口，定时给予青霉素肌肉注射防止感染，膝关节不进行固定，保持在正常的饲养环境下，动物可自行活动，自由进食和饮水。术后1周，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠分别灌胃Tan ⅡA 1.0 、2.0 mg·kg^-1，模型组和假手术组灌胃等量9 g·L^-1氯化钠注射液，每日1次，连续处理4周^［9］。

2.2 组织取材

末次灌胃24 h后，经腹腔注射30 g·L^-1戊巴比妥钠溶液3 mL·kg^-1麻醉小鼠。在无菌室中打开膝关节腔，取出关节软骨标本，用40 g·L^-1多聚甲醛固定，备用。

2.3 骨组织HE染色

采集各组小鼠软骨标本，用40 g·L^-1多聚甲醛固定48 h，脱钙用100 g·L^-1EDTA 处理2周，隔天换液，用300 g·L^-1蔗糖溶液沉糖72 h，用常规石蜡包埋切片。用HE染色10 min，用梯度酒精脱水，用二甲苯透明，用中性树脂封胶。将切片置于光学显微镜下观察。

2.4 番红O 固绿染色

将软骨组织常规包埋切片后，用PBS冲洗。加入HE染核1 min，用流水冲洗数分钟，然后将其置于固绿水溶液中染色5 min，用冰醋酸浸泡5 s，吹干，用番红O染液染色5 min，常温下吹干，用二甲苯透明5 min，最后用中性树胶封固。将切片置于光学显微镜下观察。

2.5 Mankin评分

染色完成后于光学显微镜下采集照片，用改良的Mankin评分进行关节软骨破坏的评分，主要依据其表面结构受损程度、细胞数量、染色着色程度、潮线的完整性进行评分^［10］。轻度：0~4分；中度：5~9分；重度：10~14分。

2.6 骨代谢指标的检测

采集各组小鼠眼周静脉血，离心，取上清液，用ELISA检测血清骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨钙素（osteocalcin，OC）和Ⅰ 型胶原交联羧基末端肽（C-telopeptide of type Ⅰ collagen，CTX）。

2.7 血清炎症因子的检测

采集各组小鼠眼周静脉血，离心，取上清液，用ELISA检测血清白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。

2.8 蛋白印迹法（Western blotting）检测相关蛋白的表达水平

用RIPA裂解液提取软骨组织总蛋白。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法将各组蛋白样品定量至相同质量浓度后，取样品蛋白20 μg加入SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，电泳后转至PVDF膜，用脱脂牛奶于室温下封闭1 h。加入用封闭液稀释的抗体（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。次日用PBST洗涤6 min，重复3次，然后加入用封闭液稀释的HRP标记的羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育60 min，PBST洗涤6 min，重复3次，增强化学发光法（electrochemiluminescence，ECL）进行显影，以磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，用BCA蛋白检测试剂检测蛋白的质量浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.9 统计学方法

用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，满足正态分布且方差齐的计量资料用（\overline{x}±s）表示，用单因素方差检验比较多组间差异，计数资料用率表示，比较用χ² 检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Tan ⅡA对小鼠软骨组织病理的影响

假手术组小鼠膝关节软组织表面光滑，软骨细胞排列整齐，软骨细胞结构完整；模型组小鼠软骨表面明显粗糙，软骨层变薄，软骨细胞排列紊乱，细胞结构受到破坏，并存在大量的细胞坏死；Tan ⅡA不同质量浓度组小鼠软骨组织病理均有所改善。见图1。与假手术组比较，模型组小鼠Mankin评分明显升高（P<0.05）；与模型组比较，Tan ⅡA不同剂量组小鼠Mankin评分明显下降（P<0.05）。Tan ⅡA质量浓度越高，Mankin评分下降得越明显。见图3。

3.2 Tan ⅡA对小鼠膝关节组织病变的影响

假手术组小鼠膝关节软组织无明显损伤，细胞排列整齐，番红O 固绿染液染色正常；模型组小鼠软骨组织严重破坏，细胞数量减少，番红O 固绿着色较浅；Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠膝关节软骨组织病理损伤得到缓解，细胞数量明显增加，Tan ⅡA高剂量组改善小鼠膝关节软骨组织病理损伤效果优于Tan ⅡA低剂量组。见图2。与假手术组比较，模型组Mankin评分明显升高（P<0.05）；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组Mankin评分明显下降（P<0.05）。Tan ⅡA高剂量组Mankin评分下降幅度明显大于Tan ⅡA低剂量组。见表1。

3.3 Tan ⅡA对小鼠骨代谢指标的影响

与假手术组比较，模型组小鼠BALP、OC水平明显下降，CTX水平升高（P<0.05）。与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠BALP、OC水平明显升高，CTX水平降低（P<0.05）。Tan ⅡA质量浓度越大，骨代谢指标变化幅度越大。见表2。

3.4 Tan ⅡA对各组小鼠炎性因子的影响

与假手术组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等炎性因子水平明显升高（P<0.05）。与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等炎性因子水平显著下降（P<0.05），高剂量组的变化更显著。见表3。

3.5 Tan ⅡA对小鼠软骨组织MMPs水平的影响

与假手术组比较，模型组小鼠软骨组织中MMP1、MMP3和MMP13蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组MMP1、MMP3和MMP13蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。Tan ⅡA高剂量组MMP1、MMP3和MMP13蛋白表达下降幅度显著高于Tan ⅡA低剂量组。见图3、表4。

3.6 Tan ⅡA 对小鼠软骨组织蛋白水平的影响

与假手术组比较，模型组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平显著下降，RANKL蛋白水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平显著上升，RANKL蛋白水平显著下降（P<0.05）。Tan ⅡA高剂量组小鼠软骨组织中YAP、OPG、RANK和RANKL蛋白水平变化幅度显著大于Tan ⅡA低剂量组。见表5、图4。

4 讨论

本研究结果表明，骨关节炎小鼠软骨组织被严重破坏，Mankin评分明显升高，经Tan ⅡA低剂量、Tan ⅡA高剂量干预后，Mankin评分明显下降，病理损伤明显减轻。骨关节炎的主要病理变化是关节软骨组织损伤，临床表现为关节部位疼痛。既往研究显示^［11］，丹参酮可有效缓解老年四肢骨折患者的疼痛和肿胀程度，加快骨愈合并抑制机体炎症反应，促进康复。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等炎性因子的水平显著升高；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8等炎性因子水平显著下降，表明骨关节炎模型鼠经Tan ⅡA干预后可有效降低血清中炎性因子水平。IL-1β是IL-1最常见的亚型，在正常情况下，其在滑膜细胞及软骨细胞内的含量较少，当关节炎发生时其含量升高，通过一系列信号转导可引起炎症级联反应^［12］。TNF-α是在相关炎症反应中最早出现的炎症因子，通过刺激淋巴细胞、中性粒细胞，进而增加血管内皮细胞的通透性，并能促进其他细胞因子的产生^［13］。IL-1β、TNF-α 两者在OA的发生过程中，能加快软骨的破坏，软基质降解，促进软骨细胞的分化、再生。既往研究结果显示^［14］，Tan ⅡA可降低小鼠体内炎症反应，表明Tan ⅡA可在一定程度上抑制小鼠骨关节炎模型IL-1β、TNF-α水平。本研究还发现，与假手术组比较，模型组小鼠软骨组织中MMP1、MMP3和MMP13蛋白表达水平显著升高；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组MMP1、MMP3和MMP13蛋白表达水平显著下降。MMP1和MMP13大量产生可损害骨关节炎关节结构中细胞外基质，加速破坏软骨组织，进而导致骨关节炎病情加重^［15-16］。炎症细胞因子IL-1β能激活滑膜细胞中MMP-1和MMP-13的产生进而影响关节组织结构和功能^［17］。因此，抑制MMPs产生可缓解骨关节炎病理损伤。本研究结果表明，Tan ⅡA可降低MMPs水平，抑制骨关节炎病情发展。

本研究结果还表明，与假手术组比较，模型组小鼠BALP、OC水平明显下降，CTX水平升高；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠BALP、OC水平显著升高，CTX水平降低。BALP由成骨细胞合成及释放，可提高局部磷酸含量及促进骨基质矿化，可以作为骨形成的特异性指标。CTX敏感性较高，是反映骨形成和骨吸收的指标。OC是非胶原酸性糖蛋白，是一种维生素K依赖性钙结合蛋白，在调节骨钙代谢中起重要作用，可反映骨形成状态，对骨质疏松综合征、钙代谢异常等疾病的诊断有重要价值。既往研究结果显示^［18］，活血补肾壮骨方可升高糖皮质激素性骨质疏松大鼠血清中OC含量。本研究结果表明Tan ⅡA可调节骨关节炎小鼠骨代谢。

本研究结果表明，与假手术组比较，模型组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平显著下降，RANKL蛋白水平显著升高；与模型组比较，Tan ⅡA低剂量组、Tan ⅡA高剂量组小鼠软骨组织中YAP、OPG和RANK蛋白水平显著上升，RANKL蛋白水平显著下降。既往研究显示^［19］，YAP可以通过Wnt/β⁃catenin信号通路调控软骨细胞Sox9的表达。OPG、RANKL和RANK是目前公认的调控骨代谢的重要途径，其为肿瘤坏死因子家族成员，通过作用于破骨细胞，调控骨形成及骨吸收^［20-21］。RANK与RANKL结合后，可通过核因子途径激活破骨细胞分化的信号转导通路，诱活相应激酶，发生一系列酶链反应，激活核因子复合体、活化蛋白-1及转录因子，核因子再次激活破骨细胞前体细胞的核因子复合体，通过一系列反应，使没有功能的破骨细胞转化成有活性的破骨细胞。既往研究结果显示^［22］，益肾蠲痹法含药血清通过调节OPG/RANKL/RANK信号轴可能在抗骨丢失过程中发挥作用。本研究结果表明，Tan ⅡA可通过YAP、RANK/RANKL/OPG途径调控小鼠软骨代谢，影响骨关节炎发展进程。

综上所述，Tan ⅡA可改善小鼠关节组织病理变化，降低炎症反应，影响软骨组织代谢，其可能是通过介导YAP、RANK/RANKL/OPG途径实现的。骨关节炎的发生、发展可能存在多途径，多条信号通路调节，本研究还存在不足之处，未进行其他可能存在的调控途径的分析，如炎症反应调控途径。

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基金资助

2019年度新乡医学院第一附属医院青年培育基金项目(QN-2019-B04)